Методы определения аминокислотного состава белка. Определение аминокислотного состава белков

Содержание Введение 1. Основные компоненты молока 2. Методы анализа аминокислот 1. Хроматографический метод анализа 2. Спектрофотометрический метод анализа 3. Титрометрический метод анализа 4. Электрохимический метод анализа 3.Методы определения аминокислотного состава 1. Определение аминокислот методом тонкослойной хроматографии 3.2. Определение аминокислот спектрофотометрическим методом 4. Обзор реферативных журналов Список использованной литературы Введение Проблема питания является одной из важнейших социальных проблем.

Жизнь человека, его здоровье и труд невозможны без полноценной пищи. Согласно теории сбалансированного питания в рационе человека должны содержаться не только белки, жиры и углеводы в необходимом количестве, но и такие вещества, как незаменимые аминокислоты, витамины, минералы в определенных, выгодных для человека пропорциях.

В организации правильного питания первостепенная роль отводится молочным продуктам. Это в полной мере относится к молоку, питательная ценность которого обусловлена высокой концентрацией в нем молочного белка и жира, наличием незаменимых аминокислот, солей кальция и фосфора, так необходимых для нормального развития организма человека. Легкая усвояемость - одно из наиболее важных свойств молока как продукта питания. Более того, молоко стимулирует усвоение питательных веществ других пищевых продуктов.

Молоко вносит разнообразие в питание, улучшает вкус других продуктов, обладает лечебно-профилактическими свойствами. В молоке содержится более 120 различных компонентов, в том числе 20 аминокислот, 64 жирные кислоты, 40 минеральных веществ, 15 витаминов, десятки ферментов и т.д. Энергетическая ценность 1 л сырого молока составляет 2797 кДж. Один Литр молока удовлетворяет суточную потребность взрослого человека в жире, кальции, фосфоре, на 53% - потребность в белке, на 35% - в витаминах А, С и тиамине, на 26% - в энергии. Основная цель данной курсовой работы – выявить аминокислотный состав молока. 1.

Основные компоненты молока

С физико-химических позиций молоко представляет собой сложную полидисп... 5.1). Наибольший удельный вес в молоке занимает вода (более 85%, на остальны... Сухой остаток включает все питательные вещества молока. Он определяет выход готовой продукции при производстве молочных продук...

Хроматографический метод анализа

Одним из наиболее перспективных методов является метод высокоэффективн... Но преимущества метода значительно перекрывают его недостатки. Кроме того, его можно использовать для завершения химического анализа.... На современных газохроматографических капиллярных колонках в одном экс... Метод характеризуется высокой чувствительностью и позволяет количестве...

Титрометрический метод анализа

Титрометрический метод анализа. Из титриметрических методов количественного определения наиболее широк... Титрование может быть проведено с индикатором (кристаллический фиолето... Однако данный метод имеет ряд существенных недостатков: использование... Для количественного анализа отдельных аминокислот используют также мет...

Электрохимический метод анализа

В последние десятилетия все более широкое распространение получили эле... 3.. в оптимизированных условиях они позволяют определить лишь отдельные ам... Так, разработан способ полярографического определения триптофана, осно... Электрохимический метод анализа.

Методы определения аминокислотного состава

Методы определения аминокислотного состава 3.1.

Определение аминокислот методом тонкослойной хроматографии

В 1 литре дистиллированной воды растворяют 84 г моногидрата лимонной к... 3.2.. Через 10 минут пленку помещают в ХГ камеру с нитратным буфером (буферн... Методика На стартовую линию пластинки наносят 2 (10) мкл гидролизата п... Капли пробы и стандартных аминокислот наносят на стартовую линию на пл...

Определение аминокислот спектрофотометрическим методом

Аминокислоты, первичные амины, полипептиды и пептоны при нагревании с... 0,2 – 3 %-ный раствор нингидрина готовят в разных растворителях (изобу... 2007. к. 2.Цветкова Н.Д.

Что будем делать с полученным материалом:

Если этот материал оказался полезным для Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:

Еще рефераты, курсовые, дипломные работы на эту тему:

Определение энтропии. Определение информационных потерь при передаче сообщений по каналам связи с шумами

Определение сущности БУУ: предмет и метод. Можно дать грубое определение цели УУ: предоставление информации, которая полезна для руководства организации
Буу часть информационной системы предприятия с одной стороны с другой деятельность целями которой является обеспечение информацией руководства.. можно дать грубое определение цели уу предоставление информации которая.. сущность уу заключается в аналитичности информации она собирается группируется идентифицируется и изучается уу..

Данные методические указания предназначены для помощи студентам при выполнении лабораторных работ по описанию и определению минералов и горных пород.. в данных указаниях представлены необходимая терминология и методика описания.. в методических указаниях приведены варианты задания и примеры для выполнения расчетно графических работ по построению..

Имущество предприятия: состав, назначение. Определение потребности в основных и оборотных средствах
Капитал предприятия можно рассматривать с нескольких точек зрения прежде всего целесообразно различать капитал..

Состав преступления позволяет нам отграничить одно от другого.. чтобы обратиться к составу нужно сначала посмотреть основания преступления.. сначала нужно разобраться что такое основания преступления а потом мы увидим что единственное основание это..

Определение энтропии. Определение информационных потерь при передаче сообщений по каналам связи с шумами. Варианты заданий для выполнения
Задание определение энтропии.. сообщение состоит из n символов имеется m типов символов количество букв.. задание определение информационных потерь при передаче сообщений по каналам связи с шумами..

Задания для проведения практических занятий по курсу бухгалтерский учет задание 1. На основании состава имущества оао ростов произвести группировку хозяйственных средств имущества по видам и составу
Учетно экономический факультет.. хахонова н н.. задания для проведения практических занятий..

Основные классы неорганических соединений. Определение молярной массы эквивалентов цинка. Определение теплоты реакции нейтрализации. Скорость химической реакции. Катализ
Введение.. При изучении химии большое значение имеет лабораторный практикум Правильно поставленный эксперимент позволяет..

Интегрированная Среда и Состав языка Object Pascal. Состав языка
Содержание.. Лекция Интегрированная Среда и Состав языка Object Pascal.. Работа с окнами Редактирование в Object Pascal..

Введение в операционные системы. Определение, назначение, состав и функции операционных систем
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования.. тольяттинский государственный университет сервиса..

Для определения аминокислот, входящих в состав белков, применяют кислотный (НС1), щелочной (Ва(ОН) 2) и ферментативный гидролиз. При гидролизе чистого белка, не содержащего примесей, освобождаются 20 различных аминокислот.

Аминокислоты, входящие в состав белков, являются
a-аминокислотами . Все они принадлежат к L-ряду, а величина и знак оптического вращения зависят от природы радикалов аминокислот и значения рН раствора. В белках человека D-аминокислоты не обнаружены, однако они встречаются в клеточной стенке бактерий, в составе некоторых антибиотиков (актиномицинов).

Аминокислоты отличаются друг от друга химической природой радикала R, который не участвует в образовании пептидной связи.

Современная рациональная классификация аминокислот основана на полярности радикалов:

Неполярные (гидрофобные)

Полярные (гидрофильные)

Отрицательно заряженные

В некоторых белках обнаружены производные аминокислот . В белке соединительной ткани коллагене содержатся оксипролин и оксилизин. Дийодтирозин является основой структуры гормонов щитовидной железы.

Аминокислоты обладают общим свойством - амфотерностью (от греч amphoteros - двусторонний). В интервале рН 4,0-9,0 почти все аминокислоты существуют в форме биполяных ионов (цвиттерионов). Значение изоэлектрической точки аминокислоты (ИЭТ, рI) рассчитывается по формуле:

.

Для моноаминодикарбоновых кислот рI рассчитывается как полусумма значений рK (таблица 1) a- и w-карбоксильных групп, для диаминомонокарбоновых кислот – как полусумма значений рK a- и w-аминогрупп.

Существуют заменимые аминокислоты (могут синтезироваться в организме человека), и незаменимые, которые в организме не образуются и должны поступать с пищей.

Незаменимые аминокислоты : валин, лейцин, изолейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан, фенилаланин.

Заменимые аминокислоты: глицин, аланин, аспарагин, аспартат, глутамин, глутамат, пролин, серин.

Условно заменимые (могут синтезироваться в организме из других аминокислот): аргинин (из цитруллина), тирозин (из фенилаланина), цистеин (из серина), гистидин (при участии глутамина).

Для открытия в биологических объектах и количественного определения аминокислот используют реакцию с нингидрином.

Таблица 1. Константы диссоциации аминокислот

Определение аминокислотного состава белков может быть осуществлено различными методами: химическим, хроматографическим, микробиологическим и изотопным. Чаще используются хроматографические методы.

Бумажная хроматография. Бумажная хроматография используется для идентификации компонентов смеси аминокислот с ди- и три-пептидами, получаемой при частичном гидролизе белков и полипептидов.

Гидролиз может быть осуществлен кислотным, щелочным или ферментативным методом. Кислотный метод используется чаще (6 н. HCl, 8 н. H 2 SO 4). Гидролиз проводят при нагревании, иногда при повышенном давлении. Показателями окончания гидролиза могут служить: прекращение нарастания карбоксильных или аминных групп в гидролизате, либо отрицательная биуретовая реакция. Избыток гидролизующего реагента удаляют: серную кислоту осаждают Ca(OH) 2 , соляную кислоту отгоняют в вакууме, а остаток кислоты осаждают нитратом серебра.

Компоненты гидролизата распределяются между водой, адсорбированной на целлюлозе и являющейся неподвижной фазой, и органическим растворителем, подвижной фазой, которая движется вдоль листа вверх или вниз. В качестве подвижной фазы используется смесь бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5). Более липофильные аминокислоты сильнее увлекаются органическим растворителем, более гидрофильные – проявляют большую тенденцию связываться с неподвижной фазой. Гомологические соединения, отличающиеся даже на одно метиленовое звено, движутся с различной скоростью и легко могут быть разделены. По окончании хроматографии бумагу высушивают и обрабатывают проявителем (0,5% раствор нингидрина в смеси ацетон-ледяная уксусная кислота-вода) и нагревают в течение нескольких минут. Аминокислоты проявляются в виде окрашенных пятен. Подвижность – постоянная величина, характерная для каждого соединения возрастает с увеличением молекулярной массы. Для аминокислот с неразветвленной цепью величина подвижности несколько больше, чем для соответствующих изомеров. Введение в молекулу полярных групп снижает подвижность соединения. Аминокислоты с объемными неполярными боковыми цепями (лейцин, изолейцин, фенилаланин, триптофан и др.) перемещаются быстрее, чем аминокислоты с более короткими неполярными боковыми цепями (пролин, аланин, глицин) или с полярными боковыми цепями (треонин, аргини, цистеин, гистидин, лизин). Это обусловлено большей растворимостью полярных молекул в гидрофильной стационарной фазе и неполярных – в органических растворителях.

Бумажная хроматография может быть использована для количественной оценки содержания аминокислот. Каждое пятно вырезают и элюируют подходящим растворителем; затем проводят количественный колориметрический (нингидриновый) анализ. В другом варианте бумагу опрыскивают нингидрином и измеряют с помощью фотометра интенсивность окрашивания пятна в отраженном или проходящем свете. При полуколичественной оценке содержание аминокислот оценивают по площади пятен на хроматограмме, которые пропорциональны концентрациям аминокислот в разделяемой смеси.

Тонкослойная хроматография. Для разделения и определения аминокислот может быть также использована тонкослойная хроматография. ТСХ, как известно, существует в двух вариантах. Распределительная ТСХ сходна с распределительной на бумаге и адсорбционная ТСХ, основана совершенно на других принципах.

При проведении РТСХ на порошке целлюлозы или других относительно инертных носителях можно использовать такие же системы растворителей и такие же проявляющие реагенты, как и при хроматографии на бумаге.

Разделение с помощью АТСХ определяется способностью растворителя (этот растворитель не обязательно является бинарной или более сложной смесью) элюировать компоненты образца с места его адсорбции на активированном сорбенте. Например, на нагретом силикагеле. АТСХ применима для разделения таких неполярных соединений, как липиды, но не для разделения аминокислот и большинства пептидов. Для разделения аминокислот используют РТСХ, которая позволяет достаточно быстро разделять и определять 22 аминокислоты белковых гидролизатов.

Аминокислоты в белковом гидролизате могут быть определены также методом газовой хроматографии, но перед хроматографическим анализом аминокислоты как правило переводят в летучие соединения.

Взаимодействие с нингидрином. Образуются соответствующие альдегиды.

Таким образом, получают смесь альдегидов и анализируют ее. Это простейший случай, пригоден лишь для некоторых аминокислот.

Переводят аминоксилоты в летучие эфиры (алкильные эфиры, метильные эфиры оксикислот, метиловые эфиры хлорзамещенных кислот и др.).

Выбор производных зависит от исследуемой смеси аминокислот.

Ионообменная хроматография . В настоящее время аминокислотный состав пищевых продуктов определяется исключительно с помощью автоматической ионообменной хроматографии.

В методе Мура и Штейна используют короткую и длинную колонки, заполненные смолой из сульфонированного полистирола в Na + – форме. Когда кислотный гидролизат при рН = 2 наносят на колонку, аминокислоты связываются в результате катионного обмена с ионами натрия. Далее колонку элюируют раствором цитрата натрия при заранее запрограммированных значениях рН и температуры. Короткую колонку элюируют одним буфером, длинную – двумя. Элюат обрабатывают нингидрином, измеряя интенсивность окраски с помощью проточного колориметра. Данные автоматически регистрируются на ленте самописца и могут передаваться в компьютер для вычисления площади под пиком.

Высоковольтный электрофорез на инертных носителях . В биохимии широкое применение нашло разделение аминокислот, полипептидов и других амфолитов (молекул, суммарный заряд которых зависит от рН среды) под действием наложенного постоянного электрического поля. Это метод высоковольтного электрофореза на инертных носителях. При разделении аминокислот в качестве инертных носителей чаще всего используют полоски бумаги или тонкие слои целлюлозного порошка. Разделение проводят в течение 0,5–2 ч при напряжении 2000–5000 В в зависимости от суммарных зарядов амфолитов и их молекулярных масс. Среди молекул, несущих одинаковый заряд, более легкие мигрируют быстрее. Но более важным параметром при разделении является суммарный заряд. Метод применяется для разделения аминокислот, низкомолекулярных пептидов, некоторых белков, нуклеотидов. Образец помещают на носитель, смачивают буфером при соответствующем рН и соединяют с буферным резервуаром полоской фильтровальной бумаги. Бумагу прикрывают стеклянной пластинкой или погружают в углеводородный растворитель для охлаждения. В электрическом поле молекулы, несущие при данном рН отрицательный заряд, мигрируют к аноду, а те, которые несут положительный заряд, – к катоду. Далее высушенную электрофореграмму «проявляют» нингидрином (при работе с аминокислотами, пептидами) или измеряют поглощение в УФ-свете (при работе с нуклеотидами).

Выбор рН определяется значениями рК диссоциирующих групп, входящих в состав молекул смеси. При рН 6,4 глутамат и аспарат несут заряд –1 и движутся к аноду; разделение их осуществляется благодаря различию в молекулярной массе. Лизин, аргинин и гистидин движутся в противоположном направлении, а все другие аминокислоты, входящие в состав белка, остаются вблизи места нанесения. При разделении пептидов, образовавшихся в результате ферментативного расщепления, уменьшение рН до 3,5 приводит к увеличению заряда катионных групп и обеспечивает лучшее разделение.

Методы бумажной, тонкослойной хроматографии, микробиологические, газохроматографические и ряд других, в настоящее время практически не используются вследствие худшей воспроизводимости и большой длительности. Современные хроматографы позволяют определять аминокислотный состав смеси, содержащей лишь 10 –7 –10 –9 моль каждого компонента с воспроизводимостью до 5% за 2–4 часа.

Анализ аминокислотного состава включает полный гидролиз исследуемого белка или пептида и количественное определение всех аминокислот в гидролизате. Поскольку при нейтральных рН пептидные связи стабильны, применяют кислотный или щелочной катализ. Ферментативный катализ для полного гидролиза менее пригоден. Полный гидролиз белка на составляющие аминокислоты неизбежно сопровождается частичной потерей некоторых аминокислотных остатков. Для гидролиза обычно используется 6 н. водный раствор соляной кислоты (110ºС), в вакуумированной ампуле. Количественное определение аминокислот в гидролизате проводят с помощью аминокислотного анализатора. В большинстве таких анализаторов смесь аминокислот разделяют на сульфокатионитах, а детектирование осуществляют спектрофотометрически по реакции с нингидрином или флуориметрически с о -фталевым диальдегидом.

Однако данные по аминокислотному составу однотипных продуктов, полученные в разных лабораториях по отдельным аминокислотам, иногда различаются до 50%.

Эти различия обусловлены не только сортовыми, видовыми или технологическими различиями, а главным образом условием проведения гидролиза пищевого продукта. При стандартном кислотном гидролизе (6 н. HСl, 110–120ºС, 22–24 часа) происходит частичное разрушение некоторых аминокислот, в том числе треонина, серина (на 10–15% и тем больше, чем дольше проводится гидролиз) и особенно метионина (30–60%) и цистина 56–60%, а также практически полное разрушение триптофана и цистеина. Этот процесс усиливается в присутствии больших количеств углеводов в продукте. Для количественного определения метионина и цистина рекомендуется проводить предварительное их окисление надмуравьиной кислотой. При этом цистин превращается в цистеиновую кислоту, а метионин в метионин-сульфон, которые весьма устойчивы при последующем кислотном гидролизе.

Цистин Цистеиновая кислота

Трудной задачей в аминокислотном анализе является определение триптофана. Как уже говорилось, при кислотном гидролизе происходит почти полное его разрушение (до 90%). Поэтому для определения триптофана проводят один из вариантов щелочного гидролиза 2 н. NaOH, 100ºС, 16–18 часов в присутствии 5% хлорида олова или 2 н. гидроокиси бария, при которых он разрушается незначительно (до 10%). Минимальное разрушение происходит в присутствии тиогликолевой кислоты и предварительно гидролизованного крахмала. (При щелочном гидролизе происходит разрушение серина, треонина, аргинина и цистеина). Гидролизат после нейтрализации смесью лимонной и соляной кислот немедленно (во избежание студнеобразования) анализируют на аминокислотном анализаторе. Что касается многочисленных химических методов определения триптофана, то они, как правило, в пищевых продуктах плохо воспроизводимы и поэтому их использовать не рекомендуется.

Для мясных продуктов дополнительной необходимой аминокислотой является оксипролин, который характеризует количество соединительных тканных белков в мясе. Его можно определять ионообменной хроматографией с помощью автоматических анализаторов или химическим колориметрическим методом. Метод основан на нейтрализации кислотного гидролизата до рН 6,0, последующем окислении оксипролина с помощью 1,4% раствора хлорамина Т (или хлорамина Б) в смеси пропилового спирта и буфера, колориметрическом определении при 533 нм продуктов окисления оксипролина после реакции с 10%-ным раствором пара-диметиламинобензальдегида в смеси хлорной кислоты и пропилового спирта (1:2).

В связи с тем, что тирозин, фенилаланин и пролин в присутствии кислорода могут частично окисляться, стандартный кислотный гидролиз рекомендуется проводить в атмосфере азота. Ряд аминокислот, в том числе лейцин, изолейцин и валин, требуют для своего полного выделения из белков более длительного кислотного гидролиза – до 72 ч. В биохимии при анализе белков гидролизуют параллельные пробы в течение 24, 48, 72 и 96 ч.

Для точного количественного определения всех аминокислот требуется проводить 5 различных гидролизов, что весьма удлиняет определение. Обычно же проводят 1–2 гидролиза (стандартный с соляной кислотой и с предварительным оксилением надмуравьиной кислотой).

Во избежание потерь аминокислот удаление избытка кислоты при кислотном гидролизе следует проводить немедленно многократным выпариванием в вакуум-эксикаторе с добавлением дистиллированной воды.

При правильной работе анализатора ионообменные колонки работают без замены смолы довольно долго. Однако, если образцы содержат заметные количества красящих веществ и липидов, то колонка быстро забивается и для восстановления ее разделительных способностей требуется многократная регенерация, иногда с перенабивкой колонки. Поэтому, для продуктов, содержащих более 5% жира, рекомендуется предварительно удалять липиды экстракцией. В таблице 2.3 приведены условия пробоподготовки основных пищевых продуктов при анализе аминокислотного состава.

Таблица 2.3. – Условия подготовки проб пищевых продуктов к анализу

Контрольные вопросы:

1. Дайте определение понятию «белки».

2. На какие группы делят белки по их функциям в организме?

3. Какова роль белков в питании человека?

6. Какие незаменимые аминокислоты вы знаете и какие аминокислоты могут стать незаменимыми?

7. Как определяют содержание общего азота в продуктах питания?

8. Как определяют аминокислотный состав белков?

9. Какие методы определения аминокислот вы знаете?

§ 2.4. Углеводы

Углеводы широко представлены в растениях и животных, где они выполняют как структурные, так и метаболические функции. В растениях в процессе фотосинтеза из углекислого газа и воды синтезируется глюкоза, которая далее запасается в виде крахмала или превращается в целлюлозу – структурную основу растений. Животные способны синтезировать ряд углеводов из жиров и белков, но большая часть углеводов поступает с пищей растительного происхождения.

Синтез белка происходит на рибосомах в виде первичной структуры, т.е. расположенных в определенном количестве и определенной последовательности аминокислот, соединенных пептидными связями, образованными карбоксильной и α-аминогруппами соседних аминокислотных остатков Пептидная связь - жесткая, ковалентная, генетически детерминированная.В структурных формулах изображается в виде одинарной связи: ,однако на самом деле эта связь между углеродом и азотом носит характер частично двойной связи:

Вокруг нее вращение невозможно и все четыре атома лежат в одной плоскости, т.е. компланарны. Вращение же других связей вокруг полипептидного остова достаточно свободно.

Первичная структура открыта в 1898 году профессором казанского университета Данилевским. В 1913 году Эмилем Фишером были синтезированы первые пептиды.

Такая последовательность аминокислот является уникальной для каждого белка и закреплена генетически. При нарушении процесса синтеза первичной структуры белка на рибосоме могут развиваться различные гететические заболевания. Например, при нарушении двух аминокислот в гемоглобине развивается серповидноклеточная анемия.

Для изучения аминокислотного состава белков пользуются сочетанием (или одним из них) кислотного (НСl), щелочного (Ва(ОН)2) и реже ферментативного гидролиза. Установлено, что при гидролизе чистого белка, не содержащею примесей, освобождается 20 различных а-аминокислот. Все другие открытые в тканях животных, растений и микроорганизмов аминокислоты (более 300) существуют в природе в свободном состоянии или в виде коротких пептидов или комплексов с другими органическими веществами.

α-аминокислоты представляют собой производные карбоновых кислот, у которых один водородный атом, у α -углерода, замещен на аминогруппу (-NH2), например: следует подчеркнуть, что все аминокислоты, входящие в состав природных белков являются а-аминокислотами, хотя аминогруппа в свободных аминикарбоновых кислотах может находиться, как увидим ниже, в β, γ, δ, ε -положениях.

9. Вторичная структура белков - α-спирали и β-структуры. Строение и функциональная роль доменов.

Вторичная структура - это пространственное расположение полипептидной цепочки в виде α-спирали или β-складчатости безотносительно к типам боковых радикалов и их конформации. Она стабилизирована водородными связями, которые замыкаются между пептидными, амидными (-N-H) и карбонидными (-C=O) группами, т.е. входят в пептидную единицу, и дисульфидными мостиками между остатками цистеина

Полинг и Кори предложили модель вторичной структуры белка в виде левозакрученной α-спирали, в которой водородные связи замыкаются между каждой первой и четвертой аминокислотой, что позволяет сохранять нативную структуру белка, осуществление им простейших функций, защищать от разрушения. На один виток спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка, шаг спирали составляет 0,54 нм. В образовании водородных связей принимают участие все пептидные группы, что обеспечивает максимальную стабильность, снижает гидрофильность и увеличивает гидрофобность белковой молекулы. Альфа-спираль образуется самопроизвольно и является наиболее устойчивой конформацией, отвечающей минимуму свободной энергии

Полинг и Кори предложили и другую упорядоченную структуру - складчатый β-слой. В отличие от конденсированной α-спирали β- слои почти полностью вытянуты и могут располагаться как параллельно, так и антипараллельно

В стабилизации данных структур также принимают участие дисульфидные мостики и водородные связи.

Супервторичная структура - это более высокий уровень организации белковой молекулы, представленный ансамблем взаимодействующих между собой вторичных структур: α-спираль - два антипараллельных участка, взаимодействуют гидрофобными комплементарными поверхностями (по принципу впадина-выступ) αсα, сверхспирализация α-спирали, (βхβ)-элементы в глобулярных белках, представленные двумя параллельными β-цепями, связанные сегментом х, βαβαβ-элементы, представленные двумя сегментами α-спирали, вставленными между тремя параллельными β-цепями.

Можно выделить следующие этапы выяснения первичной структуры белков и пептидов:

1. Выделение белка в чистом виде и определение его молекулярной массы

2. Определение аминокислотного состава

3. Определение N-концевой аминокислоты

4. Определение С-концевой аминокислоты

5. Определение аминокислотной последовательности

Выделение белка в чистом виде. Как правило, исходный материал содержит много различных белков. В связи с этим возникает проблема выделения из этой смеси интересующего белка в чистом виде. При очистке белков используются методы, которые основаны на разнице:

1. Поверхностного заряда белков

2. Молекулярного размера белков (зависящего от их молекулярной массы)

3. Биологической активности вследствие связывания с субстратами или ингибиторами

Разделение белков по разнице величины поверхностного заряда. Суммарный поверхностный электрический заряд белка при данном значении рН может быть отрицательным, нейтральным или положительным. Для разделения белков с различным зарядом, подобно тому, как это было в случае аминокислот, может быть использован метод ионообменной хроматографии (см. выше). Концентрацию белка в пробирках с элюатом определяют с помощью спектрофотометра по интенсивности поглощения ультрафиолетового света и строят графическую зависимость её от объема вытекшей из хроматографической колонки жидкости.

Разделение белков по молекулярной массе . Если представить молекулы белков в виде шариков различной величины, размер которых зависит от их молекулярной массы, то окажется, что у больших шариков будет большей молекулярная масса или размер молекул. Это означает, что белки можно разделить подобно частичкам в сите - молекулярном сите, образованном гелем. Такой способ часто называют гель-фильтрацией или хроматографией исключения размером . Ниже приводится иллюстрация того, как с помощью гель-фильтрации удается разделить смесь белков различного размера (рис.1.12).

Хроматографическую колонку заполняют набухшим гелем. Частицы геля приготовлены из связанного поперечными сшивками полисахаридного материала и содержат большое количество микропор. Размер микропор подбирают таким образом, чтобы в них проникали меньшие из разделяемых молекул, в то время как большие этого сделать не могли. Смесь разделяемых белков наносят на верхнюю часть колонки и элюируют буферным раствором. Увлекаемые током нисходящей жидкости большие молекулы, не имея возможности проникнуть в поры гелевых частиц, будут двигаться быстрее. Меньшие молекулы проникают в поры и задерживаются там. Если собирать вытекающий из колонки раствор равными порциями в пробирки, то окажется, что в более ранних порциях вытекающей жидкости будут содержаться белки больших размеров, а в более поздних - меньших размеров. Путем подбора размера пор можно добиться разделения самых разных смесей белков.

Рис.1.12. Схематическое изображение разделения белков методом гель-фильтрации

Если учесть, что размер молекулы зависит от молекулярной массы, то оказывается, что разделяя белки методом гель-фильтрации, одновременно можно установить его молекулярную массу.

Рис.1.13. График зависимости молекулярной массы белков от объема выхода их из хроматографической колонки в ходе гель-фильтрации

Объем вытекающего из колонки элюата обратнопропорционален логарифму молекулярной массы белка. Таким образом, достаточно знать объем жидкости, в котором вышел из колонки интересующий белок, чтобы, пользуясь подобным графиком, можно было установить его молекулярную массу (рис.1.13).

Ещё одним методом, который позволяет разделить белки в зависимости от их молекулярной массы, является гель-электрофорез (см. выше).

Ультрацентрифугирование. Если встряхнуть сосуд, заполненный песком с водой, а затем поставить его на ровную поверхность, то песок быстро осядет на дно благодаря силе земного притяжения. С высокомолекулярными веществами, находящимися в растворе, этого не произойдет, так как тепловое (броуновское) движение сохраняет их равномерное распределение в растворе. Оседание макромолекул, подобно песчинкам, произойдет, только если их подвергнуть значительному ускорению.