Микроскопия - методы контраста. Методики контрастирования при работе с микроскопом Фазово контрастная микроскопия используется при изучении

Изображение диатомеи при различных методах контрастирования – светлое поле, темное поле, дифференциально-интерференционный контраст (ДИК), цветные монохроматические фильтры

При работе с микроскопом исследователи часто сталкиваются с низким контрастом изображения в окулярах и на фотокамере. Иногда крайне затруднительно различить мельчайшие дефекты на кремниевой пластине или определить рельеф поверхности образца. Причин может быть несколько, но в основном это несоответствие условий освещения задачам наблюдения. В этой статье речь пойдет о повышении информативности изображения при использовании специальных фильтров и оптических компонентов, меняющих природу формирования изображения. Мы рассмотрим методики контрастирования на микроскопах отраженного и проходящего света, подробно отразив схемы хода лучей.

Темное поле/косопадающий свет

При освещении объекта коаксиальным светом через объектив очень сложно оценить топографию поверхности объекта или микродефекты образца из-за отсутствия теневых областей. Иногда бестеневое освещение необходимо (в случае реставрационных работ под стереомикроскопом или при проведении каких-либо хирургических операций), но в случае, когда нам необходимо определить рельеф поверхности, тени – единственное, за что сможет зацепиться наше зрение. Для того, чтобы создать рельефную контрастную картину, необходимо осветить объект сбоку так называемым косопадающим светом. На стереомикроскопе при помощи специальных осветителей типа «гусиная шея» сделать это не составит труда, в то время как на лабораторном микроскопе крошечное рабочее расстояние объектива не позволит вводить источник света сбоку. На помощь в таком случае нам придут темнопольные объективы (индекс BD – Brightfield/Darkfield).

Такие объективы обладают дополнительным металлическим цилиндром снаружи, являющимся проводником и отражателем света. Свет не попадает через объектив непосредственно в поле зрения, но попадает через полый цилиндр на поверхность образца вне поля зрения, и, отражаясь от нее, обеспечивает предельно косопадающее освещение видимой области. Микрочастицы, расположенные на ровной поверхности образца, начинают светиться, трещины и прочие дефекты резко подчеркивают грани. При работе в проходящем свете достаточно воспользоваться темнопольной вставкой в конденсор – метод А.

1 – вставка в конденсор, 2 – конденсорная линза, 3 – образец, 4 – объектив

При работе с объективами с высокой числовой апертурой необходимо использовать диафрагму, отрезающую проходящий свет из конденсора – метод B.

Темное поле в проходящем свете. (Метод В: апертурная диафрагма объектива с высокой NA, отрезающая проходящий свет)
1 – темнопольная вставка в конденсор, 2 – конденсорная линза, 3 – образец, 4 – объектив, 5 – апертурная диафрагма

Фазовый контраст

Фазовый контраст используется в основном в биологии для изучения живых неокрашенных клеток. Метод основывается на разности оптической плотности (показателя преломления) разных частей наблюдаемого объекта, а также среды, в которую образец заключен. Например, упрощенно рассматривая клетку, расположенную в водном растворе, мы сможем выделить три зоны: А (водный раствор), В (цитоплазма) и С (ядро).

А – луч света, не прошедший через образец. B – луч света, прошедший через мембрану клетки (запаздывание Д1) ,C – луч света, прошедший через ядро (запаздывание Д2 > Д1)

1 – фазовая вставка в конденсор, 2 – линза конденсора, 3 – образец, 4 – объектив, 5 – фазовое кольцо в объективе, 6 – лучи со сдвигом фазы, 7 – луч без запаздывания

Световые волны незначительно смещаются, проходя через различные среды, из-за разности показателя преломления. Причем, помимо геометрического смещения, происходит явление запаздывания – смещение фазы. До прохождения через препарат волны света находятся “в фазе”, а после прохождения через различные материалы – уже нет. Величина фазового смещения будет зависеть от оптической плотности материалов, а также от величины пути в этих средах.
Наш глаз не может заметить разность фаз в изображении. Он различает только разницу интенсивности и разницу цвета. Метод фазового контраста позволяет преобразовать значения фазового сдвига в значения интенсивностей света.

В конденсор микроскопа вставляется специальная фазовая вставка (кольцевая диафрагма, схожая с темнопольной вставкой). Свет, прошедший через нее, формируется конденсором и освещает препарат. Весь пучок света поступает в объектив и в зрачке объектива формируется изображение фазовой вставки. В этом месте в объективе расположено нанесенное на стекло фазовое кольцо – оптический материал, снижающий интенсивность излучения и придающий свету постоянное фазовое смещение. Если в препарате содержатся объекты, изменяющие направление луча (как клетки и их ядра), то свет из прямого луча отклоняется на новую траекторию. Этот свет не проходит сквозь фазовое кольцо, не ослабляется и не задерживается. Все частичные лучи объединяются тубусной линзой и формируют промежуточное изображение. В нем частичные лучи, поступающие с различными фазами, ослабляются или усиливаются, накладываясь друг на друга. Таким образом, разность фаз превращается в разницу интенсивностей, которую может регистрировать наш глаз.

Метод фазового контраста незаменим при работе с живыми клетками, проведении ЭКО, различных манипуляциях с неокрашенными препаратами.

Поляризация

Поляризация – широко применяющийся метод контрастирования, меняющий физику изображения. Этот метод позволяет убрать блики поверхностей с высоким коэффициентом отражения, получить качественное и насыщенное изображение, но главное – с поляризацией возможно проведение петрографических исследований и измерений углов поляризации для определения состава объекта. Для проведения поляризационных исследований необходимо два компонента – поляризатор (обычно неподвижный) и анализатор (обычно вращаемый).
Два фильтра (поляризатор и анализатор), введенные последовательно в ход лучей и повернутые относительно друг друга на 90 градусов, не пропускают свет. Первый фильтр изменяет плоскость поляризации света таким образом, что пропущенный им свет не может пройти через второй фильтр (анализатор). Реализация поляризованного освещения в микроскопе достаточно простая задача.
При работе с проходящим светом поляризатор устанавливается в конденсор, а анализатор находится за объективом. В отраженном свете анализатор остается на своем месте, а поляризатор устанавливается перед дихроичным зеркалом сразу после апертурной диафрагмы осветителя отраженного света. В обоих случаях образец освещается плоскополяризованным светом. Если образец при освещении поворачивает направление колебаний поляризованного света из плоскости заданной поляризатором, то в окулярах мы начинаем видеть свет, который частично пропускает анализатор. Явление поляризации характерно прежде всего для таких кристаллов как минералы, а также для полимеров.

1 – осветитель, 2 – поляризатор, 3 – дихроичное зеркало, 4 – объектив, 5 – образец, 6а – лямбда-пластина, 6 – анализатор, 7 – тубусная линза

1. поляризатор, 2 – конденсор, 3 – образец, 4 – объектив, 5а – лямбда пластина, 5 – анализатор, 6 – тубусная линза

Обычно в оптический путь перед анализатором вводят компенсатор “Лямбда-пластину” (иногда его называют красной пластиной первого порядка). Линейно поляризованный луч в кристалле компенсатора раскладывается на 2 луча: обыкновенный и необыкновенный, близкие по интенсивности. При выходе из компенсатора необыкновенный луч получает запаздывание на одну длину волны относительно обыкновенного. Но поскольку обыкновенный и необыкновенный лучи поляризованы по-разному, то интерферировать они не могут. Пройдя анализатор, установленный перпендикулярно поляризатору, оба луча будут ослаблены наполовину, но их плоскости поляризации теперь совпадут. Лучи интерферируют, и, в результате, поле зрения окрашивается в розово-красный цвет (как правило разность хода волн в компенсаторе порядка 580 нм). Если между поляризатором и компенсатором окажутся оптически-активные включения, то для прошедших через них лучей условия интерференции будут другими, и изменится их цвет. То есть компенсатор осуществляет цветовое контрастирование оптически-активных объектов. Углом поворота компенсатора можно в определенной мере менять цвет фона и “раскраску” объектов, но при угле 45 градусов относительно поляризатора и анализатора будет получена максимальная интенсивность.

Механические напряжения в стекле приводят к двулучепреломлению, оказывающему воздействие на поляризованный свет. Часто для проведения количественных поляризационных исследований используют специальные объективы, не обладающие внутренними напряжениеями, они имеют маркировку Pol.

Дифференциально-интерференционный контраст Номарского (DIC, ДИК)

Дифференциально-интерференционный метод контрастирования (DIC) является, в некотором виде, комбинацией методов фазового и поляризационного контраста. В проходящем свете дифференциально-интерференционный контраст реализуется несколько сложнее из-за использования двух ДИК-призм (двулучепреломляющие призмы). Ход лучей при ДИК контрастировании схож с поляризационным методом, но дополнительно в оптический путь вводятся две ДИК-призмы – в конденсор и вблизи зрачка объектива. Призма в конденсоре осуществляет векторное разложение плоскополяризованного света по двум взаимноперпендикулярным направлениям колебаний и смещает их в боковом направлении так, что в препарате возникает боковое смещение составляющее дельта Х = к * лямбда. К – коэффициент смещения, обычно меньше единицы.

Далее вспомним метод фазового контраста. Если оба частичных луча пройдут через совершенно одинаковые структуры, то они не приобретут разность хода. Но если для частичных пучков имеются различные условия (разная оптическая плотность образца), то каждый из них на выходе из образца приобретает свою разность хода. Частичные пучки собираются второй ДИК призмой, анализатор выбирает из смещенных по фазе волновых комплектов только те, которые колеблются в направлении анализатора. Таким образом, после анализатора мы получаем лучи, колеблющиеся в одном направлении и разные по фазе. Накладываясь друг на друга, лучи интерферируются и, таким образом, фазовый сдвиг превращается в разность интенсивности. Посредством лямбда-пластины достигается дополнительный цветовой контраст.
Метод показывает только “продольные” изменения, следствием чего является получение рельефных изображений. ДИК в проходящем свете превосходно подходит для отображения отдельных сечений неокрашенных толстых объектов.

Световые волны характеризуются длиной волны, амплитудой и фазой. Глаз человека способен различать длину волны (цвет) и амплитуду (интенсивность, яркость света), но не может обнаружить различия в фазе.

При микроскопии окрашенных объектов наблюдается изменение амплитуды (уменьшение яркости света) и избирательное поглощение света определенной длины волны (изменение цвета).

При наблюдении неокрашенных микроорганизмов, отличающихся от окружающей среды только по показателю преломления, изменения интенсивности не происходит, а изменяется только фаза прошедших световых волн. Поэтому глаз изменений заметить не может и эти объекты выглядят малоконтрастными, прозрачными.

Для наблюдения таких объектов используют фазово-контрастную микроскопию, основанную на превращении фазовых изменений, вносимых объектом, в амплитудные, различимые глазом.

Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом биологическом микроскопе и состоит из: 1) набора объективов со специальными фазовыми пластинками; 2) конденсора с поворачивающимся диском. В нем установлены кольцевые диафрагмы, соответствующие фазовым пластинкам в каждом из объективов; 3) вспомогательного микроскопа.

Настройка фазового контраста в основном заключается в следующем:

1) заменяют объективы и конденсор микроскопа на фазово-контрастные;

2) устанавливают объектив малого увеличения и отверстие в диске конденсора без кольцевой диафрагмы (обозначенное цифрой "0");

3) настраивают свет по Кёлеру;

4) выбирают фазовый объектив соответствующего увеличения и фокусируют его на препарат;

5) поворачивают диск конденсора и устанавливают соответствующую объективу кольцевую диафрагму;

6) вынимают из тубуса окуляр и вставляют на его место вспомогательный микроскоп. Настраивают его так, чтобы были резко видны фазовая пластинка (в виде темного кольца) и кольцевая диафрагма (в виде светлого кольца того же диаметра). С помощью регулировочных винтов на конденсоре точно совмещают эти кольца. Вынимают вспомогательный микроскоп и вновь устанавливают окуляр.

Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст). Наша промышленность выпускает устройство КФ-4 для позитивного фазового контраста.

Фазово-контрастная микроскопия широко применяется также для изучения клеток культуры ткани, наблюдения действия различных вирусов на клетки и т. п. В этих случаях часто применяют биологические микроскопы с обратным расположением оптики - так называемые инвертированные микроскопы. У таких микроскопов объективы расположены снизу, а конденсор - сверху. Иногда они заключены в термостат для наблюдения за динамикой изменений в клетках культуры ткани и снабжены кинокамерой.

Морфология некоторых микроорганизмов не может быть изучена с помощью описанных выше способов микроскопии. К ним относятся различные спирохеты и, в частности, лептоспиры, некоторые крупные вирусы. Для наблюдения этих микроорганизмов применяют темнопольную микроскопию.

Темнопольная микроскопия

Темнопольная микроскопия основана на способности микроорганизмов сильно рассеивать свет. Для темнопольной микроскопии пользуются обычными объективами и специальными темнопольными конденсорами. Существует несколько типов таких конденсоров, различающихся по устройству.

Основная особенность темнопольных конденсоров заключается в том, что центральная часть у них затемнена и прямые лучи от осветителя в объектив микроскопа не попадают. Объект освещается косыми боковыми лучами и в объектив микроскопа попадают только лучи, рассеянные частицами, находящимися в препарате. Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля, известным примером которого служит обнаружение пылинок в воздухе при освещении их узким лучом солнечного света.

Чтобы в объектив не попадали прямые лучи от осветителя, апертура его должна быть меньше, чем апертура конденсора. Для уменьшения апертуры в обычный объектив помещают диафрагму или пользуются специальными объективами, снабженными ирисовой диафрагмой.

При темнопольной микроскопии микроорганизмы выглядят ярко светящимися на черном фоне. При этом способе микроскопии могут быть обнаружены мельчайшие микроорганизмы, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности микроскопа. Однако темнопольная микроскопия позволяет увидеть только контуры объекта, но не дает возможности изучить внутреннюю структуру.

Обычно с помощью темнопольной микроскопии изучают препараты типа "раздавленная капля". При этом очень строгие требования предъявляются к качеству предметных и покровных стекол и приготовлению препарата. Предметные стекла должны быть не толще 1,1-1,2 мм, покровные - 0,17 мм, без царапин и загрязнений. При приготовлении препарата следует обращать особое внимание на отсутствие пузырьков и крупных частиц (все эти дефекты будут видны ярко святящимися и не позволят наблюдать препарат).

Для темнопольной микроскопии необходимы яркие источники света, поэтому следует применять более мощные осветители и максимальный накал лампы.

Настройка темнопольного освещения в основном заключается в следующем:

1) устанавливают свет по Кёлеру; 2) заменяют светлопольный конденсор темнопольным; 3) на верхнюю линзу конденсора наносят иммерсионное масло или в крайнем случае дистиллированную воду; 4) поднимают конденсор до соприкосновения с нижней поверхностью предметного стекла; 5) объектив малого увеличения фокусируют на препарат; 6) с помощью центрировочных винтов переводят в центр поля зрения светлое пятно (иногда имеющее затемненный центральный участок); 7) поднимая и опуская конденсор, добиваются исчезновения затемненного центрального участка и получения равномерно освещенного светлого пятна. Если этого сделать не удается, то надо проверить толщину предметного стекла (обычно такое явление наблюдается при использовании слишком толстых предметных стекол - конус света фокусируется в толще стекла).

После правильной настройки света устанавливают объектив нужного увеличения и исследуют препарат.

Похожая информация.

48503 0

Мельчайшие размеры микроорганизмов обусловливают использование для изучения морфологии бактерий точных оптических приборов - микроскопов. Наиболее часто применяются светлопольная микроскопия, микроскопия в темном поле, фазово-контрастная и люминесцентная микроскопия. Для специальных микробиологических исследований используется электронная микроскопия.

Светлопольная микроскопия

При исследовании микробов применяется иммерсионная система (объектив). Иммерсионный объектив погружают в каплю кедрового масла, нанесенного на препарат. Кедровое масло имеет такой же коэффициент преломления, как и стекло, и этим достигается наименьшее рассеивание световых лучей (рис. 1.12).

Рис. 1.12. Ход лучей в иммерсионном объективе

Рис. 1.13. Схема сложного светового микроскопа для наблюдения в светлом поле, отрегулированного для освещения по Келеру

Темнопольная микроскопия

Рис. 1.14. Схема микроскопа для наблюдения в темном поле.

На середину покровного стекла наносят исследуемый материал. Края углубления на предметном стекле смазывают вазелином, и им накрывают покровное стекло так, чтобы капля находилась против центра углубления. Затем переворачивают препарат покровным стеклом вверх. Темнопольная микроскопия используется для изучения живых неокрашенных микроорганизмов.

Фазово-контрастная микроскопия

Рис. 1.15. Схема фазово-контрастного микроскопа.

Фазово-контрастная микроскопия значительно повышает контрастность объекта и используется для изучения нативных препаратов.

Люминесцентная микроскопия

Основной частью люминесцентного микроскопа является осветитель, имеющий лампу ультрафиолетового цвета и систему фильтров к нему (рис. 1.16). Очень важно использование нефлуоресцентного иммерсионного масла.
Люминесцентная микроскопия в практической микробиологии используется для индикации и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний.

Рис. 1.16. Схематическое изображение флуоресцентного микроскопа: 1 - дуговая лампа; 2 - кварцевый коллектор; 3 - кювета, заполненная раствором сернокислой меди; 4 - передняя часть коллектора; 5 - ультрафиолетовый фильтр; 6 - призма; 7 - пластинка из уранового стекла; 8 - окулярный фильтр, поглощающий
ультрафиолетовые лучи.

Электронная микроскопия

Рис. 1.17. Схема трансмиссионного электронного микроскопа.

Препараты для электронной микроскопии готовят на тончайших коллоидных пленках, исследуют объекты после их высушивания («нативные препараты»), напыления при помощи тяжелых металлов, ультратонких срезов метода реплик и др.

С помощью электронной микроскопии можно обнаружить самые мелкие структуры, получить увеличение до 200 000 и увидеть объекты размером 0,002 мкм.

Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик

Метод, который позволяет резко повысить контрастность изображения объекта. Принцип метода состоит в выявлении сдвигов фазы световых колебаний, которые возникают, когда свет проходит сквозь структуру, имеющую показатель преломления, отличающийся от показателя преломления окружающей среды.

Фазовые сдвиги глазом непосредственно не улавливаются, но в специальном фазово-контрастном микроскопе структуры, имеющие более высокий показатель преломления (даже совершенно прозрачные), оказываются более темными (или более светлыми в зависимости от конструкции прибора), чем окружающий фон (рис. 1.28).

Рис. 1.28. Фото амебы (фазово-контрастная микроскопия)

Поляризационная микроскопия

Метод наблюдения в поляризованном свете для исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов). Таковыми являются многие минералы, зёрна в шлифах сплавов, некоторые животные и растительные ткани и пр.

Наблюдение можно проводить как в проходящем, так и в отражённом свете (рис. 1.29).

Рис. 1.29. Кристаллы урата натрия (Samaras N, Rossi C. N Engl J Med. 2012)

Ультрафиолетовая микроскопия

Метод основан на способности некоторых веществ избирательно поглощать ультрафиолетовые лучи с определенной длиной волны, принципиально почти ничем не отличается от обычной световой микроскопии и осуществляется при помощи микроскопов с кварцевой или отражательной (зеркальной) оптикой. Изображение рассматривается на флюоресцирующем экране визуально, а также фотографируется. Микроскопирование объектов позволяет выявить исследуемые вещества, не применяя окрашивания.

Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия позволяет изучать как собственную (первичную) флюоресценцию ряда веществ, так и вторичную флюоресценцию, вызванную окрашиванием клеточных структур специальными красителями - флюорохромами. Принцип метода состоит в том, что некоторые вещества при световом облучении начинают светиться сами.

Для возбуждения флюоресценции в видимой части спектра обычно пользуются синим светом или ультрафиолетовыми лучами. Многие вещества, не флюоресцирующие в видимой области (в особенности нуклеиновые кислоты), при освещении ультрафиолетовыми лучами начинают флюоресцировать и могут выявляться без применения флюорохромов (рис. 1.30).

Рис. 1.30. Процесс митоза (флюоресцентная микроскопия)

Метод электронной микроскопии

Метод, при котором вместо света используют поток электронов, стеклянные линзы заменены электромагнитными полями, максимальное увеличение 1,5 млн. раз. Не требует окраски препарата. (1933 г. - Германия)

Применениеэлектронноймикроскопиивбиологии позволило изучить сверхтонкую структуру клетки внеклеточных компонентов тканей. На основании результатов, полученных с помощью данного метода (максимальное увеличение до 800 - 1200 тыс.), начиная с 40-х гг. было описано тонкое строение мембран, митохондрий, рибосом и других клеточных, а также внеклеточных структур, выявлены некоторые макромолекулы, например ДНК.

Растровая (сканирующая) электронная микроскопия дает возможность изучать тонкое строение поверхности клеток и тканевых структур не только фиксированных объектов, но и живых животных. Техника приготовления биологических препаратов для электронноймикроскопиивключает процедуры, сохраняющие ткань в условиях глубокого вакуума под пучком электронов и реализующие высокое разрешение. Для повышения контраста изображения клеток их обрабатывают «электронными красителями», сильно рассеивающими электроны.

Применение электронноймикроскопиив биологии существенно изменило и углубило прежние представления о тонком строении клетки(рис. 1.31-1.34).

Рис. 1.31. Снимок стафиллококков с помощью растрового электронного микроскопа

Рис. 1.32. Электронный микроскоп

Рис. 1.33. Устройство электронного микроскопа

Рис. 1.34. Снимок Helicobacter с помощью растрового электронного микроскопа

(Dr. Patricia Fields, Dr. Collette Fitzgerald)

Метод центрифугирования

Разделение смесей на составные части под действием центробежной силы. Применяется при разделении органоидов клетки, легких и тяжелых фракций органических веществ и т. д. при этом ускорение в 300 раз больше, чем земное притяжение.

Центрифуга служит для разделения сыпучих тел или жидкостей различного удельного веса и отделения жидкостей от твёрдых тел путем использования центробежной силы. При вращении в центрифуге частицы с наибольшим удельным весом располагаются на периферии, а частицы с меньшим удельным весом - ближе к оси вращения(рис. 1.35).

Рис. 1.35. Устройство центрифуги

ФАЗОВО-КОНТРАСТНАЯ МИКРОСКОПИЯ - способ микроскопического исследования прозрачных, не поглощающих света объектов, основанный на усилении контраста изображения.

Прозрачные, не окрашенные объекты (живые и фиксированные микроорганизмы, клетки и др.), отличающиеся от окружающей среды по показателю преломления, не поглощают света, но изменяют его скорость и, следовательно, фазу световых колебаний. Причем степень этих изменений зависит от величины показателя преломления и толщины структур объекта. Однако эти изменения не воспринимаются глазом, не регистрируются фотоматериалами, и исследуемые объекты при световой микроскопии почти не отличаются от фона. Для усиления контрастности изображения применяют фазово-контрастная микроскопия. Ее широко используют для прижизненного изучения микроорганизмов, простейших, клеток растений и животных. В гематологии, например, фазово-контрастную микроскопию применяют для подсчета и дифференциации клеток, изучения их подвижности, дифференциальной диагностики лейкозов и др.

Способ превращения фазовых изменений в соответствующие им амплитудные был предложен в 30-х годов 20 века голландским физиком Зернике (F. Zernike). Принцип фазово-контрастной микроскопии заключается в том, что свет, не отклоненный объектом, проходит через нанесенное на одну из линз объектива фазовое кольцо, смещающее его фазу на четверть длины волны и ослабляющее его интенсивность (для того, чтобы уравнять ее с интенсивностью дифрагированного объектом света), а дифрагированный (отклоненный) свет проходит мимо фазового кольца (см. Микроскоп).

Прохождение прямого, не дифрагированного объектом света через фазовое кольцо обеспечивается находящейся в конденсоре кольцевой диафрагмой, проекция к-рой в плоскости выходного зрачка объектива равна по диаметру и ширине фазовому кольцу и должна полностью совпадать с ним. Для каждого объектива имеется своя кольцевая диафрагма.

В плоскости изображения происходит интерференция световых волн, прошедших и не прошедших через фазовое кольцо. При этом возникают различия в амплитуде, отражающие изменения фазы в зависимости от свойств участков объекта. В отличие от фазовых амплитудные изменения световых волн хорошо видны глазом и могут быть зарегистрированы.

В зависимости от способа изготовления фазового кольца фаза прямого, не дифрагированного объектом света может либо опережать фазу дифрагированного, либо отставать от нее. При этом возникает или наиболее распространенный позитивный фазовый контраст, где частицы с показателем преломления большим, чем у окружающей среды (более плотные), выглядят темными на светлом фоне, или негативный, где такие же частицы дают изображение светлее окружающего фона. Необходимо, однако, отметить, что эта картина сохраняется только до определенной величины показателя преломления, а после достижения этой величины происходит инверсия контраста, то есть наблюдаются обратные закономерности.

Фазово-контрастное устройство (в частности, КФ-4, выпускаемое в нашей стране) состоит из объективов, на одну из линз которых нанесено фазовое кольцо, конденсора с револьверным диском, содержащим набор кольцевых диафрагм, и центрировочным приспособлением, а также вспомогательного микроскопа (рис. 1), с помощью которого в плоскости выходного зрачка объектива можно наблюдать за совмещением фазового кольца и проекции кольцевой диафрагмы конденсора. Это устройство может быть установлено на любой микроскоп.

Существует ряд конструктивных разновидностей фазово-контрастных устройств: с одной кольцевой диафрагмой для всех объективов при использовании панкратического конденсора (например, в отечественных микроскопах МБИ-6, МБИ-15), с так называемым вынесенным зрачком, при котором фазовое кольцо помещается вне объектива, что позволяет использовать для фазово-контрастной микроскопии обычные объективы (такое устройство имеется в отечественных микроскопах МБИ-13, МБИ-17). Выпускаются также устройства с переменным фазовым контрастом (с двумя кольцами разного диаметра).

Одной из разновидностей негативного фазового контраста является аноптральное (фазово-темнопольное) устройство. Аноптральное устройство было создано в 1953 году Вильской (A. Wilska) и используется для изучения объектов, вносящих небольшой сдвиг фазы. Модификация этого метода была предложена М. А. Пешковым и широко использовалась у нас в стране.

Методика приготовления препаратов для фазово-контрастной микроскопии зависит от объекта исследования и длительности его изучения: неокрашенные микроорганизмы можно рассматривать в препаратах раздавленная капля (см.), для длительного наблюдения и кинорегистрации размножения микроорганизмов используют специальные агаровые.микрокамеры (см.) на предметных стеклах (камера Фонбрюна, HI-образная камера Пешкова). Для изучения динамики процессов в однослойных культурах ткани также применяют микрокамеры (стационарные и перфузионные). Очень важными факторами, в значительной мере определяющими качество изображения, являются толщина препарата и различия в показателях преломления объекта и среды.

Техника фазово-контрастной микроскопии сравнительно проста: объективы и конденсор микроскопа заменяют на специальные (на отечественных фазово-контрастных объективах имеется обозначение Ф, на зарубежных - Ph), диск конденсора устанавливают в положение О (то есть сквозное отверстие без кольцевой диафрагмы), на предметный столик помещают препарат, настраивают свет по Келеру (см. Микроскопические методы исследования), вращением диска вводят кольцевую диафрагму, соответствующую увеличению объектива. Вместо окуляра устанавливают вспомогательный микроскоп. Выдвигая его верхнюю часть, получают резкое изображение фазового кольца и кольцевой диафрагмы. Центрировочными винтами конденсора точно совмещают оба кольца, после чего вместо вспомогательного микроскопа устанавливают окуляр. При смене препарата целесообразно проверить совмещение колец (рис. 2).

Достоинством фазово-контрастной микроскопии является возможность проводить прижизненные наблюдения (без какой-либо обработки) биол. объектов, напр, макрофагов (рис. 3), а недостатком - возникновение светлого (в случае позитивного контраста) или темного (в случае негативного) ореола вокруг объекта и его структур. Более полная информация может быть получена при сочетании фазово-контрастной и люминесцентной микроскопии при применении как иммунолю-минесцентного (см. Иммунофлюоресценция), так и люминесцентно-цитохимического метода (см. Люминесцентная микроскопия). При работе с люминесцирующими сыворотками фазово-контрастной микроскопии позволяет убедиться в наличии микрообъекта в том случае, если он не связывает люминесцирующие антитела, а также изучать объекты, у которых антитела фиксируются на отдельных структурах.

Особенно большую роль в прижизненном цитологическом изучении динамики различных физиологических и патологических процессов в клеточной биологии, микробиологии, вирусологии сыграло сочетание фазово-контрастной и аноптральной микроскопии с микрокиносъемкой (см.). Этот метод был использован для изучения цитологии бактерий и простейших, митоза в различных клетках, цитопатического действия вирусов и риккетсий на клетки. Были также изучены особенности образования и развития L-форм бактерий и микоплазм, действие антибиотиков на бактерии.

Библиогр.: Кравченко А. Т., Милютин В. Н. и Гудима О. С. Микрокиносъемка в биологии, М., 1963; Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней, под ред. К. И. Матвеева, с. 5, 25, М., 1973; Скворцов Г. Е. и др. Микроскопы, Л., 1969; Франсон М. Фазовоконтрастный и интерференционный микроскопы, пер. с франц., М., 1960; Cinemic-rography in cell biology, ed. by G. G. Rose, N. Y.-L., 1963; Zernike F. Diff-raktion theory of the knife edge test and its improved form of the phase contrast method, Physica, v. 1, p. 689, 1934.

М. Я. Корн, E. С. Станиславский.