Объекты генной инженерии. Генная инженерия человека

Генная инженерия

Материал из Википедии - свободной энциклопедии

Ге́нная инжене́рия - совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы.

Генная инженерия не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии, используя исследования таких биологических наук, как молекулярная и клеточная биология, цитология, генетика, микробиология, вирусология.

1 Экономическое значение

2 История развития и достигнутый уровень технологии

3 Применение в научных исследованиях

4 Генная инженерия человека

5 Примечания

7 Литература

Экономическое значение

Генная инженерия служит для получения желаемых качеств изменяемого или генетически модифицированного организма. В отличие от традиционной селекции, в ходе которой генотип подвергается изменениям лишь косвенно, генная инженерия позволяет непосредственно вмешиваться в генетический аппарат, применяя технику молекулярного клонирования. Примерами применения генной инженерии являются получение новых генетически модифицированных сортов зерновых культур, производство человеческого инсулина путем использования генномодифицированных бактерий, производство эритропоэтина в культуре клеток или новых пород экспериментальных мышей для научных исследований.

Основой микробиологической, биосинтетической промышленности является бактериальная клетка. Необходимые для промышленного производства клетки подбираются по определённым признакам, самый главный из которых - способность производить, синтезировать, при этом в максимально возможных количествах, определённое соединение - аминокислоту или антибиотик, стероидный гормон или органическую кислоту. Иногда надо иметь микроорганизм, способный, например, использовать в качестве «пищи» нефть или сточные воды и перерабатывать их в биомассу или даже вполне пригодный для кормовых добавок белок. Иногда нужны организмы, способные развиваться при повышенных температурах или в присутствии веществ, безусловно смертельных для других видов микроорганизмов.

Задача получения таких промышленных штаммов очень важна, для их видоизменения и отбора разработаны многочисленные приёмы активного воздействия на клетку - от обработки сильно действующими ядами до радиоактивного облучения. Цель этих приёмов одна - добиться изменения наследственного, генетического аппарата клетки. Их результат - получение многочисленных микробов-мутантов, из сотен и тысяч которых учёные потом стараются отобрать наиболее подходящие для той или иной цели. Создание приёмов химического или радиационного мутагенеза было выдающимся достижением биологии и широко применяется в современной биотехнологии.

Но их возможности ограничиваются природой самих микроорганизмов. Они не способны синтезировать ряд ценных веществ, которые накапливаются в растениях, прежде всего в лекарственных и эфирномасличных. Не могут синтезировать вещества, очень важные для жизнедеятельности животных и человека, ряд ферментов, пептидные гормоны, иммунные белки, интерфероны да и многие более просто устроенные соединения, которые синтезируются в организмах животных и человека. Разумеется, возможности микроорганизмов далеко не исчерпаны. Из всего изобилия микроорганизмов использована наукой, и особенно промышленностью, лишь ничтожная доля. Для целей селекции микроорганизмов большой интерес представляют, например, бактерии анаэробы, способные жить в отсутствие кислорода, фототрофы, использующие энергию света подобно растениям, хемоавтотрофы, термофильные бактерии, способные жить при температуре, как оказалось недавно, около 110 °C, и др.

И всё же ограниченность «природного материала» очевидна. Обойти ограничения пытались и пытаются с помощью культур клеток и тканей растений и животных. Это очень важный и перспективный путь, который также реализуется в биотехнологии. За последние несколько десятилетий учёные создали методы, благодаря которым отдельные клетки тканей растения или животного можно заставить расти и размножаться отдельно от организма, как клетки бактерий. Это было важное достижение - полученные культуры клеток используют для экспериментов и для промышленного получения некоторых веществ, которые с помощью бактериальных культур получить невозможно.

[править]

История развития и достигнутый уровень технологии

Во второй половине ХХ века было сделано несколько важных открытий и изобретений, лежащих в основе генной инженерии. Успешно завершились многолетние попытки «прочитать» ту биологическую информацию, которая «записана» в генах. Эта работа была начата английским учёным Ф. Сенгером и американским учёным У. Гилбертом (Нобелевская премия по химии 1980 г.). Как известно, в генах содержится информация-инструкция для синтеза в организме молекул РНК и белков, в том числе ферментов. Чтобы заставить клетку синтезировать новые, необычные для неё вещества, надо чтобы в ней синтезировались соответствующие наборы ферментов. А для этого необходимо или целенаправленно изменить находящиеся в ней гены, или ввести в неё новые, ранее отсутствовавшие гены. Изменения генов в живых клетках - это мутации. Они происходят под действием, например, мутагенов - химических ядов или излучений. Но такие изменения нельзя контролировать или направлять. Поэтому учёные сосредоточили усилия на попытках разработать методы введения в клетку новых, совершенно определённых генов, нужных человеку.

Основные этапы решения генноинженерной задачи следующие:

1. Получение изолированного гена.

2. Введение гена в вектор для переноса в организм.

3. Перенос вектора с геном в модифицируемый организм.

4. Преобразование клеток организма.

5. Отбор генетически модифицированных организмов (ГМО) и устранение тех, которые не были успешно модифицированы.

Процесс синтеза генов в настоящее время разработан очень хорошо и даже в значительной степени автоматизирован. Существуют специальные аппараты, снабжённые ЭВМ, в памяти которых закладывают программы синтеза различных нуклеотидных последовательностей. Такой аппарат синтезирует отрезки ДНК длиной до 100-120 азотистых оснований (олигонуклеотиды). Получила распространение техника, позволяющая использовать для синтеза ДНК, в том числе мутантной, полимеразную цепную реакцию. Термостабильный фермент, ДНК-полимераза, используется в ней для матричного синтеза ДНК, в качестве затравки которого применяют искусственно синтезированные кусочки нуклеиновой кислоты - олигонуклеотиды. Фермент обратная транскриптаза позволяет с использованием таких затравок (праймеров) синтезировать ДНК на матрице веделенной из клеток РНК. Синтезированная таким способом ДНК называется комплементарной (РНК) или кДНК. Изолированный, «химически чистый» ген может быть также получен из фаговой библиотеки. Так называется препарат бактериофага, в геном которого встроены случайные фрагменты из генома или кДНК, воспроизводимые фагом вместе со всей своей ДНК.

Чтобы встроить ген в вектор, используют ферменты - рестриктазы и лигазы, также являющиеся полезным инструментом генной инженерии. С помощью рестриктаз ген и вектор можно разрезать на кусочки. С помощью лигаз такие кусочки можно «склеивать», соединять в иной комбинации, конструируя новый ген или заключая его в вектор. За открытие рестриктаз Вернер Арбер, Даниел Натанс и Хамилтон Смит также были удостоены Нобелевской премии (1978 г.).

Техника введения генов в бактерии была разработана после того, как Фредерик Гриффит открыл явление бактериальной трансформации. В основе этого явления лежит примитивный половой процесс, который у бактерий сопровождается обменом небольшими фрагментами нехромосомной ДНК, плазмидами. Плазмидные технологии легли в основу введения искусственных генов в бактериальные клетки.

Значительные трудности были связаны с введением готового гена в наследственный аппарат клеток растений и животных. Однако в природе наблюдаются случаи, когда чужеродная ДНК (вируса или бактериофага) включается в генетический аппарат клетки и с помощью её обменных механизмов начинает синтезировать «свой» белок. Учёные исследовали особенности внедрения чужеродной ДНК и использовали как принцип введения генетического материала в клетку. Такой процесс получил название трансфекция.

Если модификации подвергаются одноклеточные организмы или культуры клеток многоклеточных, то на этом этапе начинается клонирование, т.е. отбор тех организмов и их потомков (клонов), которые подверглись модификации. Когда же поставлена задача получить многоклеточные организмы, то клетки с измененным генотипом используют для вегетативного размножения растений или вводят в бластоцисты суррогатной матери, когда речь идет о животных. В результате рождаются детеныши с измененным или неизмененным генотипом, среди которых отбирают и скрещивают между собой только те, которые проявляют ожидаемые изменения.

Применение в научных исследованиях

Генетический нокаут. Для изучения функции того или иного гена может быть применен генетический нокаут. Так называется техника удаления одного или большего количества генов, что позволяет исследовать последствия подобной мутации. Для нокаута синтезируют такой же ген или его фрагмент, измененный так, чтобы продукт гена потерял свою функцию. Для получения нокаутных мышей полученную генноинженерную конструкцию вводят в эмбриональные стволовые клетки и замещают ею нормальный ген, а измененные клетки имплантируют в бластоцисты суррогатной матери. У плодовой мушки дрозофилы мутации инициируют в большой популяции, в которой затем ищут потомство с нужной мутацией. Сходным способом получают нокаут у растений и микроорганизмов.

Искуственная экспрессия. Логичным дополнением нокаута является искусственная экспресия, т.е. добавление в организм гена, которого у него ранее не было. Этот способ генной инженерии также можно использовать для исследования функции генов. В сущности процесс введения дополнительных генов таков же, как и при нокауте, но существующие гены не замещаются и не повреждаются.

Мечение генных продуктов. Используется, когда задачей является изучение локализации продукта гена. Одним из способов мечения является замещение нормального гена на слитый с репортерным элементом, например, с геном зеленого флуоресцентного белка (GRF). Этот белок, флуоресцирующий в голубом свете, используется для визуализации продукта генной модификации. Хотя такая техника удобна и полезна, ее побочными следствиями может быть частичная или полная потеря функции исследуемого белка. Более изощренным, хотя и не столь удобным методом является добавление к изучаемому белку не столь больших олигопептидов, которые могут быть обнаружены с помощью специфических антител.

Исследование механизма экспрессии. В таких экспериментах задачей является изучение условий экспрессии гена. Особенности экспрессии зависят прежде всего от небольшого участка ДНК, расположенного перед кодирующей областью, который называется промотор и служит для сязывания факторов транскрипции. Этот участок вводят в организм, поставив после него вместо собственного гена репортерный, например, того же GFP или фермента, катализирующего хорошо детектируемую реакцию. Кроме того, что функционирование промотора в тех или иных тканях в тот или иной момент становится хорошо заметным, такие эксперименты позволяют исследовать структуру промотора, убирая или добавляя к нему фрагменты ДНК, а также искусственно усиливать его функции.

[править]

Генная инженерия человека

В применении к человеку генная инженерия могла бы применяться для лечения наследственных болезней. Однако есть существенная разница между лечением самого пациента и изменением генома его потомков.

Хотя и в небольшом масштабе, генная инженерия уже используется для того, чтобы дать шанс забеременеть женщинам с некоторыми разновидностями бесплодия . Для этого используют яйцеклетки здоровой женщины. Ребенок в результате наследует генотип от одного отца и двух матерей. При помощи генной инженерии можно получать потомков с измененной внешностью, умственными и физическими способностьями, характером и поведением. В принципе можно создавать и более серьезные изменения, но на пути подобных преобразований человечеству необходимо решить множество этических проблем.

Примечания

BBC News. news.bbc.co.uk. Проверено 2008-04-26 г.

Литература

Сингер М., Берг П. Гены и геномы. - Москва, 1998.

Стент Г., Кэлиндар Р. Молекулярная генетика. - Москва, 1981.

Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. - 1989.

В применении к человеку генная инженерия могла бы применяться для лечения наследственных болезней. Однако, технически, есть существенная разница между лечением самого пациента и изменением генома его потомков.

Задача изменения генома взрослого человека несколько сложнее, чем выведение новых генноинженерных пород животных, поскольку в данном случае требуется изменить геном многочисленных клеток уже сформировавшегося организма, а не одной лишь яйцеклетки-зародыша. Для этого предлагается использовать вирусные частицы в качестве вектора. Вирусные частицы способны проникать в значительный процент клеток взрослого человека, встраивая в них свою наследственную информацию; возможно контролируемое размножение вирусных частиц в организме. При этом для уменьшения побочных эффектов учёные стараются избегать внедрения генноинженерных ДНК в клетки половых органов, тем самым избегая воздействия на будущих потомков пациента. Также стоит отметить значительную критику этой технологии в СМИ: разработка генноинженерных вирусов воспринимается многими как угроза для всего человечества.

С помощью генотерапии в будущем возможно изменение генома человека. В настоящее время эффективные методы изменения генома человека находятся на стадии разработки и испытаний на приматах. Долгое время генетическая инженерия обезьян сталкивалась с серьёзными трудностями, однако в 2009 году эксперименты увенчались успехом: в журнале Nature появилась публикация об успешном применении генноинженерных вирусных векторов для излечения взрослого самца обезьяны от дальтонизма. В этом же году дал потомство первый генетически модифицированный примат (выращенный из модифицированной яйцеклетки) - игрунка обыкновенная.

Однако возможность внесения более значительных изменений в геном человека сталкивается с рядом серьёзных этических проблем.

_____________________________________________________________________________________________

Генетическая инжене́рия (генная инженерия)

Это совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы.

Генетическая инженерия не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии , используя методы таких биологических наук, как молекулярная и клеточная биология, цитология, генетика, микробиология, вирусология.

Важной составной частью биотехнологии является генетическая инженерия. Родившись в начале 70-х годов, она добилась сегодня больших успехов. Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в "фабрики" для масштабного производства любого белка. Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средств.

В настоящее время кишечная палочка (E. coli) стала поставщиком таких важных гормонов как инсулин и соматотропин. Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной железы животных, поэтому стоимость его была очень высока. Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800-1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200 - 250 грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков. В 1978 году исследователи из компании "Генентек" впервые получили инсулин в специально сконструированном штамме кишечной палочки. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот. При соединении их дисульфидными связями образуется нативный двухцепочечный инсулин. Было показано, что он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается. Впоследствии в клетках E. coli был осуществлен синтез проинсулина, для чего на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезировали ее ДНК-копию. После очистки полученного проинсулина его расщепили и получили нативный инсулин, при этом этапы экстракции и выделения гормона были сведены к минимуму. Из 1000 литров культуральной жидкости можно получать до 200 граммов гормона, что эквивалентно количеству инсулина, выделяемого из 1600 кг поджелудочной железы свиньи или коровы.

Соматотропин - гормон роста человека, секретируемый гипофизом. Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной карликовости. Если вводить соматотропин в дозах 10 мг на кг веса три раза в неделю, то за год ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см. Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа: 4 - 6 мг соматотропина в пересчете на конечный фармацевтический препарат. Таким образом, доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон, получаемый этим способом, был неоднороден и мог содержать медленно развивающиеся вирусы. Компания "Genentec" в 1980 году разработала технологию производства соматотропина с помощью бактерий, который был лишен перечисленных недостатков. В 1982 году гормон роста человека был получен в культуре E. coli и животных клеток в институте Пастера во Франции, а с 1984 года начато промышленное производство инсулина и в СССР. При производстве интерферона используют как E. coli, S. cerevisae (дрожжи), так и культуру фибробластов или трансформированных лейкоцитов. Аналогичными методами получают также безопасные и дешевые вакцины.

На технологии рекомбинантных ДНК основано получение высокоспецифичных ДНК-зондов, с помощью которых изучают экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями (например, у человека и курицы). ДНК-зонды также используются в диагностике различных заболеваний.
Технология рекомбинантных ДНК сделала возможным нетрадиционный подход "белок-ген", получивший название "обратная генетика". При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку. Если он экспрессируется, несущая его клетка и ее потомки будут синтезировать измененный белок. Таким образом можно исправлять дефектные гены и лечить наследственные заболевания.

Если гибридную ДНК ввести в оплодотворенное яйцеклетку, могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие мутантный ген и передающие его потомками. Генетическая трансформация животных позволяет установить роль отдельных генов и их белковых продуктов как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах. С помощью генетической инженерии созданы линии животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с полезными для человека признаками. Например, микроинъекция рекомбинантной ДНК, содержавшей ген соматотропина быка в зиготу кролика позволила получить трансгенное животное с гиперпродукцией этого гормона. Полученные животные обладали ярко выраженной акромегалией.
Сейчас даже трудно предсказать все возможности, которые будут реализованы в ближайшие несколько десятков лет.

Генная инженерия - это область биотехнологий, включающая в себя действия по перестройке генотипов. Уже сегодня генная инженерия позволяет включать и выключать отдельные гены, контролируя таким образом деятельность организмов, а также - переносить генетические инструкции из одного организма в другой, в том числе – организмы другого вида. По мере того, как генетики всё больше узнают о работе генов и белков, всё более реальной становится возможность произвольным образом программировать генотип (прежде всего, человеческий), с лёгкостью достигая любых результатов: таких, как устойчивость к радиации, способность жить под водой, способность к регенерации повреждённых органов и даже бессмертие.

Генетическая (генная) инженерия

Генетическая (генная) инженерия – конструирование искусственным путем генетических структур и наследственно измененных организмов. Генетическая инженерия – раздел (прикладная ветвь) молекулярной генетики, связанный с целенаправленным созданием новых молекул ДНК, способных размножаться в клетке-хозяине. При этом происходит искусственное, целенаправленное изменение генотипа организма (микроорганизма) и формирование новых признаков и свойств. Генная инженерия занимается рашифровкой структуры генов, их синтезом и клонированием, вставкой выделенных из клеток живых организмов генов в клетки растений и животных с целью направленного изменения их генетических особенностей.

Хорошо разработанными методами генной инженерии являются трансгенез, микробиологический синтез и др.

Трансгенез – перенос генов от одного вида организмов в другой. Трансгенез осуществляется путем разрезания и сшивания участков ДНК при участии ферментов – рестриктаз и лигаз.

Этапы трансгенеза :

а) выделение генов (фрагментов ДНК) из клеток бактерий, растений или животных с помощью фермента рестриктазы ;

б) соединение (сшивание) генов (фрагментов ДНК) с плазмидой с помощью фермента лигазы ;

в) введение гибридной плазмидной ДНК, содержащей нужный ген в клетку хозяина;

г) копирование (клонирование) этого гена в клетке хозяина и обеспечение его работы по схеме: «Код ДНК – транскрипция – трансляция – белок»

Инструментами генной инженерии являются открытые в 1974 г ферменты – рестриктазы (рестрикционные эндонуклеазы). Рестриктазы узнают участки (сайты) ДНК, вносят разрезы в цепях ДНК. На концах каждого фрагмента образуются одноцепочечные хвосты, называемые «липкими концами», поскольку они могут, как бы слипаться между собой вследствие комплементарности.

Рестриктазы узнают в двухцепочечной ДНК определенную, только свою последовательность нуклеотидов ДНК. Затем рестриктаза прикрепляется к распознаваемому участку нуклеотидов и разрезает его в месте прикрепления. Чаще рестриктазы распознают в молекуле ДНК участки длиной в 4–6 пар нуклеотидов и разрезают обе цепи ДНК посередине этих участков или обычно со смещением. Примеры рестриктаз : рестриктаза Eco RI , которая узнает фрагмент ДНК из шести нуклеотидов ГААТТЦ (место разреза между нуклеотидами Г и А обеих цепей ДНК); рестриктаза Hind III распознает участок ААГЦТТ (место разреза между нуклеотидами А и А обеих цепей ДНК); рестриктаза Bam I распознает участок ГГАТЦЦ (место разреза между нуклеотидами Г и Г обеих цепей ДНК); рестриктаза Hae III распознает участок ГГЦЦ (место разреза между нуклеотидами Г и Ц обеих цепей ДНК); рестриктаза Hpa II распознает участок ЦЦГГ(место разреза между нуклеотидами Ц и Ц обеих цепей ДНК).

Далее для конструирования генетически измененного организма необходимо ввести нужный ген в клетку этого организма. Введение чужеродных генов в организм осуществляется с помощью плазмидного вектора . Вектором является плазмида – маленькая кольцевая молекула ДНК, которую извлекают из цитоплазмы бактериальной клетки. Плазмиды – факторы наследственности, расположенные вне хромосом, представляющие собой внехромосомную ДНК .

Рис . 37.

А – Схема введения чужеродной ДНК в бактериальную плазмиду с использованием ферментов (рестрикционной эндонуклеазы и лигазы).

Б – Схема переноса гена человека, ответственного за синтез гормона инсулина и образование векторной ДНК.

Свойства плазмиды: 1) обладает способностью к автономной репликации; 2) содержит гены, кодирующие антибиотики; 3) способны встраиваться в хромосому клетки-реципиента; 4) распознает участки ДНК, которые могут разрезать ферменты - рестриктазы; 5) рестриктаза может разрезать плазмиду и переводить ее в линейное состояние. Эти свойства плазмиды исследователи используют для получения рекомбинантных (гибридных) ДНК.

Последовательность введения ДНК в плазмиду (плазмидный вектор) с помощью фермента рестриктазы (рис. 37 А):

1) рестрикция – разрезание молекулы ДНК рестриктазой, образование фрагментов ДНК и выделение необходимого гена ;

2) включение выделенного гена в плазмиду , т. е. получение рекомбинантной (гибридной) ДНК путем введения фрагмента чужеродной ДНК в плазмиду;

3) лигирование – сшивание ферментом лигазой плазмидного (векторного) и чужеродного фрагментов ДНК; при этом концы векторной и чужеродной ДНК (т. н. «клейкие концы») комплементарны друг другу;

4) трансформация – введение рекомбинантной плазмиды в геном другой клетки (клетки-реципиента), в частности, бактериальной клетки.

Следует отметить, что плазмиды проникают лишь в часть обработанных бактерий. Трансформированные бактерии вместе с плазмидами приобретают устойчивость к определенному антибиотику, что позволяет их отделить от нетрансформированных, погибающих на среде, содержащей антибиотик. Каждая из трансформированных бактерий, помещенная на питательную среду, размножается и образует колонию из многих тысяч потомков – клон.

5) скрининг – отбор среди трансформированных бактерий тех, которые содержат плазмиды с нужным геном.

Трансгенные животные и растения

Клонированные гены с помощью микроинъекции вводят в яйцеклетку млекопитающих или протопласты растений (изолированная клетка, лишенная клеточной стенки) и далее из них выращивают животных, или растения, в геноме которых действуют чужеродные гены. Растения и животные, геном которых изменен путем генноинженерных операций, получили название трансгенных организов (трансгенных растений и животных) , поскольку в нем содержатся чужеродные гены. Получены трансгенные мыши, кролики, свиньи, овцы. В их геноме работают гены бактерий, млекопитающих, человека. Получены трансгенные растения (кукуруза, перец, томаты, пшеница, рожь, бобовые, картофель и др.), содержащие гены неродственных видов. Трансгенные растения устойчивы к гербицидам, насекомым, неблагоприятным погным условиям и др. Постепенно решается проблема изменения наследственности многих сельскохозяйственных растений.

Генетическая карта хромосом. Генная терапия

Генетической картой хромосом называют схему взаимного расположения генов, находящихся в одной группе сцепления. Такие карты составляются для каждой пары гомологичных хромосом. На генетической карте указан порядок расположения генов в хромосоме и расстояния между ними (процент кроссинговера между определенными генами). Так создание новых штаммов микроорганизмов, способных синтезировать гормоны, белки, лекарственные препараты основывается на знании генетических карт микроорганизмов. Генетические карты человека необходимы для медицинской генетики. Знания о локализации гена в определенной хромосоме используются при диагностике ряда наследственных заболеваний, а также в генной терапии для исправления структуры и функции генов.

Генная терапия – замена дефектных генов на неповрежденные, или исправление их структуры.

Для борьбы с наследственными, онкологическими и возрастными заболеваниями разрабатываются методы генной терапии, безопасные для клеток человека. С использованием методов генной терапии можно заменять в организме дефектные гены, в которых произошли точковые мутации, на неповрежденные. В наше время ученые осваивают методы биобезопасности человека: внедрение нужных генов в клетки организма человека. Это позволит избавиться от многих наследственных заболеваний.

Микробиологический синтез

Методы генной инженерии позволили осуществить микробиологический синтез (рис. 37 Б). С помощью методов генной инжененрии микробиологи смогли получить штаммы бактерий, благодаря которым успешно осуществляется микробиологический синтез. Для этого производится отбор необходимых бактериальных клеток, не содержащих плазмид. Выделяются молекулы ДНК с заданной последовательностью нуклеотидов, определяющих развитие нужного признака. Плазмида с встроенным участком ДНК (геном) вводится в бактериальную клетку, в которой встроенный участок ДНК начинает работать (идут процессы репликации, транскрипции, трансляции), и в бактериальной клетке синтезируется нужный белок (интерферон, генферон, иммуноглобулин, инсулин, соматотропин и др.). В промышленных количествах получены гормоны (инсулин, соматотропин), многие аминокислоты, антибиотики, вакцины и др. Такие бактерии размножают в промышленных масшабах и производят необходимый белок.

С помощью генетических методов получен штамм микроорганизма Pseudomonas denitrificans, который производит в десятки раз больше витамина C, витаминов группы B, чем исходная форма; новый штамм бактерии микрококкус глутамикус выделяет в сотни раз больше аминокислоты лизина, чем исходная (дикая) культура лизинобразующей бактерии.

Клеточная инженерия

Клеточная инженерия – культивирование отдельных клеток или тканей на специальных искусственных средах, разработка методов создания клеток нового типа путем их гибридизации, замены хромосом и выращивание из них гибридов.

1. Метод культуры тканей

Метод заключается в культивировании изолированных клеток или кусочков тканей на искусственной питательной среде в соответствующих микроклиматических условиях. В результате культивирования растительные клетки или кусочки ткани регенерируют в целое растение. Путем микроклонального размножения отдельных клеток, или кусочков тканей (чаще верхушечной меристемы стебля или корня) можно получить множество полезных растений. Микроклиматические условия и питательные среды для регенерации декоративных, культурных, лекарственных растений подбираются экспериментально. Культура тканей также используется для получения диплоидных растений после обработки исходных гаплоидных форм колхицином.

2. Соматическая гибридизация

Соматическая гибридизация включает получение гибридных клеток, а из них – новых форм; искусственное оплодотворение яйцеклеток.

Получение новых гибридных растений путемслияния протопластов (ядро и цитоплазма) различных клеток в культуре тканей. Для слияния протопластов с помощью ферментов разрушают стенку растительной клетки и получают изолированный протопласт. При культивировании таких протопластов разных видов растений осуществляется их слияние и образование форм с новыми полезными признаками. Искусственное оплодотворение яйцеклеток осуществляют посредством метода экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), позволяющего произвести оплодотворение яйцеклеток в пробирке с последующей имплантацией эмбриона на ранней стадии развития, и преодолеть некоторые формы бесплодия у человека.

3. Хромосомная инженерия – замена отдельных хромосом в клетках растений или добавление новых. У диплоидов имеются пары гомологичных хромосом, и такие организмы называются дисомики. Если в одной какой-либо паре оставить одну хромосому, то формируется моносомик. Если добавить в какую-либо пару третью гомологичную хромосому, то формируется трисомик и т. д. Возможна замена отдельных хромосом одного вида на хромосомы другого вида. Полученные формы называются замещенными .

С помощью которых осуществляется направленное комбинирование генетической информации любых организмов. Генетическая инженерия (Г. и.) позволяет преодолевать природные межвидовые барьеры, препятствующие обмену генетической информацией между таксономически удалёнными видами организмов и создавать клетки и организмы с несуществующими в природе сочетаниями генов, с заданными наследуемыми свойствами.

Главным объектом генно-инженерного воздействия является носитель генетической информации - дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), молекула которой обычно состоит из двух цепей. Строгая специфичность спаривания пуриновых и пиримидиновых оснований обусловливает свойство комплементарности - взаимного соответствия нуклеотидов в двух цепях. Создание новых сочетаний генов оказалось возможным благодаря принципиальному сходству строения молекул ДНК у всех видов организмов, а фактическая универсальность генетич. кода делает возможной экспрессию чужеродных генов (проявление их функциональной активности) в любых видах клеток. Этому способствовало также накопление знаний в области химии , выявление молекулярных особенностей организации и функционирования генов (в т.ч. установление механизмов регуляции их экспрессии и возможности подчинения генов действию «чужих» регуляторных элементов), разработка методов секвенирования ДНК, открытие полимеразной цепной реакции, позволившей быстро синтезировать любой фрагмент ДНК.

Важными предпосылками для появления Г.и. явились: открытие плазмид, способных к автономной репликации и переходу из одной бактериальной клетки в другую, и явления трансдукции - переноса некоторых генов бактериофагами , что позволило сформулировать представление о векторах - молекулах-переносчиках генов.

Огромное значение в развитии методологии Г.и. сыграли ферменты, участвующие в преобразовании нуклеиновых кислот: рестриктазы (узнают в молекулах ДНК строго определенные последовательности (сайты) и «разрезают» двойную цепь в этих местах), ДНК-лигазы (ковалентно связывают отдельные фрагменты ДНК), обратная транскриптаза (синтезирует на матрице РНК комплементарную копию ДНК, или кДНК) и др. Только при их наличии создание искусств. структур стало технически выполнимой задачей. Ферменты используются для получения индивидуальных фрагментов ДНК (генов) и создания молекулярных гибридов - рекомбинантных ДНК (рекДНК) на основе ДНК плазмид и вирусов . Последние доставляют нужный ген в клетку хозяина, обеспечивая там его размножение (клонирование) и образование конечного продукта гена (его экспрессию).

Принципы создания рекомбинантных молекул ДНК

Термин «Г. и.» получил распространение после того, как в 1972 П. Бергом с сотр. впервые была получена рекомбинантная ДНК, представлявшая собой гибрид, в котором были соединены фрагменты ДНК бактерии кишечной палочки, её вируса (бактериофага λ) и ДНК обезьяньего вируса SV40. В 1973 С. Коэн с сотр. использовали плазмиду pSC101 и рестриктазу (Eco RI), которая разрывает её в одном месте таким образом, что на концах двухцепочечной молекулы ДНК образуются короткие комплементарные одноцепочечные «хвосты» (обычно 4-6 нуклеотидов). Их назвали «липкими», поскольку они могут спариваться (как бы слипаться) друг с другом. Когда такую ДНК смешивали с фрагментами чужеродной ДНК, обработанной той же рестриктазой и имеющей такие же липкие концы, получались новые гибридные плазмиды, каждая из которых содержала по крайней мере один фрагмент чужеродной ДНК, встроенной в Eco RI-сайт плазмиды. Стало очевидным, что в такие плазмиды можно встраивать фрагменты разнообразных чужеродных ДНК, полученных как из микроорганизмов, так и из высших эукариот.

Основная современная стратегия получения рекДНК сводится к следующему:

в ДНК плазмиды или вируса, способных размножаться независимо от хромосомы , встраивают принадлежащие др. организму фрагменты ДНК, содержащие определ. гены или искусственно полученные последовательности нуклеотидов, представляющие интерес для исследователя;
образующиеся при этом гибридные молекулы вводят в чувствительные прокариотические или эукариотические клетки, где они реплицируются (размножаются, амплифицируются) вместе со встроенными в них фрагментами ДНК;
отбирают клоны клеток в виде колоний на специальных питательных средах (или вирусов - в виде зон просветления - бляшек на слое сплошного роста клеток бактерий или культур тканей животных), содержащие нужные типы молекул рекДНК и подвергают их разностороннему структурно-функциональному изучению.

Для облегчения отбора клеток, в которых присутствует рекДНК, используют векторы, содержащие один и более маркеров. У плазмид, например, такими маркерами могут служить гены устойчивости к антибиотикам (отбор клеток, содержащих рекДНК, проводят по их способности расти в присутствии того или иного антибиотика). РекДНК, несущие нужные гены, отбирают и вводят в реципиентные клетки. С этого момента начинается молекулярное клонирование - получение копий рекДНК, а значит и копий целевых генов в её составе. Только при возможности разделения всех трансфицированных или инфицированных клеток каждый клон будет представлен отдельной колонией клеток и содержать определ. рекДНК. На заключительном этапе производится идентификация (поиск) клонов, в который заключён нужный ген. Она основывается на том, что вставка в рекДНК детерминирует какое-то уникальное свойство содержащей его клетки (напр., продукт экспрессии встроенного гена). В опытах по молекулярному клонированию соблюдаются 2 основных принципа:

ни одна из клеток, где происходит клонирование рекДНК, не должна получить более одной плазмидной молекулы или вирусной частицы;
последние должны быть способны к репликации.

В качестве векторных молекул в Г.и. используется широкий спектр плазмидных и вирусных ДНК. Наиболее популярны клонирующие векторы, содержащие несколько генетич. маркеров и имеющие по одному месту действия для разных рестриктаз. Таким требованием, напр., лучше всего отвечает плазмида pBR322, которая была сконструирована из исходно существующей в природе плазмиды с помощью методов, применяемых при работе с рекДНК; она содержит гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину, содержит по одному сайту узнавания для 19 разных рестриктаз. Частным случаем клонирующих векторов являются экспрессирующие векторы, которые наряду с амплификацией обеспечивают правильную и эффективную экспрессию чужеродных генов в реципиентных клетках. В ряде случаев молекулярные векторы могут обеспечивать интеграцию чужеродной ДНК в геном клетки или вируса (их называют интегративными векторами).

Одна из важнейших задач Г.и. - создание штаммов бактерий или дрожжей, линий клеток тканей животных или растений, а также трансгенных растений и животных (см. Трансгенные организмы), которые обеспечивали бы эффективную экспрессию клонируемых в них генов. Высокий уровень продукции белков достигается в том случае, если гены клонируются в многокопийных векторах, т.к. при этом целевой ген будет находиться в клетке в большом количестве. Важно, чтобы кодирующая последовательность ДНК находилась под контролем промотора, который эффективно узнаётся РНК-полимеразой клетки, а образующаяся мРНК была бы относительно стабильной и эффективно транслировалась. Кроме того, чужеродный белок, синтезируемый в реципиентных клетках, не должен подвергаться быстрой деградации внутриклеточными протеазами. При создании трансгенных животных и растений часто добиваются тканеспецифичной экспрессии вводимых целевых генов.

Поскольку генетич. код универсален, возможность экспрессии гена определяется лишь наличием в его составе сигналов инициации и терминации транскрипции и трансляции, правильно узнаваемых хозяйской клеткой. Т.к. большинство генов высших эукариот имеет прерывистую экзон-интронную структуру, в результате транскрипции таких генов образуется матричная РНК-предшественник (пре-мРНК), из которой при последующем сплайсинге выщепляются некодирующие последовательности - интроны, и образуется зрелая мРНК. Такие гены не могут экспрессироваться в клетках бактерий, где отсутствует система сплайсинга. Для того чтобы преодолеть это препятствие на молекулах зрелой мРНК с помощью обратной транскриптазы синтезируют ДНК-копию (кДНК), к которой с помощью ДНК-полимеразы достраивается вторая цепь. Такие фрагменты ДНК, соответствующие кодирующей последовательности генов (уже не разделённой интронами), можно встраивать в подходящий молекулярный вектор.

Зная аминокислотную последовательность целевого полипептида, можно синтезировать кодирующую его нуклеотидную последовательность, получив т.н. ген-эквивалент, и встроить его в соответствующий экспрессирующий вектор. При создании гена-эквивалента обычно учитывают свойство вырожденности генетич. кода (20 аминокислот кодируются 61 кодоном) и частоту встречаемости кодонов для каждой аминокислоты в тех клетках, в которые планируется вводить этот ген, т.к. состав кодонов может существенно отличаться у разных организмов. Правильно подобранные кодоны могут значительно повысить продукцию целевого белка в реципиентной клетке.

Значение генетической инженерии

Г.и. значительно расширила экспериментальные границы , поскольку позволила вводить в разл. типы клеток чужеродную ДНК и исследовать её функции. Это позволило выявлять общебиологич. закономерности организации и выражения генетич. информации в разл. организмах. Данный подход открыл перспективы создания принципиально новых микробиологич. продуцентов биологически активных веществ. а также животных и растений, несущих функционально активные чужеродные гены. Мн. ранее недоступные биологически активные белки человека, в т.ч. интерфероны, интерлейкины, пептидные гормоны, факторы крови стали нарабатываться в больших количествах в клетках бактерий, дрожжей или млекопитающих, и широко использоваться в медицине. Более того, появилась возможность искусственно создавать гены, кодирующие химерные полипептиды, обладающие свойствами двух или более природных белков. Все это дало мощный импульс к развитию биотехнологии .

Глвными объектами Г.и. являются бактерии Escherichia coli (кишечная палочка) и Bacillus subtilis (сенная палочка), пекарские дрожжи Saccharomices cerevisiae , разл. линии клеток млекопитающих. Спектр объектов генно-инженерного воздействия постоянно расширяется. Интенсивно развиваются направления исследований по созданию трансгенных растений и животных. Методами Г.и. создаются новейшие поколения вакцин против различных инфекционных агентов (первая из них была создана на основе дрожжей, продуцирующих поверхностный белок вируса гепатита В человека). Большое внимание уделяется разработке клонирующих векторов на основе вирусов мле-копитающих и использованию их для создания живых поливалентных вакцин для нужд ветеринарии и медицины, а также в качестве молекулярных векторов для генной терапии раковых опухолей и наследственных заболеваний. Разработан метод прямого введения в организм человека и животных рекДНК, направляющих продукцию в их клетках антигенов разл. инфекционных агентов (ДНК-вакцинация). Новейшим направлением Г.и. является создание съедобных вакцин на основе трансгенных растений, таких как томаты, морковь, картофель, кукуруза, салат и др., продуцирующих иммуногенные белки возбудителей инфекций.

Опасения, связанные с проведением генно-инженерно экспериментов

Вскоре после первых успешных экспериментов по получению рекДНК группа учёных во главе с П. Бергом предложила ограничить проведение ряда генно-инженерных опытов. Эти опасения основывались на том, что свойства организмов, содержащих чужую генетич. информацию, трудно предсказать. Они могут приобрести нежелательные признаки, нарушить экологич. равновесие, привести к возникновению и распространению необычных заболеваний человека, животных, растений. Кроме того отмечалось, что вмешательство человека в генетич. аппарат живых организмов аморально и может вызвать нежелательные социальные и этические последствия. В 1975 эти проблемы обсуждались на междунар. конференции в Асиломаре (США). Её участники пришли к заключению о необходимости продолжения использования методов Г.и. но при обязательном соблюдении определ. правил и рекомендаций. Впоследствии эти правила, установленные в ряде стран, были существенно смягчены и свелись к приёмам обычным в микробиологич. исследованиях, созданию спец. защитных устройств, препятствующих распространению биологич. агентов в окружающей среде, использованию безопасных векторов и реципиентных клеток, не размножающихся в природных условиях.

Часто под Г.и. понимают только работу с рекДНК, а как синонимы Г.и. используются термины «Молекулярное клонирование», «Клонирование ДНК», «Клонирование генов». Однако все эти понятия отражают содержание лишь отдельных генно-инженерных операций и поэтому не эквивалентны термину Г.и. В России как синоним Г.и. широко используется термин «генная инженерия». Однако смысловое содержание этих терминов различно: Г.и. ставит целью создание организмов с новой генетич. программой, в то время как термин «генная инженерия» поясняет как это делается, т.е. путём манипуляции с генами.

Литература

Щелкунов С.Н. Клонирование генов. Новосибирск, 1986; Уотсон Дж ., Туз Дж ., Курц Д. Рекомбинантные ДНК: Краткий курс. М., 1986; Клонирование ДНК. Методы М., 1988; Новое в клонировании ДНК: Методы М., 1989. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. 2-е изд., Новосибирск, 2004.

Генетическая инженерия и современная биотехнология возникли в результате развития микробиологии, генетики и биохимии. Достижения молекулярной биологии, молекулярной генетики, биологии клетки, а также вновь открытые эксперимен-тальные методы и новое оборудование обеспечили немыслимые темпы развития генетической инженерии и биотехнологии.

Цель генной инженерии

Целью генной инженерии является изменение строения генов, их расположения в хромосоме и регулирование их деятельности в со-ответствии с потребностями человека. Для достижения этой цели применяются различные методы, позволяющие осуществлять в про-мышленных масштабах производство белков, создавать новые сорта растений и породы животных, наиболее отвечающие требованиям, диагностировать и лечить различные инфекционные и наследствен-ные болезни человека.

Объектами исследования генетической инженерии являются вирусы, бактерии, грибы , животные (в том числе организм человека) и растительные клетки. После очищения молекулы ДНК этих живых существ от других веществ клетки материальные различия между ними исчезают. Очищенная молекула ДНК может быть расщеплена с помощью энзимов на специфические отрезки, которые затем при необходимости можно с помощью сшивающих энзимов соединить между собой. Современные методы генетической инженерии позволяют размножать любой отрезок ДНК или заменять любой нуклеотид в цепи ДНК другим. Разумеется, эти успехи достигнуты в результате последовательного изучения закономерностей наследственности.

Генетическая инженерия (генная инженерия) возникла в результате открытия энзимов, специфическим образом разделяющих материальную основу наследственности — молекулу ДНК на отрезки и соединяющих эти отрезки концами друг с другом, а также электрофоретического метода, позволяющего с высокой точностью разделять по длине отрезки ДНК. Создание методов и оборудования для определения специфической последовательности нуклеотидов, образующих молекулу ДНК, а также для автоматического синтеза любого желаемого отрезка ДНК обеспечило развитие генетической инженерии быстрыми темпами.

Развитию у учёных стремления управлять наследст-венностью способствовали доказательства, свидетельствующие о том, что основу наследственности всех растений и животных составляет молекула ДНК, что бактерии и фаги также подчиняются законам наследст-венности, что мутационный процесс является общим для всех живых существ и может регулироваться экспериментальными методами.

Луи Пас-тер

Вели-кий французский учёный Луи Пас-тер, разработав метод получения клонов, первым показал, что бак-терии разнообразны, обладают нас-ледственностью и их свойства тесно связаны с последней (рис. 1, 2).

Туорт и Д’Эррель

В 1915 г. Туорт и Д’Эррель доказали, что фаги (фаги — вирусы, размножающиеся в бактериях), самопроизвольно размножаясь внутри бактерий, могут их уничтожить. Микробиологи возлагали надежды на использование фагов против микробов — возбудителей опасных инфекционных заболеваний. Однако бактерии обладают устойчивостью к фагам вследствие само-произвольных спонтанных мутаций. Наследование этих мутаций предохраняет бактерии от уничтожения со стороны фагов.

Размножаясь внутри клетки, вирусы и фаги могут погубить её или, внедрившись в геном клетки, изменить её наследственность. Для изменения наследственности организма широко используются процессы трансформации и трансдукции .

Джошуа и Эстер Ледерберги

В 1952 г. Джошуа и Эстер Ледерберги, используя метод копирования (репликации) колоний бактерий, до-казали существование самопроиз-вольных мутаций в бактериях (рис. 3). Они разработали метод, позволяющий выделять мутантные клетки с помощью репликации. Под влиянием внешней среды частота мутаций возрастает. Специальные методы позволяют увидеть невооружённым глазом клоны новых штаммов , образовавшихся в результате мутаций.

Метод репликации колоний бактерий осуществляется следующим образом. Стерилизованную бархатную ткань натягивают на поверхность деревянного приспособления и прик-ладывают к колонии бактерий, рас-тущих на поверхности чашки Петри, предназначенной для пересадки реп-лик. Затем колонии переносят в чистую чашку Петри с искусствен-ной питательной средой . Материал с сайта

Этапы генной инженерии

Генная инженерия осуществляется в несколько этапов.

Определяют ген, представляющий интерес по его функциям, затем его выделяют, клонируют и изучают его структуру.
Выделенный ген соединяют (рекомбинируют) с ДНК какого-нибудь фага, транспозона или плазмиды , имеющей способность рекомбинироваться с хромосомой, и таким путём создают век-торную конструкцию.
Векторную конструкцию встраивают в клетку (транс¬формация) и получают трансгенную клетку.
Из трансгенной клетки в искусственных условиях можно полу¬чить зрелые организмы.