Borrelia, IgM клас антитела чрез Western blot метод (anti-Borrelia IgM, Western blot). Western blot (Western blot, протеинов имуноблот, Western blot) Грешки при изпълнение на Western blot

Попиване(от английски " петно" - място) - прехвърляне на NK, протеини и липиди към твърд субстрат, например мембрана и тяхното обездвижване.

Методи за разделяне на молекули за блотиране:

електрофореза в полиакриламиден гел:

изоелектрично фокусиране - за разделяне на протеини по изоелектрична точка (pI);
двумерна (2D) електрофореза - за разделяне на протеини в две посоки - по изоелектрична точка и по молекулно тегло;
Електрофореза в агарозен гел - NC разделяне:

тънкослойна хроматография - отделяне на липиди от липидни комплекси.

Методи за прехвърляне:

дифузия на молекули - бавен транспорт, често използван за липиди;
капилярно попиване - мембраната се притиска към гела, върху нея се поставя купчина филтърна хартия, трансферният буфер овлажнява гела и се повдига под действието на капилярни сили, намокряйки филтърната хартия и пренасяйки макромолекулите от гела към гела мембрана; може да се извърши капилярно попиване:

вакуумно попиване - подобно на капилярно попиване, но трансферът се ускорява чрез използване на вакуум вместо капилярните сили, създадени от намокряне на филтърната хартия;
електроблотинг - прехвърлянето на заредени макромолекули към мембраната става под въздействието на електрически ток;
"пришиване" на НК към мембраната под действието на UV лъчение или нагряване - за окончателно фиксиране върху найлонови мембрани;
дот блотинг (слот блотинг) - пробата се нанася под формата на точка или тире директно върху мембраната без предварително разделяне на молекулите в гела или върху тънкослойната плака.

Видове мембрани:

PVDF мембрани (поливинилиден флуорид);
NC мембрани (нитроцелулоза);
найлонови мембрани (използвани за NDT).

Методи за маркиране и откриване на макромолекули върху мембраната:

оцветяване - свързване на багрилото (сребърни йони, кумаси, понсо, етидиев бромид) директно с откриваеми макромолекули;
имунохимично маркиране - маркирането на макромолекули възниква поради специфично свързване на белязани антитела с тях, откриването се извършва:

радиационно маркиране - радиационните етикети (радиоизотопи) се въвеждат в макромолекулите, откриването се извършва с помощта на:

хибридизация - свързване на нуклеинови киселини с белязани олигонуклеотиди с комплементарна структура, откриването, като правило, се извършва чрез записване на излъчване на радиация или флуоресценция на етикета;
масспектрометрия - използва се за директен структурен анализ на липиди.

Приети имена на разновидности на попиване:

Southern blotting(Southern blotting) - на името на Едуин Саутърн, който предлага метод - определяне на ДНК последователността в проба и определяне на броя на копията на гените в геномната ДНК. Трансферът към мембраната се предшества от смилане на пробата с рестрикционни ендонуклеази на фрагменти и тяхното фракциониране чрез електрофореза в агарозен гел. Мембранният анализ се извършва чрез хибридизация с белязани олигонуклеотиди с известна последователност;
Northern blotting- определяне на РНК последователността в пробата и изследване на генната експресия (определяне на иРНК). Подобно на Southern blotting, но се изследват РНК молекули, изолирани от пробата, без разцепване от ендонуклеази. Разделянето на молекулите се извършва в агарозен гел с добавяне на формалдехид (за денатуриране на РНК) или в полиакриламиден гел с добавяне на урея (използван за микроРНК анализ). Имобилизирането на молекулите на РНК върху мембраната възниква поради нагряване под вакуум или "шиене" с помощта на UV лъчение;
уестърн блотинг- протеинов имуноблотинг - аналитичен метод, използван за определяне на специфични протеини в проба. Трансферът към мембраната се предхожда от отделяне на протеини в полиакриламиден гел. Анализът на протеините на мембраната се извършва имунохимично;
far western blotting- протеиново блотиране, използвано за определяне на протеин-протеинови взаимодействия, подобно на Western blotting, но вместо антитела се използват други протеини, които се свързват специфично с изследвания протеин;
югозападно попиване- определяне на ДНК-свързващи протеини и протеин-свързващи места в ДНК молекули - подобно на Western blotting, но след денатурираща полиакриламидна гел електрофореза, протеините се отмиват от натриев додецилсулфат в присъствието на урея и се прехвърлят към нитроцелулозна мембрана поради дифузия . Като проба се използват белязани ДНК фрагменти с различна дължина, получени чрез разцепване на по-голям изследван фрагмент от геномна ДНК. След това свързаните ДНК молекули се измиват от всеки комплекс протеин-ДНК и се анализират чрез електрофореза в полиакриламиден гел;
Източно попиване- определяне на посттранслационни модификации на протеини (липиди, гликополизахариди, фосфатни остатъци, свързани с тях) - подобно на Western blotting, но антителата се използват не към протеини, а към липиди, гликополизахариди и др. Също така, в допълнение към антителата, други протеинови молекули, които се свързват с изследваните (например лектин), се използват като проби;
Далекоизточно попиване- анализ на липиди, разделени чрез високоефективна тънкослойна хроматография. Прехвърлянето към мембраната, като правило, се извършва чрез дифузия. Регистрацията се извършва чрез директен мас-спектрометричен структурен анализ.

След като ДНК, РНК или протеините са разделени, те трябва да бъдат прехвърлени в твърда опора за откриване и други операции, които са трудни в гел. Процесът на прехвърляне, водещ до обездвижване на молекули , т.е. фиксация в неподвижно състояние се нарича попиване (на английски. - попиване ). Като субстрат се използват найлонови или нитроцелулозни мембрани.

Попиване(от англ. blotting - попиване) е метод за прехвърляне на електрофоретични ДНК фрагменти върху специален филм (мембрана) от нитроцелулоза, който свързва (имобилизира) едноверижни ДНК молекули.

Southern blotting(по името на автора, който го е предложил) се основава на движението на ДНК фрагменти поради капилярния ефект. Процесът на прехвърляне на ДНК фрагменти в агарозен гел върху нитроцелулозен филм с помощта на филтърна хартия е подобен на попиване.

Анализът се извършва, както следва:

– Изолираната, пречистена, денатурирана и фрагментирана ДНК се поставя върху лист от агарозен гел, където фрагментите се разделят електрофоретично по маса и заряд.

– Лист от агарозен гел се поставя върху филтърна хартия, навлажнена с концентриран физиологичен (буферен) разтвор.

- След това върху гела се нанася нитроцелулозен филтър, където се извършва имобилизация (или адсорбция, или фиксация) на едноверижни ДНК фрагменти.

- Купчина листове суха филтърна хартия се поставя върху филтъра, което осигурява бавен поток на буферния разтвор през гела (т.е. служи като вид капилярна помпа). Физиологичният разтвор, преминавайки през агарозния гел, носи по себе си ДНК фрагменти, които се задържат от нитроцелулозата и се свързват с нея, а разтворът се абсорбира от суха филтърна хартия.

– След това ДНК се денатурира с основа и филтърът се държи във вакуум при температура 80 0 С, в резултат на което едноверижни ДНК фрагменти се имобилизират (фиксират) необратимо върху нитроцелулоза. В този случай разположението на имобилизираните ДНК ленти точно съответства на местоположението им в гела.

– Свързаната с филтъра ДНК се поставя в разтвор с белязана ДНК сонда, в която настъпва хибридизация. Само комплементарни на него ДНК фрагменти ще хибридизират (образуват водородни връзки) със специфична сонда, която може да бъде открита като светли ивици върху рентгенов филм, т.е. автограф на нитроцелулозен филтър

точково попиване. За да се приготвят точкови петна, ДНК или РНК препаратът се нанася директно върху филтъра. Капчиците от лекарството изглеждат като точки върху филтъра, което обяснява името на вида блотиране (английска точка - точка). 1) Фрагменти с дължина 5–10 базови двойки се образуват от геномна ДНК, предварително обработена с ултразвук.

2) За да направят ДНК или РНК проби достъпни за сондата, те трябва да бъдат денатурирани, т.е. превърнати в едноверижна форма. Това се случва под въздействието на температура от 100 ° C.

3) Денатурираните нуклеинови киселини се инкубират върху лед: бързото понижаване на температурата предотвратява тяхната ренатурация, т.е. допълващо сдвояване на вериги. Денатурираната ДНК или РНК се нанася директно върху филтъра, който се инкубира в разтвора, съдържащ сондата.

4) За да не се разтвори анализираната нуклеинова киселина, тя трябва да бъде фиксирана върху филтъра (мембрана). За това се използват два вида филтри: нитроцелулоза и найлон.

За имобилизиране на нуклеинови киселини върху нитроцелулозен филтър се използва пържене при 80 ° C във вакуум, а върху найлонов филтър се използва UV облъчване за 3-5 минути.

5) След инкубиране на препарата от нуклеинова киселина с изотопно белязана проба се извършва авторадиография в специална касета или идентификация по нерадиоактивни методи.

Точковото попиване ви позволява да отговорите само на един въпрос: има ли желана нуклеотидна последователност в дадена проба.

Northern blot анализсе прилага:

1) за изолиране и анализ на РНК (например, за да се установи дали иРНК, прочетена от даден ген, присъства в даден тип клетка, т.е. дали генът се експресира или не;

2) да се определи количеството на тази РНК и нейните промени в развитието на даден тип клетка;

3) за определяне на размера на транскрипта на някакъв ген.

В този случай РНК молекулите, изолирани от клетка, се разделят по размер с помощта на гел електрофореза и след това се прехвърлят във филтър. След хибридизация с белязана едноверижна сонда се идентифицират местата на хибридизация (хомология) на РНК и сондата.

Ако нуклеотидната последователност на желания ген (или иРНК) не е известна, но протеинът, чийто синтез той контролира, е известен, тогава може да се изолира малко количество чист протеин, може да се определи аминокиселинната последователност на някои от неговите части ( познаването на 5-6 аминокиселинни остатъка е достатъчно). С помощта на таблицата на генетичния код е възможно да се установят всички възможни нуклеотидни последователности в този участък от иРНК (или самия ген), който кодира дадена аминокиселинна последователност. В този случай може да се синтезира сонда за търсене на желаните клонове в генната библиотека.

Western blottinЖ(immunoelectroblotting, protein blotting) е метод за идентифициране на уникални протеини. Основава се на феномена на високо специфично взаимодействие антиген-антитяло. Така антигенът (мишената) е протеинът, който се определя, а сондата е антитялото към него.

Антителата към изследвания протеин се получават по различни начини. Най-простият е въвеждането на пречистена протеинова проба в кръвния поток на лабораторно животно (обикновено заек). В тялото му се произвеждат антитела (имуноглобулини) към този чужд протеин. Това са първичните антитела, които ще взаимодействат с целевия протеин.

Въпреки това, не би било рационално да се въведе етикет за идентификация директно в тези антитела. За да се открият различни протеини, би било необходимо да се маркират различни антитела, което би довело до тяхната висока цена. Оказа се, че е по-разумно да се използва универсални антитела – конюгирани анти-имуноглобулини, които всъщност са антитела срещу антитела, произведени чрез използване на идентифицируем протеин като антиген. Например, конюгирани анти-имуноглобулини към заешки Ig ще взаимодействат с всички имуноглобулини, синтезирани в заек за различни антигени. По този начин именно тези универсални вторични антитела носят изотопен или нерадиоактивен етикет. В допълнение към неизотопния етикет, който в хода на редица реакции води до образуването на неразтворимо оцветено съединение (както при блотирането на нуклеинова киселина), много често се използва хемилуминесцентен маркер с по-висока чувствителност.

1) Извличане на протеини от хомогената

2) Разделяне на протеини по молекулни тегла с помощта на SDS-електрофореза в полиакриламиден гел (PAAG). Методът на SDS електрофореза включва денатуриране на естествени протеини. Така протеинови молекули с еднакво молекулно тегло ще преминат през същия път в гела и ще се подредят под формата на лента. Тъй като в сместа присъстват протеинови молекули с различни размери, се образуват много ленти. Резултатите от електрофорезата могат да се визуализират чрез оцветяване на протеин (кумаси брилянтно синьо, амидо черно, сребристо оцветяване). Сребърното оцветяване има уникална чувствителност, която ви позволява да откриете само 0,1 ng протеин в получената лента. Това е много важно за контролиране на количеството протеин, приложен към гела.

3) Трансфер на протеини от гела към мембраната. Това се прави, защото полиакриламидът не позволява на големи имуноглобулинови молекули да дифундират към протеина. И имобилизираният върху мембраната протеин става достъпен за антителата. За разлика от блотирането на нуклеинова киселина, преносът на протеин към мембраната става под въздействието на електрически сили, т.е. в електрическо поле.

4) Полученият блот се инкубира с протеинов антисерум и след това с антиимуноглобулини. Резултатът се изобразява според използвания тип етикет.

Ограничения:

1) големият размер на изследваните фрагменти, който значително надвишава дължината на ДНК сондите и предотвратява директния молекулен анализ;

2) невъзможността за произволен избор на краищата на изследваните последователности, определени от наличието на съответните рестрикционни места в оригиналната ДНК молекула;

3) необходимостта от голямо количество добре пречистена високомолекулна геномна ДНК (поне 10 μg на реакция, което е еквивалентно на 0,5-1 ml кръв),

4) за геномна хибридизация - наличието на радиоактивни ДНК сонди с висока специфична активност от най-малко 109 импулса / min * μg), работещи за ограничен период от време, и специално оборудвана изотопна единица. В допълнение, дългото излагане на автографи значително удължава времето за получаване на резултати.

5) висока интензивност на труда изследвания

Какво е Western Blotting?

Идентифицирането на протеини в сложни смеси или екстракти от различни тъкани е един от често срещаните проблеми. Използвайки такъв инструмент като специфични антитела, е възможно да се определи изследваният протеин с минимални времеви и финансови разходи.

При Western blotting метода, на първия етап, смес от протеини се разделя чрез електрофореза в присъствието на натриев додецилсулфат (SDS), след което се прехвърля върху нитроцелулозна мембрана чрез електроблотинг. Същността на този метод се състои в това, че гелът след електрофореза се поставя върху нитроцелулозна мембрана между слоевете филтърна хартия. Така сглобеният "сандвич" се поставя в електрическо поле, така че комплексите протеин-SDS да се движат през плочата на гела и да бъдат имобилизирани (в резултат на неспецифична сорбция) върху повърхността на нитроцелулозната мембрана.

При свързването на комплекса протеин-SDS с нитроцелулозната мембрана участват предимно електрически сили, като това взаимодействие е многоточково и води до "разпръскване" на протеините по повърхността на мембраната. Така след електротрансфер се получава реплика на гела върху нитроцелулоза с протеини, подредени по същия начин, както в полиакриламидния гел.

След SDS - електрофореза, електротрансфер и сорбция на протеини от гела върху нитроцелулозна мембрана, третичната конформация на протеина е силно променена, ако по принцип е правилно да се говори за съществуването на третична структура за протеина след такова грубо третиране . Следователно, за имунохимично откриване на изследвания протеин обикновено се използват само моно- или поликлонални антитела, специфични за линейните области на протеиновата молекула. Антителата, специфични за конформационни епитопи (или места, включващи контакти между субединици), обикновено не са подходящи за използване в Western blot метода.

След протеиновия трансфер мембраната се инкубира последователно с антитела, специфични за изследвания протеин, и след това с вторични антитела, специфични за Fc фрагментите на първичните антитела, конюгирани с ензимен (или друг) етикет (фиг. 1 А). В случай, че първичните антитела, специфични за изследвания антиген, са директно конюгирани с етикета, не са необходими вторични антитела (фиг. 1 B). Имунните комплекси, образувани на мястото на локализацията на изследвания протеин, се "проявяват" с помощта на хромогенен субстрат (в зависимост от вида на етикета).

Чувствителността и специфичността на метода силно зависи от това кои антитела се използват в изследването. Използваните антитела трябва да са специфични за уникална аминокиселинна последователност, специфична само за изследвания протеин. В противен случай е възможно взаимодействие (особено в случай на груби протеинови екстракти) на антитела с няколко протеинови молекули, което от своя страна ще доведе до появата на няколко цветни ивици върху мембраната. Идентифицирането на изследвания протеин в този случай често е трудно или дори невъзможно.

Вторият важен фактор, който трябва да имате предвид при избора на антитела, е афинитетът. Колкото по-висок е афинитетът на използваните антитела, толкова по-ярко и ясно се оцветяват протеиновите ленти, толкова по-висока е чувствителността на метода. При използване на антитела с висок афинитет може да се постигне чувствителност от 1 ng и дори по-висока.

За визуализиране на резултата от взаимодействието на мембранно свързания антиген и антителата се използват вторични антитела, конюгирани с агенти, способни да дадат определен сигнал при определени условия. Обикновено като такъв агент се използва ензим (пероксидаза или фосфатаза), чийто реакционен продукт има цвят и се утаява върху мембраната под формата на неразтворима утайка. Също така е възможно да се използват флуоресцентни етикети в този метод.

Ориз. 1. Схема на имунохимично оцветяване на изследвания протеин: А - използване на вторични антитела, конюгирани с ензимен маркер; B - първичното антитяло е директно конюгирано с ензимен етикет.

Протокол:

I. Приготвяне на гел и мембрана и протеинов електротрансфер

Полиакриламидният гел след електрофореза се поставя във вана с попиващ буфер (25 mM Tris, рН 8.3, 192 mM глицин, 10% етанол). Два листа филтърна хартия, изрязани по формата на попивателната касета и навлажнени с попивателен буфер, се поставят върху частта от касетата, която ще гледа към анода. След това върху филтърната хартия се поставя нитроцелулозна мембрана, предварително навлажнена със същия буфер, като се уверява, че няма въздушни мехурчета между мембраната и хартията. След това гелът трябва внимателно да се постави върху мембраната, като отново се обръща специално внимание на липсата на въздушни мехурчета между гела и мембраната. Сандвичът се допълва от два слоя намокрена филтърна хартия, които се поставят върху повърхността на гела (фиг. 2). Полученият сандвич се захваща в касетата и се поставя между електродите, така че мембраната да гледа към анода.

Ориз. 2. Схема на електротрансфер на протеини към мембраната.

II. електротрансфер

Електротрансферът на протеини към нитроцелулозна мембрана се извършва в буфер, съдържащ 25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM глицин, 10% етанол за 30–50 минути при постоянно напрежение от 100 V. Времето за електротрансфер зависи от размера на прехвърлените протеини, колкото по-голям е протеинът, толкова по-дълго отнема прехвърлянето. Качеството на електротранспорта и подреждането на протеиновите ленти се оценява чрез оцветяване на нитроцелулозната мембрана с 0.3% Ponceau S в 1% оцетна киселина. Преди имунооцветяване, мембраната трябва да се измие няколко пъти с леко алкален воден разтвор на Tris, за да се отстрани свързаното с протеини багрило.

III. Имунохимично оцветяване на протеини, имобилизирани върху нитроцелулозна мембрана

За да се блокират местата за свързване на неспецифични антитела, мембраната се инкубира при постоянно разбъркване при стайна температура в продължение на 30 минути в PBST (за по-добро блокиране може да се използва разтвор на PBST, съдържащ 10% обезмаслено мляко на прах). След блокиране, мембраната се инкубира за един час при стайна температура при постоянно разбъркване в PBST, съдържащ 1-10 μg/ml специфични антитела. Оптималната концентрация на антитела се избира емпирично и зависи от афинитета на взаимодействието на антителата с антигена. В края на инкубацията, мембраната се промива 5 пъти с PBST и се прехвърля в разтвор на вторични антитела, конюгирани с пероксидаза от хрян. Разреждането на конюгата обикновено се посочва от производителя върху опаковката или се избира емпирично от изследователя. Инкубирайте мембраната в разтвор на вторични антитела за 1 час при непрекъснато разбъркване.

След щателно промиване (най-малко 5-6 промени на буфера), PBST мембраната се прехвърля в хромогенен субстратен разтвор, съдържащ 3 mg диаминобензидин (DAB) и 10 µl 30% водороден пероксид в 10 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6 . Инкубацията се извършва при разбъркване в продължение на 5 до 10 минути. След края на инкубацията със субстрата, мембраната трябва да се измие с PBST, да се изсуши чрез попиване с филтърна хартия и веднага да се направи електронно копие чрез сканиране в цвят. Ако мембраната изсъхне напълно, боядисаните протеинови ивици избледняват и изображението е по-малко ярко и контрастно.

Забележка: DAB е токсичен и потенциален канцероген. Работете само с гумени ръкавици!

И в други природонаучни дисциплини.

Други свързани методи използват антитела за откриване на протеини в тъкани и клетки чрез имунооцветяване и ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA). ELISA).

Western blotting е разработен в лабораторията на Джордж Старк. Джордж Старк) в Станфорд. Името Western blot е дадено на техниката от W. Neil Burnett. У. Нийл Бърнет) и е каламбур на името Southern blotting, техника за откриване на ДНК, разработена преди това от Edwin Southern. Подобен метод за откриване на РНК се нарича Northern blotting, откриването на пост-транслационни модификации на протеини се нарича Eastern blotting. Източно попиване).

приготвяне на пробата

Пробата може да бъде взета от цяла тъкан или от клетъчна култура. В повечето случаи твърдите тъкани първо се смилат механично с помощта на блендер (за проби с голям обем), с помощта на хомогенизатор (по-малки обеми) или ултразвук. В същото време бактериите, вирусите и други компоненти на околната среда също са източник на протеини.

Гел електрофореза

Протеините се разделят с помощта на електрофореза с полиакриламиден гел. Разделянето на протеини може да се извърши чрез изоелектрична точка (pI), молекулно тегло, електрически заряд или комбинация от тези параметри.

Най-разпространеният метод за разделяне на протеини е електрофорезата в полиакриламиден гел в присъствието на натриев додецилсулфат. SDS) според Laemmli. SDS индуцира денатурация на протеини и ги поддържа в денатурирано състояние; дисулфидни връзки редуциращи агенти, като дитиотреитол и меркаптоетанол, се използват за разрушаване на вторичните и третичните структури на протеините. Денатурираните полипептиди мигрират в електрическото поле през акриламидния гел към анода, като по-малките протеини се движат по-бързо и по този начин се разделят според молекулното тегло. Концентрацията на акриламид определя разделителната способност на гела - колкото по-висока е концентрацията на акриламид, толкова по-добра е разделителната способност на протеините с малко молекулно тегло. Ниската концентрация на акриламид подобрява разделителната способност за протеини с високо молекулно тегло. Възможно е също да се използва двуизмерна електрофореза (2-D). В този случай разделянето на протеините се извършва в две посоки - в съответствие с тяхната изоелектрична точка в първата посока и в съответствие с молекулното тегло - във втората.

Върху джобовете се нанасят проби върху гела. Като правило, една от "пистите" се оставя за маркери за молекулно тегло (смеси от протеини с известни маси). След прилагане на напрежението, протеините се движат в електрическото поле с различни скорости. Разлики в скоростта на напредване - електрофоретичната подвижност води до разделяне на протеините на ивици (англ. групи).

Прехвърлете върху мембраната

За да направят протеините достъпни за антитела и по-нататъшно откриване, те се прехвърлят заедно с лента от гел върху мембрана, направена от нитроцелулоза или поливинилиден флуорид (англ. PVDF). Мембраната се поставя върху гела и върху нея се поставя купчина филтърна хартия. Целият стек се поставя в трансферен буфер, който се движи нагоре по хартията чрез капилярно действие, носейки протеините със себе си. Друг метод за пренос на протеини се нарича електроблотинги използва електрически ток, който пренася протеини от гела към мембраната. Протеините се придвижват от гела към мембраната, като запазват местоположението си. В резултат на това "намокряне" (от англ. попиване) процес, протеините се задържат върху тънък повърхностен слой на мембраната за откриване. И двата варианта на мембраната се използват поради техните неспецифични протеин-свързващи свойства. Свързването с протеин се основава както на хидрофобни взаимодействия, така и на електростатични взаимодействия между мембраната и протеина. Нитроцелулозната мембрана е по-евтина от PVDF, но е много по-крехка и по-малко устойчива на повторно етикетиране.

Еднаквостта и цялостната ефективност на протеиновия трансфер от гела към мембраната може да се провери чрез оцветяване на мембраната с Coomassie blue или Ponceau S. Coomassie е най-разпространеният от двата, а Ponceau S е по-чувствителен и по-разтворим във вода, което прави последващите по-лесно измиване и етикетиране на мембраната.

блокиране

След като мембраната бъде избрана за способността й да свързва протеини, антителата и целевият протеин са избрани, трябва да се внимава да се избегне взаимодействието между мембраната и антитялото, използвано за откриване на целевия протеин (тъй като самото антитяло е протеин). Блокирането на неспецифичното свързване се постига чрез поставяне на мембраната в разреден протеинов разтвор - обикновено говежди серумен албумин (BSA) или обезмаслено сухо мляко (и двете са евтини), с малък процент детергент като Tween 20. Протеинът от разреденият разтвор се прикрепя към мембраната на всички места, където целта не е прикрепила протеин. Следователно, когато се добавят антитела, няма свободно място върху мембраната, към което те (антителата) да се прикрепят, с изключение на местата на свързване на специфични целеви протеини. Този фонов „шум“ в последния Western blot води до чисти резултати и елиминиране на фалшивите положителни резултати.

откриване

По време на процеса на откриване, мембраната е "белязана" с протеина, който представлява интерес, с модифицирано антитяло, което е свързано с репортерен ензим, който се поддържа върху подходяща подложка, което води до колориметрична реакция и придава цвят. Поради различни причини откриването се извършва на два етапа, въпреки че вече е наличен метод за откриване в една стъпка за определени приложения.

Антителата се произвеждат чрез излагане на клас гостоприемник или култура от имунни клетки на някакъв протеин (или част от него). Обикновено това е част от имунния отговор, но тук (в анализа) събраните антитела се използват като специфични и чувствителен инструмент за откриване, който директно се свързва с протеина.

След блокиране, разреден първичен разтвор на антитяло (обикновено между 0,5 и 5 µg/ml) се инкубира с мембраната и се разклаща внимателно. Обикновено разтворът се състои от буфериран солев разтвор с малък процент детергент, понякога мляко на прах или BSA. Разтворът на антитялото и мембраната могат да бъдат затворени заедно и инкубирани навсякъде от 30 минути до една нощ. Те също могат да се инкубират при различни температури, при повишени температури има по-добро свързване - както специфично (на таргетния протеин, "signal1"), така и неспецифично ("шум").

След изплакване на мембраната за отстраняване на несвързаните първични антитела, мембраната се инкубира в други антитела, които се свързват директно към клас-специфичните области на първичните антитела. Те са известни като вторични антитела и, според техните целеви свойства, обикновено се наричат "анти-миши", "анти-кози" и т.н. Антителата се получават от животински източник (или животински източници на хибридомна култура); анти-миши вторични антитела ще се свържат с повечето миши първични антитела. Това създава известни спестявания, като позволява на отделна лаборатория да използва един източник за масово производство на антитела и води до много по-възпроизводими резултати. Вторичните антитела обикновено се свързват с биотин или с репортерен ензим като алкална фосфатаза или пероксидаза от хрян. Това означава, че няколко вторични антитела могат да се свържат с едно първично и да усилят сигнала.

Най-често срещаните вторични антитела, свързани с пероксидазата на хрян, се използват за прекъсване на хемилуминесцентния агент и реакционният продукт произвежда луминисцентно лъчение пропорционално на количеството протеин. Лист от фоточувствителен фотографски филм се поставя срещу мембраната и се подлага на реакционна радиация, създавайки изображение на ивиците на антитялото върху петното. По-евтин, но по-малко чувствителен подход, използващ оцветяване с 4-хлорнафтол, смесено с 1% водороден пероксид; реакцията на пероксидния радикал с 4-хлоронафтол дава тъмнокафяв цвят, който се записва без използването на специален фото филм.

Трети алтернативен метод използва радиоактивен етикет вместо ензим, свързан с вторично антитяло, като например белязан протеин А протеин. Стафилококис радиоактивен изотоп на йод. Други методи са по-безопасни, по-бързи и по-евтини, така че радиоактивното откриване рядко се използва.

Исторически процесът на маркиране се е извършвал на две стъпки, тъй като е относително по-лесно да се произвеждат първични и вторични антитела в отделни процеси. Това дава на изследователите и компаниите огромно предимство по отношение на гъвкавостта и добавя стъпка на усилване към процеса на откриване. Като се има предвид появата на високопроизводителни протеинови анализи и ниски прагове на откриване, все още има интерес към разработването на едноетапна система за етикетиране, която позволява процесът да протича по-бързо и на по-ниска цена. Тя (система с една стъпка) изисква тагове на антитела, които биха разпознали протеина, който се изследва, и едновременно с това да носят маркер за откриване - таговете, които са най-достъпни за известните "протеинови опашки". Първо, етикетите се инкубират с мембрана в двуетапен стил с първични антитела и след това са готови за директно откриване след серия от промивания.

Анализ

След измиване на несвързаните етикети, Western blot е готов за откриване на сонди, свързани с целевия протеин. На практика не всички уестърни показват протеини само с една лента на мембраната. Приблизителният размер се изчислява чрез сравняване на оцветените ленти с маркери за молекулно тегло, добавени чрез електрофореза. Процесът ще се повтори със структурни протеини като актин или тубулин, които не се променят между експериментите. Количеството на целевия протеин зависи от количеството на контролния структурен протеин между групите. Тази техника осигурява корекция на количеството общ протеин върху мембраната в случай на грешка или непълен трансфер.

Колориметрично откриване

Методът за колориметрично откриване се основава на инкубиране на Western blot със субстрат, който реагира с репортерен ензим (като пероксидаза от хрян). пероксидаза от хрян), „седи“ върху вторичното антитяло. Разтворимото багрило се променя в неразтворима форма с различен цвят, утаявайки се до ензима и оцветявайки мембраната. Разрастването на петна се ограничава чрез измиване на разтворимото багрило. Нивото на протеин се оценява денситометрично чрез интензитет на оцветяване или спектрофотометрично.

Хемилуминесцентно откриване

Хемилуминесцентният метод за откриване се основава на инкубиране на нитроцелулозна мембрана със субстрат, който луминесцентно свети след взаимодействие с репортер на вторично антитяло. Светлината се записва от фотографски филм или CCD камера, която цифрово улавя Western blot. Изображението се анализира денситометрично, като се оценява относителното количество оцветен протеин и дава количествен резултат в единици оптична плътност. Новият софтуер позволява допълнителен анализ на данни, като например определяне на молекулно тегло, ако е използван подходящ стандарт.

Радиоактивно откриване

Радиоактивните етикети не изискват ензимни субстрати, но позволяват медицински радиографски филм да бъде поставен пред Western blot, което му позволява (филмът) да взаимодейства с етикетите и да създаде тъмни области, които съответстват на лентите на протеина, който се изследва (в изображението вдясно). Търсенето на методи за радиоактивно откриване намалява поради високата им цена, високите рискове за здравето и безопасността и алтернативите, предоставени от ECL.

Откриване на флуоресценция

Флуоресцентните етикети се възбуждат от светлина и излъчват светлина с по-голяма дължина на вълната, която се открива от фотосензори като CCD камера, оборудвана с подходящи емисионни филтри. Камерата прави цифрова снимка на Western blot, което позволява по-нататъшен анализ на получените данни, като анализ на молекулно тегло и количествен Western blot анализ.

Съдържание

- Въведение
- Решения
- лизис на пробата
- Приготвяне на пробата
- Провеждане на електрофореза
- Трансфер на протеин от PAAG към мембраната
- Мембранно оцветяване

Въведение

Western blotting е аналитичен метод, използван за определяне на специфични протеини в проба, разделена чрез електрофореза с полиариламиден гел. След това протеините от гела се прехвърлят към нитроцелулозна или PVDF мембрана, след което изследваните протеини се откриват с помощта на антитела, специфични за конкретен протеин и се развиват с помощта на вторични антитела.

Решения

Лизисен буфер
Буфер NP-40
150 mM NaCl
1,0% NP-40 (Tergitol® тип NP-40)
50 mM Tris-HCl, рН 8.0
Протеазни инхибитори

Буфер за проби (x5)
10% SDS
5% 2-меркаптоетанол
50% глицерин
0,01% бромофенол синьо
0,4 М имидазол

Проверете рН и регулирайте до рН 6,8

Разделителен буфер (долен, разделителен гел буфер)
400 тМ трис-НС1
0,1% SDS
0,01% ТЕМЕД
0,1% натриев персулфат

Трансферен буфер (полусух)
16 mM Tris-HCl
200 mM глицин
0,1% SDS
20% метанол

Проверете рН и регулирайте до рН 8,3

Буфер за блокиране
150 mM NaCl
10 mM Na2HPO4
3-5% обезмаслено мляко на прах

Промивен буфер (PBST)
150 mM NaCl
10 mM Na2HPO4
0,2% Tween-20

Проверете рН и регулирайте до рН 7,5

Проба лизис

Получаване на лизат от клетъчна култура

1. Поставете контейнера с клетки върху лед и изплакнете клетките с охладен PBS.

2. Отстранете напълно PBS разтвора, след това добавете охладен лизисен буфер (1 ml на 10 7 клетки/150 cm 2 ; 0,5 ml за 5x106 клетки/75 cm 2 ).

3. Отделете клетките от пластмасата, след което внимателно прехвърлете клетъчната суспензия в охладена центрофужна епруветка.

4. Инкубирайте епруветката със суспензията при непрекъснато разбъркване за 30 минути при +4℃.

5. Центрофугирайте суспензията при +4℃. Препоръчителната стандартна скорост е 12 000 rpm за 20 минути, но тези параметри трябва да се определят за конкретния експеримент и тип клетка.

6. Съберете получения супернатант

Приготвяне на тъканен лизат

1. Отделете част от тъканта за изследване, като използвате чисти инструменти.

2. Поставете тъканта в центрофужната епруветка. Добавете охладен лизисен буфер (0,3 ml/5 mg тъкан) към епруветката. Пробата се смила с помощта на хомогенизатор. Изплакнете остриетата на хомогенизатора с 0,2 ml охладен лизисен буфер. Добавете измиване към пробата. Избягвайте прекомерното разреждане на пробата. Минималната концентрация при натоварване е 0,1 mg / ml. Оптимален диапазон - 1-5 mg/ml

3. Инкубирайте епруветката със суспензията при непрекъснато разбъркване за 2 часа при +4 ℃

4. Центрофугирайте суспензията при 12000 rpm за 20 минути при +4 ℃

5. Съберете получения супернатант

приготвяне на пробата

1. Определете концентрацията на протеин в получените лизати.

2. Определете количеството протеин, необходимо за зареждане и добавете 4 пъти по-малко буфер към 5X пробата.

Препоръчваме да използвате възстановени и денатурирани проби

3. За да възстановите и денатурирате пробата, тя трябва да се вари в буфер за проби при +100 ℃ за 5 минути.

Провеждане на електрофореза

Поставете равни количества проби и маркер за молекулно тегло в ямките на полиакриламидния гел. Зареждането за лизата трябва да бъде 20-30 µg общ протеин, натоварването за чист протеин - 10-100 ng.
Извършете протеинова електрофореза в полиакриламиден гел

Размер на протеина	% PAAG
10-40 kDa	15 - 20 %
40-100 kDa	10 - 15 %
100-300 kDa	5 - 10 %
> 300 kDa	5 %

Възможно е използването на градиентни гелове

Трансфер на протеин от PAAG към мембраната

За трансфер може да се използва нитроцелулозна или PVDF мембрана. Активирайте PVDF мембраната, като я накиснете за 1 минута в метанол. Преди да извършите прехвърлянето, измийте го в буфера за прехвърляне. Препоръчваме използването на полусух метод за прехвърляне на протеини към мембраната. Степента на прехвърляне на протеини към мембраната може да се провери с помощта на оцветяване Ponceau S преди блокиране на мембраната.

Подгответе трансферната мембрана, както е показано.

Мембранно оцветяване

1. Изплакнете мембраната с PBS.

2. За да блокирате неспецифични места на свързване, инкубирайте мембраната в блокиращ буфер за една нощ при +4 ℃ или за 40 минути при +37 ℃ с постоянно разбъркване.

3. За да измиете мембраната, инкубирайте я 3 пъти в PBST разтвор за 5 минути при +37 ℃ с постоянно разбъркване.

4. Инкубирайте с антитела към изследвания протеин в PBS разтвор за 40 минути при +37 ℃ при постоянно разбъркване.

5. За да измиете мембраната, инкубирайте я 3 пъти в разтвор на PBST за 5 минути при +37℃ при постоянно разбъркване

6. Инкубирайте мембраната с вторични анти-видови антитела (имуноконюгати) в разтвор на PBS за 40 минути при +37 ℃ при постоянно разбъркване.

7. Измийте мембраната 5 пъти в разтвор на PBST за 5 минути при +37 ℃ с постоянно разбъркване.

8. За откриване на свързани антитела, конюгирани с пероксидаза от хрян, препоръчваме използването на DAB субстратен разтвор.