Борелија, антитела од класа IgM со методот Western blot (анти-Борелиа IgM, Western blot). Вестерн блот (вестерн блот, протеински имуноблот, вестерн блот) Грешки при извршување на вестерн блот

Блотирање(од англиски" размачкана" - место) - пренос на NK, протеини и липиди во цврста подлога, на пример, мембрана и нивна имобилизација.

• електрофореза во полиакриламид гел:
o при денатурирање услови со додавање на уреа - одвојување на кратки едноверижни NA;
o во услови на денатурирање со додавање на натриум додецил сулфат (Laemmli електрофореза) - раздвојување на протеините по молекуларна тежина;
o во природни услови - раздвојување на протеините според тродимензионалната структура;
• изоелектрично фокусирање - за одвојување на протеините по изоелектрична точка (pI);
• дводимензионална (2D) електрофореза - за одвојување на протеини во две насоки - по изоелектрична точка и по молекуларна тежина;
• Електрофореза на гел агароза - NC сепарација:
o по должината на линеарни фрагменти;
o со „суперсвиткување“ на прстенести молекули;
• тенкослојна хроматографија - одвојување на липидите од липидните комплекси.

• дифузија на молекули - бавен транспорт, често се користи за липиди;
• капиларна размачкување - мембраната се притиска на гелот, врз неа се става куп филтер-хартија, трансферниот пуфер го навлажнува гелот и се крева под дејство на капиларните сили, ја навлажнува филтер-хартијата и ги пренесува макромолекулите од гелот во мембрана; Може да се изврши капиларна размачкана:
o во комори со навлажнувачки гел пуфер - „полусув“ трансфер;
o во комори со потопување гел во пуфер;

• вакуум blotting - слично на капиларното бришење, но трансферот се забрзува со користење на вакуум наместо капиларните сили создадени со навлажнување на филтер-хартијата;
• електроблутинг - преносот на наелектризираните макромолекули до мембраната се случува под влијание на електрична струја;
• „шиење“ на NK на мембраната под дејство на УВ зрачење или загревање - за конечно фиксирање на најлонски мембрани;
• точка blotting (slot blotting) - примерокот се нанесува во форма на точка или цртичка директно на мембраната без претходно одвојување на молекулите во гелот или на TLC плочата.

• PVDF мембрани (поливинилиден флуорид);
• NC мембрани (нитроцелулоза);
• најлонски мембрани (се користи за NDT).

• боење - врзување на бојата (јони на сребро, Coomassie, Ponceau, етидиум бромид) директно со макромолекули што се откриваат;
• имунохемиско означување - означувањето на макромолекулите се јавува поради означените антитела што специфично се врзуваат за нив, се врши откривање:
o имунобоење - антителата се означени со бои, се евидентира апсорпцијата на светлина со одредена бранова должина;
o имуносорбент поврзан со ензим - антителата се означени со ензим, количината на обоен производ произведен за време на ензимската реакција (ELISA) се евидентира;
o хемилуминисцентни - антителата се означени со репортер ензим, кој емитира луминисценција во присуство на супстрат, евидентирана е емисија на светлина
одредена бранова должина;
o флуоресцентни - антителата се означени со флуоресцентна ознака, која е возбудена од светлина со одредена бранова должина, емисијата на светлина се евидентира во
регион со подолга бранова должина;
• означување на зрачење - етикетите за зрачење (радиоизотопи) се внесуваат во макромолекули, откривањето се врши со помош на:
o авторадиографија (наметнување филм на мембраната);
o радио снимка (квантитативно определување на емисија на зрачење и изградба на слика за релативната положба на ознаките);
• хибридизација - врзување на нуклеинските киселини со означени олигонуклеотиди со комплементарна структура, откривањето, по правило, се врши со снимање на емисијата на зрачење или флуоресценција на етикетата;
• масена спектрометрија - се користи за директна структурна анализа на липиди.

• Саутерн blotting(Southern blotting) - со името на Едвин Саутерн, кој предложи метод - одредување на секвенцата на ДНК во примерок и одредување на бројот на копии на гени во геномната ДНК. На трансферот во мембраната му претходи дигестија на примерокот со рестриктивни ендонуклеази во фрагменти и нивно фракционирање со електрофореза во агарозен гел. Мембранската анализа се изведува со хибридизација со означени олигонуклеотиди со позната низа;
• северен blotting- определување на секвенцата на РНК во примерокот и проучување на генската експресија (одредување на мРНК). Слично на Southern blotting, но молекулите на РНК изолирани од примерокот се испитуваат, без расцепување од ендонуклеази. Раздвојувањето на молекулите се врши во агарозен гел со додавање на формалдехид (за денатурација на РНК) или во гел од полиакриламид со додавање на уреа (се користи за анализа на микроРНК). Имобилизацијата на молекулите на РНК на мембраната се јавува поради загревање под вакуум или „шиење“ со користење на УВ зрачење;
• вестерн блотинг- имуноблотинг на протеини - аналитички метод што се користи за одредување на специфични протеини во примерокот. На трансферот во мембраната му претходи одвојување на протеините во гел од полиакриламид. Анализата на протеините на мембраната се врши имунохемиски;
• далеку вестерн блотинг- протеин blotting, кој се користи за одредување на протеинско-протеински интеракции, слично на Western blotting, но наместо антитела, се користат други протеини кои специфично се врзуваат за протеинот што се испитува;
• југовестерн блутинг- определување на протеини кои се врзуваат за ДНК и места за врзување на протеини во молекулите на ДНК - слично на Western blotting, но по денатурирање на електрофореза со полиакриламид гел, протеините се измиваат од натриум додекал сулфат во присуство на уреа и се пренесуваат во нитроцелулозна мембрана поради дифузија . Како примерок, се користат означени фрагменти на ДНК со различна должина, добиени со расцепување на поголем проучуван фрагмент од геномска ДНК. Врзаните молекули на ДНК потоа се измиваат од секој комплекс на протеин-ДНК и се анализираат со електрофореза со полиакриламид гел;
• Источна бришење- определување на пост-преведувачки модификации на протеините (липиди, гликополисахариди, фосфатни остатоци поврзани со нив) - слично на Western blotting, но антителата не се користат на протеини, туку на липиди, гликополисахариди итн. Исто така, покрај антителата, како примероци се користат и други протеински молекули кои се врзуваат за проучуваните (на пример, лектин);
• Блоцирање на Далечниот Исток- анализа на липиди одделени со високо-перформансна тенкослојна хроматографија. Трансферот до мембраната, како по правило, се врши со дифузија. Регистрацијата се врши со директна масовно-спектрометриска структурна анализа.

Откако ДНК, РНК или протеини се одвоени, тие мора да се пренесат на цврста поддршка за откривање и други операции кои се тешки во гел. Процесот на пренос што води до имобилизација на молекулите , т.е. фиксација во стационарна состојба се нарекува бришење (на англиски. - бришење ). Како подлога се користат најлонски или нитроцелулозни мембрани.

Блотирање(од англиски blotting - blotting) е метод за пренос на електрофоретски фрагменти на ДНК на специјална фолија (мембрана) направена од нитроцелулоза која ги врзува (имобилизира) молекули на едноверижна ДНК.

Саутерн blotting(по име на авторот кој го предложил) се заснова на движењето на фрагментите на ДНК поради капиларниот ефект. Процесот на пренесување на фрагменти на ДНК во гел од агароз на нитроцелулозен филм со помош на филтер-хартија е сличен на бришење.

Анализата се изведува на следниов начин:

– Изолираната, прочистена, денатурирана и фрагментирана ДНК се става на лист од агарозен гел, каде што фрагментите електрофоретски се одвојуваат по маса и полнеж.

– Листот со гел агароза се става на филтер-хартија навлажнета со концентриран физиолошки раствор (тампон).

- Потоа на гелот се нанесува нитроцелулозен филтер, каде што доаѓа до имобилизација (или адсорпција, или фиксација) на едноверижни фрагменти на ДНК.

- Над филтерот се става куп листови сува филтер-хартија, што обезбедува бавен проток на пуферскиот раствор низ гелот (т.е. служи како еден вид капиларна пумпа). Солениот раствор, минувајќи низ гелот на агароза, носи ДНК фрагменти кои се задржуваат од нитроцелулозата и се врзуваат за неа, а растворот се апсорбира со сува филтер-хартија.

– Следно, ДНК се денатурира со алкали, а филтерот се чува во вакуум на температура од 80 0 C, како резултат на што едноверижните фрагменти на ДНК неповратно се имобилизираат (фиксираат) на нитроцелулозата. Во овој случај, распоредот на имобилизираните ДНК ленти точно одговара на нивната локација во гелот.

– ДНК врзана за филтерот се става во раствор со означена ДНК сонда, во која настанува хибридизација. Само фрагментите на ДНК комплементарни на неа ќе се хибридираат (формираат водородни врски) со специфична сонда, која може да се открие како светлосни ленти на рендген филм, т.е. автограм на нитроцелулозен филтер

бришење на точки. За да се подготват дамки, подготовката на ДНК или РНК се нанесува директно на филтерот. Капките од лекот изгледаат како точки на филтерот, што го објаснува името на типот на blotting (англиски точка - точка). 1) Фрагменти од 5-10 базни парови во должина се формираат од геномска ДНК претходно третирана со ултразвук.

2) За да се направат сонди ДНК или РНК достапни на сондата, тие мора да бидат денатурирани, т.е. претворена во едножичен облик. Ова се случува под влијание на температура од 100 ° C.

3) Денатурираните нуклеински киселини се инкубираат на мраз: брзото намалување на температурата ја спречува нивната ренатурација, т.е. комплементарно спарување на синџири. Денатурираната ДНК или РНК се нанесува директно на филтерот, кој се инкубира во растворот што ја содржи сондата.

4) За да не влезе анализираната нуклеинска киселина во раствор, мора да се фиксира на филтерот (мембраната). За ова се користат два вида филтри: нитроцелулоза и најлон.

За да се имобилизираат нуклеинските киселини на нитроцелулозен филтер, се користи пржење на 80 °C во вакуум, а на најлонски филтер се користи УВ зрачење 3-5 минути.

5) По инкубација на препаратот на нуклеинска киселина со сонда означена со изотоп, се врши авторадиографија во посебна касета или идентификација со нерадиоактивни методи.

Точка blotting ви овозможува да одговорите само на едно прашање: дали има сакана нуклеотидна низа во даден примерок.

Северна размачкана анализасе применува:

1) за изолација и анализа на РНК (на пример, да се открие дали mRNA прочитана од даден ген е присутна во даден тип на клетка, т.е. дали генот е изразен или не;

2) да се одреди количината на оваа РНК и нејзините промени во развојот на даден тип на клетка;

3) да се одреди големината на транскриптот на некој ген.

Во овој случај, молекулите на РНК изолирани од клетката се одвојуваат по големина со помош на гел електрофореза и потоа се пренесуваат во филтер. По хибридизацијата со означена едноверижна сонда, се идентификуваат местата на хибридизација (хомологија) на РНК и сондата.

Ако нуклеотидната секвенца на саканиот ген (или mRNA) не е позната, но е познат протеинот чија синтеза ја контролира, тогаш може да се изолира мала количина на чист протеин, може да се одреди амино киселинската секвенца на некои од неговите делови ( познавање на 5-6 аминокиселински остатоци е доволно). Користејќи ја табелата на генетскиот код, можно е да се утврдат сите можни нуклеотидни секвенци во тој дел од mRNA (или самиот ген) што кодира дадена амино киселинска секвенца. Во овој случај, сонда може да се синтетизира за пребарување на саканите клонови во генската библиотека.

Вестерн блоттинГ(имуноелектроблотинг, протеин blotting) е метод за идентификување на уникатни протеини. Се заснова на феноменот на високо специфична интеракција антиген-антитело. Така, антигенот (цел) е протеинот што се одредува, а сондата е антителото на него.

Антителата на протеинот што се проучува се добиваат на различни начини. Наједноставно е воведувањето на прочистен протеински примерок во крвотокот на лабораториско животно (обично зајак). Во неговото тело, против овој странски протеин се произведуваат антитела (имуноглобулини). Ова се примарните антитела кои ќе комуницираат со целниот протеин.

Сепак, не би било рационално да се воведе ознака за идентификација директно во овие антитела. За да се детектираат различни протеини, би било неопходно да се означат различни антитела, што би довело до нивната висока цена. Се покажа дека е поразумно да се користи универзални антитела – конјугирани антиимуноглобулини, кои се, всушност, антитела на антитела произведени со користење на протеин кој може да се идентификува како антиген. На пример, конјугирани анти-имуноглобулини со зајачко Ig ќе комуницираат со сите имуноглобулини синтетизирани во зајак за различни антигени. Така, токму овие универзални секундарни антитела носат изотопска или нерадиоактивна ознака. Покрај неизотопската ознака, која во текот на голем број реакции доведува до формирање на нерастворливо обоено соединение (како во случајот со блутирање на нуклеинска киселина), многу често се користи хемилуминисцентна ознака со поголема чувствителност.

1) Екстракција на протеини од хомогенатот

2) Одвојување на протеините по молекуларни тежини со помош на SDS-електрофореза во полиакриламид гел (PAAG). Методот на електрофореза на SDS вклучува денатурација на природни протеини. Така, протеинските молекули со иста молекуларна тежина ќе поминат низ истиот пат во гелот и ќе се редат во форма на лента. Бидејќи во смесата се присутни протеински молекули со различни големини, се формираат многу ленти. Резултатите од електрофорезата може да се визуелизираат со протеинско боење (Coomassie брилијантно сино, амидо црно, сребрено боење). Боењето со сребро има единствена чувствителност, што ви овозможува да откриете само 0,1 ng протеин во добиената лента. Ова е многу важно за да се контролира количината на протеин што се нанесува на гелот.

3) Трансфер на протеини од гелот до мембраната. Ова е направено затоа што полиакриламид не дозволува големите имуноглобулински молекули да се дифузираат во протеинот. И протеинот имобилизиран на мембраната станува достапен за антителата. За разлика од размачкањето на нуклеинската киселина, трансферот на протеини во мембраната се случува под влијание на електричните сили, т.е. во електрично поле.

4) Добиената дамка се инкубира со протеински антисерум, а потоа со антиимуноглобулини. Резултатот е прикажан според користениот тип на етикета.

Ограничувања:

1) големата големина на проучуваните фрагменти, што значително ја надминува должината на ДНК сондите и спречува директна молекуларна анализа;

2) неможноста за произволен избор на краевите на проучуваните секвенци, утврдена со присуството на соодветните места за ограничување во оригиналната молекула на ДНК;

3) потребата за голема количина на добро прочистена високомолекуларна геномска ДНК (најмалку 10 μg по реакција, што е еквивалентно на 0,5-1 ml крв),

4) за геномска хибридизација - присуство на радиоактивни ДНК сонди со висока специфична активност од најмалку 109 импулси / мин * μg), кои работат ограничен временски период и специјално опремена изотопска единица. Покрај тоа, долгото изложување на автограми значително го продолжува времето за добивање резултати.

5) висок интензитет на трудот истражување

Што е Western Blotting?

Идентификацијата на протеините во сложени мешавини или екстракти од различни ткива е еден од најчесто сретнуваните проблеми. Користејќи таква алатка како специфични антитела, можно е да се одреди протеинот што се проучува со минимални временски и финансиски трошоци.

Во методот на Western blotting, во првата фаза, мешавината на протеини се одделува со електрофореза во присуство на натриум додекал сулфат (SDS), а потоа се пренесува во нитроцелулозна мембрана со електроблокирање. Суштината на овој метод лежи во фактот дека гелот по електрофорезата се става на нитроцелулозна мембрана помеѓу слоевите филтер-хартија. Вака склопениот „сендвич“ се става во електрично поле, така што комплексите протеин-SDS се движат низ гел-плочката и се имобилизираат (како резултат на неспецифична сорпција) на површината на нитроцелулозната мембрана.

Во врзувањето на комплексот протеин-SDS за нитроцелулозната мембрана, главно се вклучени електрични сили, а оваа интеракција е повеќекратна и води до „ширење“ на протеините на површината на мембраната. Така, по електротрансферот, добиваме реплика на гелот на нитроцелулоза со протеини распоредени на ист начин како во гелот од полиакриламид.

По СДС - електрофореза, електротрансфер и сорпција на протеини од гелот на нитроцелулозна мембрана, терциерната конформација на протеинот е значително променета, ако генерално е точно да се зборува за постоење на терциерна структура за протеинот по толку груб третман. . Затоа, за имунохемиска детекција на протеинот што се испитува, обично се користат само моно- или поликлонални антитела специфични за линеарните региони на протеинската молекула. Антителата специфични за конформациски епитопи (или места кои вклучуваат контакти меѓу подединицата) генерално не се погодни за употреба во методот Western blot.

По трансферот на протеини, мембраната се инкубира последователно со антитела специфични за протеинот што се испитува, а потоа со секундарни антитела специфични за Fc фрагментите од примарните антитела, конјугирани со ензимска (или некоја друга) ознака (сл. 1 А). Во случај кога примарните антитела специфични за проучуваниот антиген се директно конјугирани со ознаката, секундарните антитела не се потребни (сл. 1 Б). Имуните комплекси формирани на местото на проучуваната локализација на протеинот се „манифестираат“ со помош на хромоген супстрат (во зависност од видот на ознаката).

Чувствителноста и специфичноста на методот е многу зависна од тоа кои антитела се користат во студијата. Користените антитела мора да бидат специфични за единствена аминокиселинска секвенца специфична само за протеинот што се испитува. Во спротивно, можна е интеракција (особено во случај на груби протеински екстракти) на антитела со неколку протеински молекули, што пак ќе доведе до појава на неколку обоени ленти на мембраната. Идентификацијата на протеинот што се проучува во овој случај е често тешко, па дури и невозможно.

Вториот важен фактор што треба да се има предвид при изборот на антитела е афинитетот. Колку е поголем афинитетот на употребените антитела, колку е посветло и појасно дамката на протеинските ленти, толку е поголема чувствителноста на методот. Кога се користат антитела со висок афинитет, може да се постигне чувствителност од 1 ng, па дури и поголема.

За да се визуелизира резултатот од интеракцијата на мембранскиот врзан антиген и антитела, се користат секундарни антитела конјугирани со агенси способни да дадат одреден сигнал под одредени услови. Обично, како таков агенс се користи ензим (пероксидаза или фосфатаза), чиј производ на реакција има боја и се таложи на мембраната во форма на нерастворлив талог. Исто така, во овој метод е можно да се користат флуоресцентни етикети.

Ориз. 1. Шема на имунохемиско боење на проучуваниот протеин: А - користење на секундарни антитела конјугирани со ензимска ознака; Б - примарното антитело е директно конјугирано со ензимска ознака.

Протокол:

I. Подготовка на гел и мембрана и електротрансфер на протеини

Полиакриламидниот гел по електрофорезата беше ставен во бања со пуфер за размачкување (25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM глицин, 10% етанол). На делот од касетата што ќе биде свртен кон анодата се ставаат два листа филтер-хартија, исечени според обликот на касетата за бришење и навлажнета со пуфер за блотирање. Потоа, на филтер-хартијата се става нитроцелулозна мембрана претходно навлажнета со истиот пуфер, со што се внимава да нема воздушни меури помеѓу мембраната и хартијата. После тоа, гелот треба внимателно да се постави на мембраната, повторно обрнувајќи посебно внимание на отсуството на воздушни меури помеѓу гелот и мембраната. Сендвичот го комплетираат два слоја навлажнета филтер-хартија, кои се поставуваат на површината на гелот (сл. 2). Добиениот сендвич се стега во касетата и се става помеѓу електродите така што мембраната е свртена кон анодата.

Ориз. 2. Шема на електротрансфер на протеини во мембраната.

II. електротрансфер

Електротрансферот на протеините во нитроцелулозна мембрана се врши во пуфер кој содржи 25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM глицин, 10% етанол за 30-50 мин со постојан напон од 100 V. Времето на електротрансфер зависи од големината на пренесените протеини, колку е поголем протеинот, толку подолго трае трансферот. Квалитетот на електротранспортот и распоредот на протеинските ленти беше оценет со боење на нитроцелулозната мембрана со 0,3% Ponceau S во 1% оцетна киселина. Пред имунобоење, мембраната треба да се измие неколку пати со благо алкален воден раствор на Трис за да се отстрани бојата поврзана со протеини.

III. Имунохемиско боење на протеини имобилизирани на нитроцелулозна мембрана

За да се блокираат неспецифичните места за врзување на антителата, мембраната се инкубира со постојано мешање на собна температура 30 минути во PBST (за подобро блокирање, може да се користи PBST раствор кој содржи 10% обезмастено млеко во прав). По блокирањето, мембраната се инкубира еден час на собна температура со постојано мешање во PBST што содржи 1-10 μg/ml специфични антитела. Оптималната концентрација на антитела се избира емпириски и зависи од афинитетот на интеракцијата на антителата со антигенот. На крајот од инкубацијата, мембраната беше измиена 5 пати со PBST и пренесена во раствор од секундарни антитела конјугирани со пероксидаза од рен. Разредувањето на конјугатот обично го означува производителот на пакувањето или е избрано емпириски од истражувачот. Инкубирајте ја мембраната во раствор од секундарни антитела 1 час со постојано мешање.

По темелно миење (најмалку 5-6 промени во пуферот), мембраната PBST се пренесува во раствор на хромоген супстрат кој содржи 3 mg диаминобензидин (DAB) и 10 μl 30% водороден пероксид во 10 ml од 0,1 М Tris-HCl, pH 7,6 . Инкубацијата се изведува со мешање од 5 до 10 минути. По завршувањето на инкубацијата со подлогата, мембраната треба да се измие со PBST, да се исуши со бришење со филтер-хартија и веднаш да се направи електронска копија со скенирање во боја. Ако мембраната целосно се исуши, обоените протеински ленти избледуваат, а сликата е помалку светла и контрастна.

Забелешка: DAB е токсичен и потенцијален канцероген. Работете само со гумени ракавици!

И во други природни науки дисциплини.

Други сродни методи користат антитела за откривање на протеини во ткивата и клетките преку имунобоење и имуносорбентна анализа поврзана со ензимот (ELISA). ELISA).

Вестерн blotting беше развиен во лабораторијата на Џорџ Старк. Џорџ Старк) во Стенфорд. Името Western blot беше дадено на техниката од W. Neil Burnett. В. Нил Бурнет) и е игра на зборови за името Southern blotting, техника за откривање на ДНК претходно развиена од Едвин Саутерн. Сличен метод за откривање на РНК се нарекува северно blotting, откривањето на пост-транслациските модификации на протеините се нарекува Источна blotting. Источна бришење).

Подготовка на примерок

Примерокот може да се земе од цело ткиво или од клеточна култура. Во повеќето случаи, тврдите ткива прво се мелат механички со помош на блендер (за примероци со голем волумен), со помош на хомогенизатор (помали волумени) или со сонификација. Во исто време, бактериите, вирусите и другите еколошки компоненти се исто така извор на протеини.

Гел електрофореза

Протеините се одвојуваат со помош на електрофореза со полиакриламид гел. Раздвојувањето на протеините може да се направи со изоелектрична точка (pI), молекуларна тежина, електричен полнеж или комбинација од овие параметри.

Најчестиот метод за одвојување на протеините е електрофореза со полиакриламид гел во присуство на натриум додецил сулфат. СДС) според Лаемли. СДС предизвикува денатурација на протеините и ги одржува во денатурирана состојба; агенсите за намалување на дисулфидната врска, како што се дитиотреитол и меркаптоетанол, се користат за уништување на секундарните и терциерните структури на протеините. Денатурираните полипептиди мигрираат во електричното поле преку акриламидниот гел до анодата, при што помалите протеини се движат побрзо и на тој начин се одвојуваат според молекуларната тежина. Концентрацијата на акриламид ја одредува резолуцијата на гелот - колку е поголема концентрацијата на акриламид, толку е подобра резолуцијата на протеините со мала молекуларна тежина. Ниската концентрација на акриламид ја подобрува резолуцијата за протеините со висока молекуларна тежина. Исто така, можно е да се користи дводимензионална електрофореза (2-D). Во овој случај, раздвојувањето на протеините се врши во две насоки - во согласност со нивната изоелектрична точка во првата насока и во согласност со молекуларната тежина - во втората.

Примероците на гелот се нанесуваат на џебовите. По правило, една од „патеките“ се остава за маркери за молекуларна тежина (мешавини на протеини со познати маси). Откако ќе се примени напонот, протеините се движат во електричното поле со различни брзини. Разликите во брзината на напредување - електрофоретската мобилност доведува до одвојување на протеините во ленти (eng. бендови).

Префрлете се на мембраната

За да се направат протеините достапни за антитела и понатамошно откривање, тие се пренесуваат заедно со лента гел на мембрана направена од нитроцелулоза или поливинилиден флуорид (инж. PVDF). Мембраната се нанесува преку гелот, а врз него се става куп филтер-хартија. Целиот оџак е сместен во тампон за трансфер, кој ја придвижува хартијата со капиларно дејство, носејќи ги протеините со себе. Друг метод за пренос на протеини се нарекува електроблутинги користи електрична струја која ги носи протеините од гелот до мембраната. Протеините се движат од гелот до мембраната додека ја одржуваат нивната локација. Како резултат на ова „мокрење“ (од англиски. бришење) процес, протеините се задржуваат на тенок површински слој на мембраната за откривање. И двете мембрански варијанти се користат поради нивните неспецифични својства за врзување на протеините. Врзувањето со протеините се заснова и на хидрофобните интеракции и на електростатските интеракции помеѓу мембраната и протеинот. Нитроцелулозната мембрана е поевтина од PVDF, но е многу покршлива и помалку отпорна на повторно етикетирање.

Еднообразноста и целокупната ефикасност на трансферот на протеини од гелот до мембраната може да се потврди со боење на мембраната со Coomassie сина или Ponceau S. полесно миење и етикетирање на мембраната.

блокирање

Откако мембраната е избрана за нејзината способност да ги врзува протеините, се избираат антитела и целниот протеин, мора да се внимава да се избегне интеракција помеѓу мембраната и антителото што се користи за откривање на целниот протеин (бидејќи самото антитело е протеин). Блокирањето на неспецифичното врзување се постигнува со ставање на мембраната во разреден протеински раствор - обично говедски серумски албумин (BSA) или суво млеко без маснотии (и двете ефтини), со мал процент на детергент како Tween 20. Протеинот од разреден раствор се прикачува на мембраната на сите места каде што целта нема закачено протеин. Затоа, кога се додаваат антитела, нема слободно место на мембраната за нив (антитела) за да се прикачат, освен местата за врзување на специфични целни протеини. Овој позадински „шум“ во последниот вестерн блот резултира со чисти резултати и елиминирање на лажни позитиви.

откривање

За време на процесот на откривање, мембраната е „означена“ со протеинот од интерес со модифицирано антитело кое е врзано за репортер ензим кој се одржува на соодветна потпора, што доведува до колориметриска реакција и дава боја. Од различни причини, откривањето се врши во две фази, иако методот за откривање во еден чекор сега е достапен за одредени апликации.

Антителата се произведуваат со изложување на класа на домаќин или култура на имунолошки клетки на некој протеин (или дел од него).Обично ова е дел од имунолошкиот одговор, но овде (во анализата) собраните антитела се користат како специфичен и чувствителна алатка за откривање која директно се врзува за протеинот.

По блокирањето, разредениот раствор на примарен антитела (обично помеѓу 0,5 и 5 µg/ml) се инкубира со мембраната и нежно се протресува. Обично растворот се состои од пуфериран раствор на сол со мал процент на детергент, понекогаш млеко во прав или BSA. Растворот на антителата и мембраната може да се затворат заедно и да се инкубираат некаде од 30 минути до цела ноќ. Тие, исто така, може да се инкубираат на различни температури, при покачени температури има подобро врзување - и специфично (на целниот протеин, „сигнал1“) и неспецифично („шум“).

По испирање на мембраната за да се отстранат неврзаните примарни антитела, мембраната се инкубира во други антитела кои директно се врзуваат за специфичните за класа региони на примарните антитела. Овие се познати како секундарни антитела и, според нивните целни својства, најчесто се нарекуваат „анти-глувче“, „анти-коза“ и така натаму. Антителата се добиваат од животински извор (или животински извори на хибридома култура); секундарните антитела против глувчето ќе се врзат за повеќето примарни антитела добиени од глувчето. Ова создава одредени заштеди со дозволување на поединечна лабораторија да користи единствен извор на масовно производство на антитела, и води до многу порепродуктивни резултати. Секундарните антитела обично се врзуваат за биотин или за известувачки ензим како што се алкална фосфатаза или пероксидаза од рен. Ова значи дека неколку секундарни антитела можат да се врзат за еден примарен и да го засилат сигналот.

Најчестите секундарни антитела поврзани со пероксидаза од рен се користат за сечење на хемилуминисцентниот агенс, а производот од реакцијата произведува луминисцентно зрачење пропорционално на количината на протеини. Лист од фотосензитивен фотографски филм се поставува на мембраната и е подложен на реакциско зрачење, создавајќи слика на лентите на антителата на дамката. Поевтин, но помалку чувствителен пристап кој користи дамка од 4-хлоронафтол измешана со 1% водород пероксид; реакцијата на радикалот пероксид со 4-хлоронафтол дава темно кафеава боја, која се снима без употреба на специјален фотографски филм.

Трет алтернативен метод користи радиоактивна ознака наместо ензим врзан за секундарно антитело, како што е означен протеин А протеин. Стафилококсо радиоактивен изотоп на јод. Другите методи се побезбедни, побрзи и поевтини, па затоа ретко се користи радиоактивна детекција.

Историски гледано, процесот на означување се спроведува во два чекори бидејќи е релативно полесно да се произведат примарни и секундарни антитела во посебни процеси. Ова им дава на истражувачите и компаниите огромна предност во однос на флексибилноста и додава чекор за засилување на процесот на откривање. Со оглед на појавата на тестови на протеини со висока пропусна моќ и ниски прагови за откривање, сè уште постои интерес за развој на систем за означување во еден чекор кој овозможува процесот да работи побрзо и по пониска цена. Тој (систем во еден чекор) бара ознаки на антитела што ќе го препознаат протеинот што се проучува и истовремено ќе носат маркер за откривање - ознаки најпристапни за познатите „протеински опашки“. Прво, етикетите се инкубираат со мембрана во два чекора со примарни антитела, а потоа се подготвени за директно откривање по серија миење.

Анализа

По измивање на неврзаните етикети, вестерн блот е подготвен да открие сонди врзани за целниот протеин. Во пракса, не сите вестерни покажуваат протеини со само една лента на мембраната. Приближната големина се пресметува со споредување на обоените ленти со маркери за молекуларна тежина додадени со електрофореза. Процесот ќе се повтори со структурни протеини како што се актин или тубулин кои не се менуваат помеѓу експериментите. Количината на целниот протеин зависи од количината на контролниот структурен протеин помеѓу групите. Оваа техника обезбедува корекција на количината на вкупниот протеин на мембраната во случај на грешка или нецелосен трансфер.

Колориметриско откривање

Методот на колориметриска детекција се заснова на инкубација на Western blot со супстрат кој реагира со репортер ензим (како што е пероксидазата на рен). рен пероксидаза), „седи“ на секундарното антитело. Растворливата боја се менува во нерастворлива форма со различна боја, таложејќи покрај ензимот и обојувајќи ја мембраната. Растот на место е ограничен со миење на растворливата боја. Нивото на протеин се проценува дензитометриски со интензитет на боење или спектрофотометриски.

Хемилуминисцентна детекција

Методот на хемилуминисцентна детекција се заснова на инкубација на нитроцелулозна мембрана со супстрат што луминисцира по интеракција со секундарен известувач за антитела. Светлината се снима со фотографски филм или CCD камера, која дигитално го доловува вестерн блотот. Сликата се анализира дензитометриски, проценувајќи ја релативната количина на обоениот протеин и дава квантитативен резултат во единици на оптичка густина. Новиот софтвер овозможува понатамошна анализа на податоците, како што е определување на молекуларната тежина, доколку е користен соодветен стандард.

Радиоактивно детекција

За радиоактивните етикети не се потребни ензимски супстрати, туку овозможуваат медицински радиографски филм да се постави пред вестерн blot, овозможувајќи му (филмот) да комуницира со етикетите и да создаде темни области што одговараат на лентите на протеинот што се испитува (во сликата од десната страна). Побарувачката за методи за детекција на радиоактивно дејство се намалува поради нивната висока цена, високите здравствени и безбедносни ризици и алтернативите што ги обезбедува ECL.

Откривање на флуоресценција

Флуоресцентните етикети се возбудени од светлината и емитуваат светлина со подолга бранова должина, која се открива со фотосензори како што е CCD камера опремена со соодветни филтри за емисија. Камерата прави дигитална слика на вестерн блот, што овозможува понатамошна анализа на добиените податоци, како што се анализа на молекуларна тежина и квантитативна анализа на вестерн блот.

содржина

- Вовед
- Решенија
- Лиза на примерок
- Подготовка на примерок
- Спроведување на електрофореза
- Трансфер на протеини од PAAG до мембраната
- Боење на мембраната

Вовед

Western blotting е аналитички метод кој се користи за одредување на специфични протеини во примерок одделен со електрофореза со полиариламид гел. Следно, протеините од гелот се пренесуваат во нитроцелулозна или PVDF мембрана, а потоа проучуваните протеини се откриваат со помош на антитела специфични за одреден протеин и се развиваат со помош на секундарни антитела.

Решенија

Лиза тампон
Тампон NP-40
150 mM NaCl
1,0% NP-40 (Tergitol® тип NP-40)
50 mM Tris-HCl, pH 8,0
Инхибитори на протеаза

Примерок тампон (x5)
10% СДС
5% 2-меркаптоетанол
50% глицерин
0,01% бромофенол сино
0,4 М имидазол

Проверете ја pH вредноста и прилагодете ја на pH 6,8

Пуфер за одвојување (понизок, раздвоен гел пуфер)
400 mM Tris-HCl
0,1% СДС
0,01% ТЕМЕД
0,1% натриум персулфат



Трансфер тампон (полусув)
16 mM Tris-HCl
200 mM глицин
0,1% СДС
20% метанол

Проверете ја pH вредноста и прилагодете ја на pH 8,3

Бафер за блокирање
150 mM NaCl
10 mM Na 2 HPO 4
3-5% обезмастено млеко во прав



Пуфер за миење (PBST)
150 mM NaCl
10 mM Na 2 HPO 4
0,2% Tween-20

Проверете ја pH вредноста и прилагодете ја на pH 7,5

Лиза на примерок

Подготовка на лизат од клеточна култура

1. Ставете го садот со ќелија на мраз и исплакнете ги ќелиите со разладено PBS.

2. Целосно отстранете го PBS растворот, а потоа додадете разладен пуфер за лиза (1 ml на 10 7 клетки/150 cm2; 0,5 ml на 5x10 6 клетки/75 cm 2).

3. Одделете ги ќелиите од пластиката, а потоа внимателно префрлете ја клеточната суспензија во разладена цевка за центрифуга.

4. Инкубирајте ја епруветата со суспензијата со постојано мешање 30 минути на +4℃.

5. Центрифугирајте ја суспензијата на +4℃. Препорачаната стандардна брзина е 12.000 вртежи во минута за 20 минути, но овие параметри треба да се одредат за конкретниот експеримент и типот на ќелијата.

6. Соберете го добиениот супернатант

Подготовка на ткивен лизат

1. Одделете дел од ткивото што треба да се испита користејќи чисти инструменти.

2. Ставете го ткивото во цевката за центрифуга. Додадете разладен пуфер за лиза (0,3 ml/5 mg ткиво) во тубата. Сомелете го примерокот со помош на хомогенизатор. Исплакнете ги сечилата на хомогенизаторот со 0,2 ml разладен пуфер за лиза. Додадете миење на примерокот. Избегнувајте прекумерно разредување на примерокот. Минималната концентрација при полнење е 0,1 mg/ml. Оптимален опсег - 1-5 mg/ml

3. Инкубирајте ја епруветата со суспензијата со постојано мешање 2 часа на +4℃

4. Центрифугирајте ја суспензијата на 12000 вртежи во минута 20 мин на +4℃

5. Соберете го добиениот супернатант

Подготовка на примерок

1. Одредете ја концентрацијата на протеинот во добиените лизати.

2. Одредете ја количината на протеини потребна за вчитување и додадете 4 пати помалку пуфер во примерокот 5X.

Препорачуваме користење на реконституирани и денатурирани примероци

3. За да се врати и денатурира примерокот, тој мора да се вари во тампон за примерок на +100℃ 5 минути.

Спроведување на електрофореза

Ставете еднакви количини на примероци и маркер за молекуларна тежина во бунарите на полиакриламидниот гел. Товарот за лизатот треба да биде 20-30 μg вкупен протеин, оптоварувањето за чист протеин - 10-100 ng.
Изведете протеинска електрофореза во полиакриламид гел

За пренос, може да се користи нитроцелулозна или PVDF мембрана. Активирајте ја PVDF мембраната така што ќе ја натопите 1 минута во метанол. Пред да го извршите преносот, измијте го во баферот за пренос. Препорачуваме користење на полусув метод за пренесување на протеините во мембраната. Степенот на пренесување на протеините во мембраната може да се провери со помош на дамката Ponceau S пред да се блокира мембраната.

Подгответе ја мембраната за пренос како што е прикажано.

1. Исплакнете ја мембраната со PBS.

2. За да се блокираат неспецифичните места за врзување, инкубирајте ја мембраната во блокирачки пуфер преку ноќ на +4℃ или 40 минути на +37℃ со постојано мешање.

3. За да ја измиете мембраната, инкубирајте ја 3 пати во PBST раствор 5 минути на +37℃ со постојано мешање.

4. Инкубирајте со антитела на протеинот што се испитува во раствор на PBS 40 минути на +37℃ со постојано мешање.

5. За да ја измиете мембраната, инкубирајте ја 3 пати во раствор PBST 5 минути на +37℃ со постојано мешање

6. Инкубирајте ја мембраната со секундарни антитела против видови (имуноконјугати) во раствор на PBS 40 минути на +37 ℃ со постојано мешање.

7. Измијте ја мембраната 5 пати во раствор од PBST 5 минути на +37℃ со постојано мешање.

8. За откривање на врзани антитела конјугирани со пероксидаза од рен, препорачуваме користење на растворот за подлогата DAB.