Metoder för att bestämma aminosyrasammansättningen av proteiner. Bestämning av aminosyrasammansättningen av proteiner

Innehåll Inledning 1. Mjölkens huvudkomponenter 2. Metoder för aminosyraanalys 1. Kromatografisk analysmetod 2. Spektrofotometrisk analysmetod 3. Titrometrisk analysmetod 4. Elektrokemisk analysmetod 3. Metoder för att bestämma aminosyrasammansättningen 1. Bestämning av aminosyror genom tunnskiktskromatografi 3.2. Bestämning av aminosyror med den spektrofotometriska metoden 4. Genomgång av abstrakta tidskrifter Lista över använd litteratur Inledning Nutritionsproblemet är ett av de viktigaste sociala problemen.

Människoliv, hälsa och arbete är omöjligt utan näringsrik mat. Enligt teorin om balanserad kost bör en persons kost inte bara innehålla proteiner, fetter och kolhydrater i de nödvändiga mängderna, utan också ämnen som essentiella aminosyror, vitaminer och mineraler i vissa proportioner som är fördelaktiga för människor.

När det gäller att organisera rätt kost ges mejeriprodukter en primär roll. Detta gäller fullt ut mjölk, vars näringsvärde beror på den höga koncentrationen av mjölkprotein och fett i den, närvaron av essentiella aminosyror, kalcium- och fosforsalter, som är så nödvändiga för den normala utvecklingen av människokroppen. Lättsmältbarhet är en av de viktigaste egenskaperna hos mjölk som livsmedelsprodukt. Dessutom stimulerar mjölk upptaget av näringsämnen från andra livsmedel.

Mjölk ger variation till kosten, förbättrar smaken på andra produkter och har terapeutiska och profylaktiska egenskaper. Mjölk innehåller mer än 120 olika komponenter, inklusive 20 aminosyror, 64 fettsyror, 40 mineraler, 15 vitaminer, dussintals enzymer, etc. Energivärdet för 1 liter obehandlad mjölk är 2797 kJ. En liter mjölk tillfredsställer en vuxens dagliga behov av fett, kalcium, fosfor, 53 % för protein, 35 % för vitamin A, C och tiamin och 26 % för energi. Huvudmålet med detta kursarbete är att identifiera aminosyrasammansättningen i mjölk. 1.

Huvudkomponenter i mjölk

Ur en fysikalisk-kemisk synvinkel är mjölk en komplex polydispers... 5.1). Den största specifika vikten i mjölk är vatten (mer än 85%, resten... Den torra återstoden inkluderar alla näringsämnen från mjölk. Den bestämmer avkastningen av färdiga produkter vid produktion av mejeriprodukter...

Kromatografisk analysmetod

En av de mest lovande metoderna är den mycket effektiva metoden... Men fördelarna med metoden överväger betydligt dess nackdelar. Dessutom kan den användas för att slutföra kemisk analys.... På moderna gaskromatografiska kapillärkolonner i ett ex... Metoden kännetecknas av hög känslighet och tillåter kvantitativ...

Titrometrisk analysmetod

Titrometrisk analysmetod. Av de titrimetriska metoderna för kvantitativ bestämning är den bredaste... Titrering kan utföras med en indikator (kristallviolett... Denna metod har dock ett antal betydande nackdelar: användningen... För den kvantitativa analysen av individuella aminosyror syror, uppfyllt...

Elektrokemisk analysmetod

Under de senaste decennierna har elektrokemikalier blivit allt mer utbredda... 3.. under optimerade förhållanden gör de det möjligt att bestämma endast individuella am... Således har en metod utvecklats för polarografisk bestämning av tryptofan, en grundläggande... Elektrokemisk analysmetod.

Metoder för att bestämma aminosyrasammansättning

Metoder för att bestämma aminosyrasammansättningen 3.1.

Bestämning av aminosyror genom tunnskiktskromatografi

84 g citronsyramonohydrat löses i 1 liter destillerat vatten... 3.2.. Efter 10 minuter placeras filmen i en CG-kammare med en nitratbuffert (buffert... Metod: 2 (10) µl p hydrolysat appliceras på startlinjen på plattan... Droppar prover och standardaminosyror appliceras på startlinjen på...

Bestämning av aminosyror med spektrofotometrisk metod

Aminosyror, primära aminer, polypeptider och peptoner vid upphettning med... 0,2 - 3% lösning av ninhydrin framställs i olika lösningsmedel (isobu... 2007. volym 2. Tsvetkova N.D.

Vad ska vi göra med det mottagna materialet:

Om detta material var användbart för dig kan du spara det på din sida på sociala nätverk:

Fler sammanfattningar, kurser och avhandlingar om detta ämne:

Definition av entropi. Fastställande av informationsförluster vid överföring av meddelanden över kommunikationskanaler med brus

Definition av kärnan i ekonomistyrningssystem: ämne och metod. Vi kan ge en grov definition av syftet med ledningen: tillhandahålla information som är användbar för ledningen av organisationen
Buu är en del av företagsinformationssystemet, å ena sidan, å andra sidan, en verksamhet vars syfte är att tillhandahålla information till ledningen.. man kan ge en grov definition av målet med yu, tillhandahållande av information som.. essensen av yu ligger i informationens analytiska karaktär, den samlas in, grupperas, identifieras och studeras..

Dessa riktlinjer är avsedda att hjälpa studenter att utföra laboratoriearbete med beskrivning och identifiering av mineraler och bergarter.. dessa riktlinjer presenterar nödvändig terminologi och beskrivningstekniker.. Riktlinjerna ger uppgiftsalternativ och exempel för att utföra beräknings- och grafiskt konstruktionsarbete.

Företagets egendom: sammansättning, syfte. Fastställande av behovet av fast kapital och rörelsekapital
Ett företags kapital kan betraktas ur flera synpunkter; först och främst är det tillrådligt att skilja mellan kapital.

Corpus delicti tillåter oss att skilja den ena från den andra... för att ta itu med corpus delicti måste vi först titta på grunderna för brottet... först måste vi förstå vad som ligger till grund för brottet och sedan ska vi se att den enda grunden är...

Definition av entropi. Fastställande av informationsförluster vid överföring av meddelanden över kommunikationskanaler med brus. Alternativ för uppgifter att slutföra
Uppgiften är att bestämma entropi.. ett meddelande består av n tecken, det finns m typer av symboler, antal bokstäver.. uppgiften är att fastställa informationsförluster vid överföring av meddelanden över kommunikationskanaler med brus..

Uppgifter för att genomföra praktiska lektioner i redovisningskursen uppgift 1. Baserat på sammansättningen av fastigheten i Rostov JSC, gruppera fastighetens ekonomiska tillgångar efter typ och sammansättning
Ekonomiska fakulteten.. Khakhonova N.. uppgifter för praktiska lektioner..

Huvudklasser av oorganiska föreningar. Bestämning av molmassan av zinkekvivalenter. Bestämning av neutralisationsvärmet. Hastigheten för en kemisk reaktion. Katalys
Inledning.. När man studerar kemi är laboratoriepraktiskt arbete av stor vikt.Ett korrekt utfört experiment tillåter..

Integrerad miljö och sammansättning av objektet Pascal-språket. Språkets sammansättning
Innehåll.. Föreläsning Integrerad miljö och sammansättning av Object Pascal-språket.. Arbeta med Windows-redigering i Object Pascal..

Introduktion till operativsystem. Definition, syfte, sammansättning och funktioner för operativsystem
Statlig läroanstalt för högre yrkesutbildning.. Togliatti State University of Service..

För att bestämma aminosyrorna som utgör proteiner används sur (HC1), alkalisk (Ba(OH)2) och enzymatisk hydrolys. När rent protein, fritt från föroreningar, hydrolyseras frigörs 20 olika aminosyror.

Aminosyror, komponenter i proteiner är
a-aminosyror. Alla tillhör L-serien, och storleken och tecknet på optisk rotation beror på aminosyraradikalernas natur och lösningens pH-värde. D-aminosyror finns inte i mänskliga proteiner, men de finns i cellväggen hos bakterier, som en del av vissa antibiotika (aktinomyciner).

Aminosyror skiljer sig från varandra i den kemiska naturen hos R-radikalen, som inte deltar i bildandet av en peptidbindning.

Modern rationell klassificering av aminosyror är baserad på polariteten hos radikaler:

Icke-polär (hydrofob)

Polär (hydrofil)

Negativt laddad

Finns i vissa proteiner aminosyraderivat. Bindvävsproteinet kollagen innehåller hydroxiprolin och oxylysin. Dijodtyrosin är grunden för strukturen av sköldkörtelhormoner.

Aminosyror har en gemensam egenskap - amfotär(från grekiskan amphoteros - tvåsidig). I pH-området 4,0-9,0 finns nästan alla aminosyror i form av bipolära joner (zwitterjoner). Menande en aminosyras isoelektriska punkt (IEP, pI) beräknas med formeln:

.

För monoaminodikarboxylsyror beräknas pI som halva summan av pK-värdena (tabell 1) för a- och w-karboxylgrupper, för diaminomonokarboxylsyror - som halva summan av pK-värdena för a- och w- aminogrupper.

Det finns icke-essentiella aminosyror (kan syntetiseras i människokroppen) och essentiella aminosyror, som inte bildas i kroppen och måste förses med mat.

Essentiella aminosyror: valin, leucin, isoleucin, lysin, metionin, treonin, tryptofan, fenylalanin.

Essentiella aminosyror: glycin, alanin, asparagin, aspartat, glutamin, glutamat, prolin, serin.

Villkorligt utbytbar(kan syntetiseras i kroppen från andra aminosyror): arginin (från citrullin), tyrosin (från fenylalanin), cystein (från serin), histidin (med deltagande av glutamin).

För att upptäcka och kvantifiera aminosyror i biologiska föremål används en reaktion med ninhydrin.

Tabell 1. Aminosyradissociationskonstanter

Bestämning av aminosyrasammansättningen av proteiner kan utföras med olika metoder: kemiska, kromatografiska, mikrobiologiska och isotoper. Kromatografiska metoder används oftare.

Papperskromatografi. Papperskromatografi används för att identifiera komponenterna i en blandning av aminosyror med di- och tripeptider erhållna genom partiell hydrolys av proteiner och polypeptider.

Hydrolys kan utföras med sura, alkaliska eller enzymatiska metoder. Syrametoden används oftare (6 N HCl, 8 N H 2 SO 4). Hydrolys utförs genom uppvärmning, ibland vid förhöjt tryck. Indikatorer på slutet av hydrolysen kan vara: upphörande av tillväxten av karboxyl- eller amingrupper i hydrolysatet, eller en negativ biuretreaktion. Överskottet av hydrolyseringsreagenset avlägsnas: svavelsyra fälls ut med Ca(OH)2, saltsyra destilleras av i vakuum och den återstående syran fälls ut med silvernitrat.

Hydrolysatets komponenter är fördelade mellan vatten adsorberat på cellulosan, som är den stationära fasen, och ett organiskt lösningsmedel, den mobila fasen, som rör sig uppåt eller nedåt längs med arket. En blandning av butanol-ättiksyra-vatten (4:1:5) används som den mobila fasen. Fler lipofila aminosyror attraheras starkare av det organiska lösningsmedlet, medan mer hydrofila visar en större tendens att binda till den stationära fasen. Homologa föreningar som skiljer sig med ens en metylenenhet rör sig med olika hastigheter och kan lätt separeras. Vid slutet av kromatografin torkas papperet och behandlas med en framkallare (0,5 % lösning av ninhydrin i en blandning av aceton-isättika-vatten) och upphettas i flera minuter. Aminosyror visas som färgade fläckar. Mobilitet är ett konstant värde som är karakteristiskt för varje förening och ökar med ökande molekylvikt. För rakkedjiga aminosyror är mobilitetsvärdet något högre än för motsvarande isomerer. Införandet av polära grupper i molekylen minskar föreningens rörlighet. Aminosyror med skrymmande opolära sidokedjor (leucin, isoleucin, fenylalanin, tryptofan, etc.) rör sig snabbare än aminosyror med kortare opolära sidokedjor (prolin, alanin, glycin) eller med polära sidokedjor (treonin, arginin, cystein, histidin lysin). Detta beror på den större lösligheten av polära molekyler i den hydrofila stationära fasen och för icke-polära molekyler i organiska lösningsmedel.

Papperskromatografi kan användas för att kvantifiera aminosyrainnehållet. Varje fläck skärs ut och elueras med ett lämpligt lösningsmedel; sedan utförs en kvantitativ kolorimetrisk (ninhydrin) analys. I en annan utföringsform sprayas papperet med ninhydrin och färgintensiteten hos fläcken mäts med användning av en fotometer i reflekterat eller genomsläppt ljus. I en semikvantitativ bedömning bedöms aminosyrainnehållet av området av fläckar på kromatogrammet, som är proportionella mot koncentrationerna av aminosyror i blandningen som separeras.

Tunnskiktskromatografi. Tunnskiktskromatografi kan också användas för att separera och bestämma aminosyror. TLC finns som bekant i två versioner. Partition TLC liknar partition TLC på papper, och adsorption TLC bygger på helt andra principer.

När man utför RTLC på cellulosapulver eller andra relativt inerta bärare kan samma lösningsmedelssystem och samma framkallningsreagens användas som vid papperskromatografi.

Separation med ATLC bestäms av förmågan hos ett lösningsmedel (detta lösningsmedel är inte nödvändigtvis en binär eller mer komplex blandning) att eluera komponenterna i provet från platsen för dess adsorption på den aktiverade sorbenten. Till exempel på uppvärmd silikagel. ATLC är användbar för separation av icke-polära föreningar såsom lipider, men inte för separation av aminosyror och de flesta peptider. För att separera aminosyror används RTLC, vilket gör att du snabbt kan separera och bestämma 22 aminosyror av proteinhydrolysat.

Aminosyror i proteinhydrolysat kan också bestämmas med gaskromatografi, men före kromatografisk analys omvandlas aminosyror vanligtvis till flyktiga föreningar.

Interaktion med ninhydrin. Motsvarande aldehyder bildas.

Således erhålls en blandning av aldehyder och analyseras. Detta är det enklaste fallet, endast lämpligt för vissa aminosyror.

Aminosyror omvandlas till flyktiga estrar (alkylestrar, metylestrar av hydroxisyror, metylestrar av klorerade syror, etc.).

Valet av derivat beror på vilken blandning av aminosyror som studeras.

Jonbyteskromatografi. För närvarande bestäms aminosyrasammansättningen av livsmedelsprodukter uteslutande med hjälp av automatisk jonbyteskromatografi.

Moore och Stein-metoden använder korta och långa kolonner fyllda med sulfonerat polystyrenharts i Na+-form. När ett surt hydrolysat vid pH = 2 appliceras på kolonnen, binds aminosyror genom katjonbyte med natriumjoner. Kolonnen elueras sedan med natriumcitratlösning vid förprogrammerade pH- och temperaturvärden. En kort kolonn elueras med en buffert, en lång kolonn med två. Eluatet behandlas med ninhydrin, varvid färgintensiteten mäts med en flödeskolorimeter. Data registreras automatiskt på en sjökortsskrivare och kan överföras till en dator för att beräkna arean under toppen.

Högspänningselektrofores på inerta bärare. Inom biokemin har separationen av aminosyror, polypeptider och andra amfolyter (molekyler vars totala laddning beror på miljöns pH) under påverkan av ett anbringat konstant elektriskt fält fått stor tillämpning. Detta är en metod för högspänningselektrofores på inerta bärare. Vid separering av aminosyror används oftast pappersremsor eller tunna lager av cellulosapulver som inerta bärare. Separation utförs i 0,5–2 timmar vid en spänning på 2000–5000 V, beroende på amfolyternas totala laddningar och deras molekylvikter. Bland molekyler som bär samma laddning migrerar lättare molekyler snabbare. Men en viktigare parameter under separationen är den totala laddningen. Metoden används för att separera aminosyror, lågmolekylära peptider, vissa proteiner och nukleotider. Provet placeras på bäraren, fuktas med en buffert vid lämpligt pH och ansluts till buffertbehållaren med en remsa av filterpapper. Papperet är täckt med en glasskiva eller nedsänkt i ett kolvätelösningsmedel för kylning. I ett elektriskt fält migrerar molekyler som bär en negativ laddning vid ett givet pH till anoden, och de som bär en positiv laddning migrerar till katoden. Därefter "utvecklas" det torkade elektroferogrammet med ninhydrin (när man arbetar med aminosyror, peptider) eller mäter absorption i UV-ljus (när man arbetar med nukleotider).

Valet av pH bestäms av pK-värdena för de dissocierande grupperna som ingår i blandningens molekyler. Vid pH 6,4 bär glutamat och aspartat en -1 laddning och rör sig mot anoden; deras separation utförs på grund av skillnaden i molekylvikt. Lysin, arginin och histidin rör sig i motsatt riktning, och alla andra aminosyror som utgör proteinet förblir nära appliceringsstället. När man separerar peptider som är ett resultat av enzymatisk nedbrytning, sänker man pH till 3,5 ökar laddningen av de katjoniska grupperna och ger bättre separation.

Metoder för papper, tunnskiktskromatografi, mikrobiologisk, gaskromatografi och ett antal andra används för närvarande praktiskt taget inte på grund av dålig reproducerbarhet och lång varaktighet. Moderna kromatografier gör det möjligt att bestämma aminosyrasammansättningen i en blandning som endast innehåller 10 –7 –10 –9 mol av varje komponent med en reproducerbarhet på upp till 5% på 2-4 timmar.

Analys av aminosyrasammansättningen inkluderar fullständig hydrolys av proteinet eller peptiden som studeras och kvantitativ bestämning av alla aminosyror i hydrolysatet. Eftersom peptidbindningar är stabila vid neutralt pH, används sur eller alkalisk katalys. Enzymatisk katalys är mindre lämplig för fullständig hydrolys. Fullständig hydrolys av ett protein till dess ingående aminosyror åtföljs oundvikligen av en partiell förlust av vissa aminosyrarester. För hydrolys används vanligtvis 6N. vattenlösning av saltsyra (110ºС), i en evakuerad ampull. Kvantitativ bestämning av aminosyror i hydrolysatet utförs med användning av en aminosyraanalysator. I de flesta av dessa analysatorer separeras en blandning av aminosyror på sulfonkatjonbytare, och detektionen utförs spektrofotometriskt genom reaktion med ninhydrin eller fluorimetriskt med O-ftalisk dialdehyd.

Men data om aminosyrasammansättningen av liknande produkter som erhållits i olika laboratorier för enskilda aminosyror skiljer sig ibland med upp till 50 %.

Dessa skillnader beror inte bara på sort-, art- eller teknologiskillnader, utan främst på förutsättningarna för hydrolys av livsmedelsprodukten. Med standardsyrahydrolys (6 N HСl, 110–120ºС, 22–24 timmar) förstörs vissa aminosyror delvis, inklusive treonin, serin (med 10–15 % och ju mer, ju längre hydrolysen utförs) och speciellt metionin (30–60 %) och cystin 56–60 %, samt nästan fullständig destruktion av tryptofan och cystein. Denna process förstärks i närvaro av stora mängder kolhydrater i produkten. För kvantitativ bestämning av metionin och cystin rekommenderas det att utföra deras preliminära oxidation med myrsyra. I detta fall omvandlas cystin till cysteinsyra och metionin till metioninsulfon, som är mycket stabila under efterföljande sur hydrolys.

Cystin Cysteinsyra

En svår uppgift i aminosyraanalys är bestämning av tryptofan. Som redan nämnts förstörs det nästan fullständigt under sur hydrolys (upp till 90%). Därför, för att bestämma tryptofan, utförs en av varianterna av alkalisk hydrolys av 2 N. NaOH, 100ºС, 16–18 timmar i närvaro av 5 % tennklorid eller 2 N. bariumhydroxid, i vilken den förstörs något (upp till 10%). Minimal nedbrytning sker i närvaro av tioglykolsyra och förhydrolyserad stärkelse. (Under alkalisk hydrolys förstörs serin, treonin, arginin och cystein). Efter neutralisering med en blandning av citron- och saltsyra analyseras hydrolysatet omedelbart (för att undvika gelning) på en aminosyraanalysator. När det gäller de många kemiska metoderna för att bestämma tryptofan är de som regel dåligt reproducerbara i livsmedel och därför rekommenderas inte användningen av dem.

För köttprodukter är en ytterligare essentiell aminosyra hydroxiprolin, som kännetecknar mängden bindvävsproteiner i kött. Det kan bestämmas genom jonbyteskromatografi med automatiska analysatorer eller genom en kemisk kolorimetrisk metod. Metoden är baserad på neutralisering av det sura hydrolysatet till pH 6,0, efterföljande oxidation av hydroxiprolin med användning av en 1,4 % lösning av kloramin T (eller kloramin B) i en blandning av propylalkohol och buffert, kolorimetrisk bestämning vid 533 nm av oxidationsprodukterna av hydroxiprolin efter reaktion med 10% - en lösning av para-dimetylaminobensaldehyd i en blandning av perklorsyra och propylalkohol (1:2).

På grund av det faktum att tyrosin, fenylalanin och prolin delvis kan oxideras i närvaro av syre, rekommenderas standardsyrahydrolys att utföras i kväveatmosfär. Ett antal aminosyror, inklusive leucin, isoleucin och valin, kräver längre syrahydrolys för deras fullständiga isolering från proteiner - upp till 72 h. Inom biokemi, när man analyserar proteiner, hydrolyseras parallella prover i 24, 48, 72 och 96 timmar.

För att exakt kvantifiera alla aminosyror är det nödvändigt att utföra 5 olika hydrolyser, vilket avsevärt förlänger bestämningen. Vanligtvis utförs 1–2 hydrolys (standard med saltsyra och med preliminär oxidation med permyrsyra).

För att undvika förlust av aminosyror, bör avlägsnande av överskott av syra under syrahydrolys utföras omedelbart genom upprepad indunstning i en vakuumexsickator med tillsats av destillerat vatten.

När analysatorn fungerar korrekt, fungerar jonbytarkolonner ganska lång tid utan att ersätta hartset. Men om proven innehåller betydande mängder färgämnen och lipider, blir kolonnen snabbt igensatt och flera regenereringar, ibland involverade ompackning av kolonnen, krävs för att återställa dess separationsförmåga. För produkter som innehåller mer än 5 % fett rekommenderas därför att först avlägsna lipider genom extraktion. Tabell 2.3 visar förutsättningarna för provberedning av huvudlivsmedelsprodukter vid analys av aminosyrasammansättningen.

Tabell 2.3. – Villkor för att förbereda livsmedelsprover för analys

Kontrollfrågor:

1. Definiera begreppet "proteiner".

2. Vilka grupper delas proteiner in i efter deras funktioner i kroppen?

3. Vilken roll har proteiner i mänsklig näring?

6. Vilka essentiella aminosyror känner du till och vilka aminosyror kan bli essentiella?

7. Hur bestäms den totala kvävehalten i livsmedel?

8. Hur bestäms aminosyrasammansättningen av proteiner?

9. Vilka metoder för att bestämma aminosyror känner du till?

§ 2.4. Kolhydrater

Kolhydrater finns i stor utsträckning i växter och djur, där de utför både strukturella och metaboliska funktioner. I växter, under fotosyntesprocessen, syntetiseras glukos från koldioxid och vatten, som sedan lagras i form av stärkelse eller omvandlas till cellulosa, växternas strukturella grund. Djur kan syntetisera ett antal kolhydrater från fetter och proteiner, men de flesta kolhydrater kommer från vegetabiliska livsmedel.

Proteinsyntes sker på ribosomer i form av en primär struktur, d.v.s. lokaliserad i en viss mängd och en viss sekvens av aminosyror sammankopplade av peptidbindningar bildade av karboxyl- och α-aminogrupper av angränsande aminosyrarester. Peptidbindning är stel, kovalent, genetiskt bestämd. I strukturformler avbildas den som en enkelbindning : i själva verket är denna bindning mellan kol och kväve har karaktären av en partiell dubbelbindning:

Rotation runt den är omöjlig och alla fyra atomerna ligger i samma plan, d.v.s. i samma plan. Rotationen av andra bindningar runt polypeptidryggraden är ganska fri.

Den primära strukturen upptäcktes 1898 av Danilevsky, professor vid Kazan University. 1913 syntetiserade Emil Fischer de första peptiderna.

Denna sekvens av aminosyror är unik för varje protein och fixeras genetiskt. När syntesprocessen av den primära proteinstrukturen på ribosomen störs, kan olika genetiska sjukdomar utvecklas. Till exempel, när två aminosyror i hemoglobinet störs, utvecklas sicklecellanemi.

För att studera aminosyrasammansättningen av proteiner används en kombination (eller en av dem) av sur (HCl), alkalisk (Ba(OH)2) och, mer sällan, enzymatisk hydrolys. Det har konstaterats att under hydrolysen av rent protein som inte innehåller föroreningar frigörs 20 olika aminosyror. Alla andra aminosyror som upptäckts i vävnader hos djur, växter och mikroorganismer (mer än 300) finns i naturen i fritt tillstånd eller i form av korta peptider eller komplex med andra organiska ämnen.

α-aminosyror är derivat av karboxylsyror där en väteatom, vid α-kolet, är ersatt av en aminogrupp (-NH2), till exempel: det bör betonas att alla aminosyror som utgör naturliga proteiner är en -aminosyror, även om aminogruppen i fria aminokarboxylsyror kan lokaliseras, som vi kommer att se nedan, i β-, γ-, δ-, ε-positioner.

9. Sekundär struktur av proteiner - α-helixar och β-strukturer. Domänernas struktur och funktionella roll.

Sekundär struktur är det rumsliga arrangemanget av en polypeptidkedja i form av en α-helix eller β-ark, oberoende av typerna av sidoradikaler och deras konformation. Den stabiliseras av vätebindningar, som är slutna mellan peptid-, amid- (-N-H) och karbonid- (-C=O)-grupper, dvs. ingår i peptidenheten och disulfidbryggor mellan cysteinrester

Pauling och Corey föreslog en modell av proteinets sekundära struktur i form av en vänsterhänt α-helix, där vätebindningar är slutna mellan var första och var fjärde aminosyra, vilket gör det möjligt att bevara proteinets naturliga struktur, dess enklaste funktioner och skyddar den från förstörelse. Det finns 3,6 aminosyrarester per varv av helixen; helixstigningen är 0,54 nm. Alla peptidgrupper deltar i bildandet av vätebindningar, vilket säkerställer maximal stabilitet, minskar hydrofilicitet och ökar proteinmolekylens hydrofobicitet. Alfahelixen bildas spontant och är den mest stabila konformationen, motsvarande den minsta fria energin

Pauling och Corey föreslog också en annan ordnad struktur - ett vikt β-ark. I motsats till den kondenserade α-helixen är β-skikten nästan helt långsträckta och kan placeras både parallella och antiparallella

Disulfidbroar och vätebindningar deltar också i stabiliseringen av dessa strukturer.

Supersekundär struktur är en högre organisationsnivå av en proteinmolekyl, representerad av en ensemble av sekundära strukturer som interagerar med varandra: α-helix - två antiparallella sektioner som interagerar med hydrofoba komplementära ytor (enligt depression-utskjutningsprincipen) αсα, supercoiling av α-helixen, (βхβ) element i globulära proteiner, representerade av två parallella β-kedjor förbundna med ett x-segment, βαβαβ-element, representerade av två segment av en α-helix insatt mellan tre parallella β-kedjor.

Följande stadier kan särskiljas för att klargöra den primära strukturen hos proteiner och peptider:

1. Isolering av protein i dess rena form och bestämning av dess molekylvikt

2. Bestämning av aminosyrasammansättning

3. Bestämning av N-terminal aminosyra

4. Bestämning av den C-terminala aminosyran

5. Bestämning av aminosyrasekvens

Isolering av protein i sin rena form. Typiskt innehåller utgångsmaterialet många olika proteiner. I detta avseende uppstår problemet med att isolera proteinet av intresse i dess rena form från denna blandning. Vid rening av proteiner används metoder som är baserade på skillnaden:

1. Ytladdning av proteiner

2. Molekylstorlek hos proteiner (beroende på deras molekylvikt)

3. Biologisk aktivitet på grund av bindning till substrat eller inhibitorer

Separation av proteiner baserat på skillnader i ytladdning. Den totala elektriska laddningen på ytan av ett protein vid ett givet pH-värde kan vara negativ, neutral eller positiv. För att separera proteiner med olika laddningar, vilket var fallet med aminosyror, kan metoden med jonbyteskromatografi (se ovan) användas. Proteinkoncentrationen i provrör med eluatet bestäms med hjälp av en spektrofotometer baserad på intensiteten av absorptionen av ultraviolett ljus och ett grafiskt beroende plottas av volymen vätska som strömmar ut ur den kromatografiska kolonnen.

Separation av proteiner efter molekylvikt. Om du föreställer dig proteinmolekyler i form av bollar av olika storlekar, vars storlek beror på deras molekylvikt, så visar det sig att större bollar kommer att ha en större molekylmassa eller molekylstorlek. Det betyder att proteiner kan separeras som partiklar i en sikt – en molekylsikt som bildas av en gel. Denna metod kallas ofta gelfiltrering eller. Nedan visas en illustration av hur gelfiltrering kan separera en blandning av proteiner av olika storlekar (Fig. 1.12).

Den kromatografiska kolonnen fylls med en svälld gel. Gelpartiklarna är gjorda av tvärbundet polysackaridmaterial och innehåller ett stort antal mikroporer. Storleken på mikroporerna väljs på ett sådant sätt att de mindre molekylerna som separeras tränger in i dem, medan de större inte kan göra detta. Blandningen av proteiner som ska separeras appliceras på toppen av kolonnen och elueras med en buffertlösning. Stora molekyler som förs bort av flödet av nedåtgående vätska, som inte kan penetrera gelpartiklarnas porer, kommer att röra sig snabbare. Mindre molekyler tränger in i porerna och stannar där. Om du samlar lösningen som strömmar från kolonnen i lika delar i provrör, kommer det att visa sig att tidigare delar av den strömmande vätskan kommer att innehålla proteiner av stora storlekar och senare delar kommer att innehålla proteiner av mindre storlekar. Genom att välja porstorleken kan separationen av en mängd olika proteinblandningar uppnås.

Fig.1.12. Schematisk illustration av proteinseparation genom gelfiltrering

Om vi ​​tar hänsyn till att storleken på en molekyl beror på molekylvikten, visar det sig att genom att separera proteiner genom gelfiltrering är det samtidigt möjligt att bestämma dess molekylvikt.

Fig.1.13. Diagram över beroendet av proteiners molekylvikt på volymen av deras produktion från den kromatografiska kolonnen under gelfiltrering

Volymen eluat som strömmar från kolonnen är omvänt proportionell mot logaritmen för proteinets molekylvikt. Det räcker alltså att känna till volymen vätska i vilken proteinet av intresse kom ut ur kolonnen så att man med hjälp av en liknande graf kan fastställa dess molekylvikt (Fig. 1.13).

En annan metod som låter dig separera proteiner beroende på deras molekylvikt är gelelektrofores(se ovan).

Ultracentrifugering. Om du skakar ett kärl fyllt med sand och vatten och sedan placerar det på en plan yta kommer sanden snabbt att lägga sig till botten på grund av tyngdkraften. Detta kommer inte att hända med högmolekylära ämnen i lösning, eftersom termisk (brownisk) rörelse bibehåller deras enhetliga fördelning i lösningen. Sedimentering av makromolekyler, som sandkorn, kommer endast att ske om de utsätts för betydande acceleration.