Методи мікроскопії таблиці. Сучасні методи мікроскопічних досліджень

Основним методом вивчення біологічних мікрооб'єктів є світлова та електронна мікроскопія, які широко використовуються в експериментальній та клінічній практиці.

Мікроскопіювання - головний метод вивчення мікрооб'єктів, що використовується в біології понад 300 років. Для вивчення гістологічних препаратів застосовують різноманітні види світлових мікроскопів та електронні мікроскопи. З моменту створення та застосування перших мікроскопів вони постійно вдосконалювалися. Сучасні мікроскопи є складними оптичними системами, що мають високу роздільну здатність. Розмір найменшої структури, яку можна бачити за допомогою мікроскопа, визначається найменшою роздільною здатністю (d), яка в основному залежить від довжини хвилі світла (λ) і довжини хвиль електромагнітних коливань потоку електронів та ін. Ця залежність наближено визначається формулою d= λ/2. Таким чином, чим менша довжина хвилі, тим менша відстань, і тим менші за розмірами мікроструктури можна бачити в препараті.

Світлова мікроскопія.Для вивчення гістологічних мікрооб'єктів застосовують звичайні світлові мікроскопи та їх різновиди, у яких використовуються джерела світла із хвилями різної довжини. У звичайних світлових мікроскопах джерелом освітлення є природне або штучне світло (рис. 2.1). Мінімальна довжина хвилі видимої частини діапазону приблизно 0,4 мкм. Отже, для звичайного світлового мікроскопа найменша відстань приблизно становить 0,2 мкм, а загальне збільшення (твір збільшення об'єктиву на збільшення окуляра) може бути 1500-2500.

Таким чином, за допомогою світлового мікроскопа можна побачити не лише окремі клітини розміром від 4 до 150 мкм, а й їх внутрішньоклітинні структури – органели, включення. Для посилення контрастності мікрооб'єктів застосовують їхнє фарбування.

Ультрафіолетова мікроскопія.Це різновид світлової мікроскопії. В ультрафіолетовому мікроскопі використовують короткі ультрафіолетові промені з довжиною хвилі близько 0,2 мкм. Відстань, що дозволяється тут у 2 рази менше, ніж у звичайних світлових мікроскопах, і становить приблизно 0,1 мкм. Отримане в ультрафіолетових променях невидиме оком зображення перетворюється на видиме за допомогою реєстрації на фотопластинці або шляхом застосування спеціальних пристроїв (люмінесцентний екран, електронно-оптичний перетворювач).

Флюоресцентна (люмінесцентна) мікроскопія.Явлення флюоресценції полягають у тому, що атоми та молекули ряду речовин, поглинаючи коротко-

Мал. 2.1.Мікроскопи для біологічних досліджень:

а- світловий біологічний мікроскоп «Біолам-С»: 1 – основа; 2 - ту-бусоутримувач; 3 – похилий тубус; 4 – окуляр; 5 – револьвер; 6 – об'єктиви; 7 – столик; 8 - конденсор з ірисовою діафрагмою; 9 - гвинт конденсора; 10 – дзеркало; 11 - мікрометричний гвинт; 12 - макрометричний гвинт; б- електронний мікроскоп ЕМВ-100АК з автоматизованою системою обробки зображень: 1 - колонка мікроскопа (з електронно-оптичною системою та камерою для зразків); 2 – пульт управління; 3 – камера з люмінесцентним екраном; 4 – блок аналізу зображень; 5 - датчик відеосигналу; в- конфокальний мікроскоп: 1 – світловий мікроскоп; 2 - реєстратор зображення (фотоелектронний помножувач);

3 - пристрій для переміщення світлового променя по осі X, Y, Z;

4 - блок живлення та стійка управління лазерами; 5 - комп'ютер для обробки зображень

хвильові промені, переходять у збуджений стан. Зворотний перехід із збудженого стану в нормальний відбувається з випромінюванням світла, але з більшою довжиною хвилі. У флюоресцентному мікроскопі як джерела світла для збудження флюоресценції застосовують ртутні або ксенонові лампи надвисокого тиску, що володіють високою яскравістю в області спектру 0,25-0,4 мкм (ближні ультрафіолетові промені) і 0,4-0,5 мкм (си -фіолетові промені). Довжина світлової хвилі флюоресценції завжди більша за довжину хвилі збудливого світла, тому їх розділяють за допомогою світлофільтрів і вивчають зображення об'єкта тільки у світлі флюоресценції. Розрізняють власну, чи первинну, і наведену, чи вторинну, флюоресценцію. Будь-яка клітина живого організму має власну флюоресценцію, проте вона часто буває надзвичайно слабкою.

Первинна флюоресценція має серотонін, катехоламіни (адреналін, норадреналін), що містяться в нервових, опасистих та інших клітинах, після фіксації тканин у парах формальдегіду при 60-80 °С (метод Фалька).

Вторинна флюоресценція виникає під час обробки препаратів спеціальними барвниками - флюорохромами.

Існують різні флюорохроми, які специфічно зв'язуються з певними макромолекулами (акридиновий помаранчевий, родамін, флюоресцеїн та ін.). Наприклад, при обробці препаратів акридиновим помаранчевим ДНК та її сполуки у клітинах мають яскраво-зелене, а РНК та її похідні – яскраво-червоне світіння. Існує багато барвників, за допомогою яких можна виявити білки, ліпіди, внутрішньоклітинні іони кальцію, магнію, натрію та ін. Таким чином, спектральний склад випромінювання несе інформацію про внутрішню будову об'єкта та його хімічний склад. Варіант методу флюоресцентної мікроскопії, при якому і збудження, і випромінювання флюоресценції відбуваються в ультрафіолетовій області спектра, отримав назву методу флюоресцентної ультрафіолетової мікроскопії.

Для підвищення контрастності флюорохромованих об'єктів застосовується конфокальний варіантоптичного мікроскопа (див. рис. 2.1, в). Як висвітлення використовується пучок монохроматичного світла малого діаметра, який створює лазерне джерело. У кожний момент часу у фокусі мікроскопа знаходиться невелика ділянка (об'єм) клітини. Пучок світла переміщається об'єктом (сканує об'єкт по осях X, Y, Z).При кожному переміщенні пучка світла однією з ліній сканування виходить інформація про досліджувану структуру, що знаходиться в даній точці (обсязі) по лінії сканування (оптичному зрізі клітини), наприклад про локалізації білків у складі мікротрубочок в клітині. Вся інформація від кожної точки сканування клітини передається на комп'ютер, об'єднується за допомогою спеціальної програми і видається на екран монітора у вигляді контрастного зображення. За допомогою даного методу мікроскопії виходить інформація про форму клітин, цитоскелі, структуру ядра, хромосом та ін. За допомогою програми комп'ютер на основі отриманої інформації по кожній лінії сканування створює об'ємне зображення клітини, що дозволяє розглядати клітину під різними кутами зору.

Фазово-контрастна мікроскопія.Цей метод служить отримання контрастних зображень прозорих і безбарвних живих об'єктів, невидимих ​​при звичайних методах мікроскопування. Метод заснований на тому, що світло, проходячи структури з різним коефіцієнтом спотворення, змінює свою швидкість. Використовувана конструкція оптики мікроскопа дає можливість перетворити не сприймаються оком фазові зміни світла, що пройшов через незабарвлений препарат, в зміни його амплітуди, тобто яскравості одержуваного зображення. Метод фазового розмаїття забезпечує контрастність досліджуваних незабарвлених структур за рахунок спеціальної кільцевої діафрагми, що міститься в конденсорі, і так званої фазової пластинки, що знаходиться в об'єктиві. Різновидом методу фазового розмаїття є метод фазово-темнопольного розмаїття, що дає негативне в порівнянні з позитивним фазовим контрастом зображення.

Мікроскопія у темному полі.У темнопольному мікроскопі лише світло, яке дає дифракцію (обгинання хвилями) структур у препараті, досягає об'єктиву. Відбувається це завдяки наявності у мікроскопі спеціального конденсора, який висвітлює препарат суворо косим світлом; промені від освітлювача прямують збоку. Таким чином, поле виглядає темним, а дрібні частки в препараті відбивають світло, яке далі потрапляє до об'єктиву. У клініці цей метод застосовують для вивчення кристалів у сечі (сечова кислота, оксалати), для демонстрації спірохет, зокрема Treponema pallidum,викликає сифіліс, та ін.

Інтерференційна мікроскопія.Різновидами фазово-контрастного мікроскопа є інтерференційний мікроскоп, призначений для кількісного визначення маси тканини. Диференціальний інтерференційний мікроскоп (з оптикою Номарського) використовують із вивчення рельєфу поверхні клітин та інших біологічних об'єктів.

В інтерференційному мікроскопі пучок світла від освітлювача поділяється на два потоки: один проходить через об'єкт і змінюється фазою коливання, другий йде, минаючи об'єкт. У призмах об'єктиву обидва пучки накладаються один на одного. В результаті будується зображення, в якому ділянки мікрооб'єкта різної товщини та щільності розрізняються за рівнем контрастності. Провівши кількісну оцінку змін, визначають концентрацію та масу сухої речовини.

Фазово-контрастний та інтерференційний мікроскопи дозволяють вивчати живі клітини.Вони використовують інтерференція, що виникає при комбінації двох наборів хвиль і створює зображення мікроструктур. Перевагою фазово-контрастної, інтерференційної та темно-польової мікроскопії є можливість спостерігати клітини у процесі руху та мітозу. При цьому реєстрація руху клітин може проводитись за допомогою цейтраферної (покадрової) мікровідеозйомки.

Поляризаційна мікроскопія.Поляризаційний мікроскоп є модифікацією світлового мікроскопа, в якому встановлено два поляризаційні фільтри: перший (поляризатор) - між пучком світла та об'єктом, а другий (аналізатор) - між лінзою об'єктива та оком. Через перший фільтр світло проходить тільки в одному напрямку, другий фільтр має головну вісь,

яка розташовується перпендикулярно до першого фільтра, і він не пропускає світло. Виходить ефект темного поля. Структури, що містять подовжньо орієнтовані молекули (колаген, мікротрубочки, мікрофіламенти), і кристалічні структури, мають властивість обертати вісь світлових променів, що виходять з поляризатора. При зміні осі обертання ці структури виявляються як світяться на темному тлі. Здатність кристалів або паракристалічних утворень до роздвоєння світлової хвилі на звичайну і перпендикулярну до неї називається подвійним променезаломленням. Таку здатність мають фібрили поперечносмугастих м'язів.

Електронна мікроскопіяВеликим кроком уперед у розвитку техніки мікроскопії було створення та застосування електронного мікроскопа (див. рис. 2.1). В електронному мікроскопі використовується потік електронів з короткими хвилями, ніж у світловому мікроскопі. При напрузі 50 000 довжина хвилі електромагнітних коливань, що виникають при русі потоку електронів у вакуумі, дорівнює 0,0056 нм. Теоретично розраховано, що відстань у цих умовах може бути близько 0,002 нм, або 0,000002 мкм, тобто в 100 000 разів менше, ніж у світловому мікроскопі. Практично в сучасних електронних мікроскопах роздільна здатність становить близько 0,1-0,7 нм.

У гістології використовуються трансмісійні (просвічують) електронні мікроскопи (ТЕМ), скануючі (растрові) електронні мікроскопи (СЕМ) та їх модифікації. За допомогою ТЕМ можна отримати лише площинне зображення мікрооб'єкта, що вивчається. Для отримання просторового ставлення до структур застосовують СЕМ, здатні створювати тривимірне зображення. Растровий електронний мікроскоп працює за принципом сканування електронним мікрозондом об'єкта, що досліджується, тобто послідовно «обмацує» гостро сфокусованим електронним пучком окремі точки поверхні. Таке дослідження об'єкта називається скануванням(зчитуванням), а малюнок, яким рухається мікрозонд, - растром.Отримане зображення виводиться на екран, електронний промінь якого рухається синхронно з мікрозондом.

Головними перевагами растрової електронної мікроскопії є велика глибина різкості, широкий діапазон безперервної зміни збільшення (від десятків до десятків тисяч разів) і висока роздільна здатність. Сучасними варіантами приладів вивчення поверхні об'єкта є атомно-силовой мікроскоп і скануючий тунельний мікроскоп.

Електронна мікроскопія з використанням методу заморожування- сколюваннязастосовується вивчення деталей будови мембран і міжклітинних сполук. Для виготовлення сколів клітини заморожують за низької температури (-160 °С). При дослідженні мембрани площина сколу проходить через середину бислоя ліпідів. Далі на внутрішні поверхні отриманих половинок мембран напилюють метали (платина, паладій, уран), вивчають їх за допомогою ТЕМ та мікрофотографії.

Метод кріоелектронної мікроскопії.Швидко заморожений тонкий шар (близько 100 нм) зразка тканини поміщають на мікроскопічні ґрати та досліджують у вакуумі мікроскопа при -160 °С.

Метод електронної мікроскопії «заморожування – травлення»застосовують вивчення зовнішньої поверхні мембран клітин. Після швидкого заморожування клітин за дуже низької температури блок розколюють лезом ножа. Кристали льоду, що утворюються, видаляють шляхом сублімації води у вакуумі. Потім ділянки клітин відтіняють, напилюючи тонку плівку важкого металу (наприклад, платини). Метод дозволяє виявляти тривимірну організацію структур.

Таким чином, методи заморожування - сколювання та заморожування - травлення дозволяють вивчати нефіксовані клітини без утворення в них артефактів, що викликаються фіксацією.

Методи контрастування солями важких металів дозволяють досліджувати в електронному мікроскопі окремі макромолекули – ДНК, великих білків (наприклад, міозин). При негативному контрастуванні вивчають агрегати макромолекул (рибосоми, віруси) чи білкові филаменты (актинові нитки).

Електронна мікроскопія ультратонких зрізів, отриманих методом кріоультрамікротомії.При цьому методі шматочки тканин без фіксації та заливання у тверді середовища швидко охолоджують у рідкому азоті при температурі -196 °С. Це забезпечує гальмування метаболічних процесів клітин та перехід води з рідкої фази у тверду. Далі блоки ріжуть на ультрамікротомі за низької температури. Такий метод приготування зрізів зазвичай використовують визначення активності ферментів, і навіть щодо імунохімічних реакцій. Для виявлення антигенів застосовують антитіла, пов'язані з частинками колоїдного золота, локалізацію якого легко виявити препаратах.

Методи надвисоковольтної мікроскопії.Використовують електронні мікроскопи з прискорюючою напругою до 3 000 000 В. Перевага цих мікроскопів у тому, що вони дозволяють досліджувати об'єкти великої товщини (1-10 мкм), так як за високої енергії електронів вони менше поглинаються об'єктом. Стереоскопічна зйомка дозволяє отримувати інформацію про тривимірну організацію внутрішньоклітинних структур з високою роздільною здатністю (близько 0,5 нм).

Залежно від властивостей об'єкта світло змінює свої фізичні властивості – колір (довжину хвилі), яскравість (амплітуду хвилі), фазу, що використовуються у сучасних мікроскопах для створення контрасту.

Мал. 1. Мікроскоп МБІ-3: 1 – ніжка, або черевик; 2 - баранчики грубого руху тубуса; 3 - тубусоутримувач; 4 – окуляри; 5 – бінокулярна насадка; 6 – головка для кріплення револьвера з посадковим гніздом для зміни тубусів; 7 - гвинт кріплення бінокулярної насадки; 8 – револьвер на санках; 9 – об'єктиви; 10 – предметний столик; 11 - баранець поздовжнього руху препаратоутримувача; 12 - баранець поперечного руху препаратоутримувача; 13 - апланатичний конденсор прямого та косого освітлення; 14 - центрувальні гвинти столика; 15 - головка гвинта, що фіксує верхню частину предметного столика; 16 – кронштейн конденсора; 17 - баранець мікромеханізму; 18 - дзеркало; 19 – коробка з мікромеханізмом.

Найбільш легко піддаються фарбуванню фіксовані, убиті препарати. Такі нерухомі препарати можуть бути з високою точністю розглянуті та сфотографовані через мікроскоп, але вони не дають можливості оцінити різні форми життєдіяльності об'єкта, що мікроскопується (рух, злиття, фагоцитоз тощо). Відомі барвники, які пов'язуються з живими клітинами, не порушуючи їхньої життєдіяльності.

Вітальна(Прижиттєва) мікроскопія показує, що багато структур живої клітини порівняно мало змінюються при вмілої фіксації і подальшому фарбуванні. Цим підтверджується висока наукова цінність інформації, одержуваної мікроскопією пофарбованих об'єктів. Вітальна мікроскопія можлива і без фарбування, якщо в звичайний мікроскоп ввести так званий конденсор темнопольний. Він висвітлює об'єкт так, що в око спостерігача потрапляють тільки ті промені, які розсіялися на частинках об'єкта і тим самим змінили напрямок свого поширення. Промені, що пройшли крізь фон без розсіяння, в око не потрапляють. Тому частки об'єкта світяться і яскраво виділяються темному тлі (темному полі). Частинки об'єкта добре видно, навіть якщо їх розміри менші від дозволеної відстані.

Темнопільнамікроскопія забезпечує найбільший можливий контраст зображення, але чіткість його та корисне збільшення помітно нижче, ніж при звичайній мікроскопії. Темнопольна мікроскопія успішно застосовувалася для вивчення спірохет, лептоспір та інших слабо офарблюваних мікроорганізмів. При роботі з гістологічними препаратами вона не застосовується.

Технічно самостійним варіантом темнопольної мікроскопії є ультрамікроскопія, при якій найдрібніші частки, що вивчаються, висвітлюються потужним бічним пучком світла і видно точками на чорному тлі. Ультрамікроскопія дозволяє підраховувати частки, оцінювати їх розміри та інші властивості. Застосовується вивчення колоїдних розчинів, аерозолів, суспензій.

Останніми роками темнопольна мікроскопія застосовується дедалі рідше, оскільки з'явилися два нових типи контрастирующих приладів із значно кращими характеристиками - фазово-контрастный (рис. 2, і б) і амплітудно-контрастний мікроскопи. Технічно вони подібні, але вони використовують різні зміни світлового променя в об'єкті. Промінь, що пройшов через тло зразка, в ідеальному випадку не зазнає жодних змін. Він проходить через певні ділянки об'єктива. Промінь, що пройшов через об'єкт, піддається дифракції, тобто розпадається на пучки спадної інтенсивності, які виходять з об'єкта під різними кутами. Інші властивості променя (амплітуда, довжина хвилі, фаза) змінюються у різних ступенях залежно від особливостей об'єкта.

Мал. 2. Мікроскоп МБІ-3(а) з фазово-контрастним пристроєм КФ-1(б): 1 - конденсор револьверної системи; г - набір об'єктивів та кільцевих діафрагм; 3 – допоміжний мікроскоп.

Майже всі живі мікроскопічні об'єкти виглядають у звичайному мікроскопі ледь помітними, прозорими, тому що вони майже не змінюють ні амплітуди, ні кольору променя, що пройшов через них.

Вони змінюють лише фазу його хвилі, але це зміна не вловлюється ні оком, ні фотопластинкою. Пучок променів, дифрагованих об'єктом і зрушених ним по фазі, проходить через ділянки об'єктива, де можуть пройти прямі, недифрагированные промені фону. Практично неважко визначити, де саме пройдуть ці промені. Якщо накрити цю ділянку однієї з лінз об'єктива напівпрозорою пластинкою, здатної змінити фазу, інтенсивність, колір або всі ці три властивості разом, то зображення фону змінить свою фазу, зменшиться його яскравість або зміниться колір. Промені, що пройшли через об'єкт і відхилені (дифраговані) ним, обійдуть вкладену в об'єктив платівку і, отже, не набудуть тих властивостей, які придбали пройшовши через пластинку промені фону. В результаті різниця між променями фону та об'єкта зросте. Якщо різниця фаз між променями фону та об'єкта досягає 1/4 довжини хвилі, то в кінцевому зображенні виникає помітний для ока та фотопластинки контраст: темний об'єкт на світлому фоні або, навпаки, залежно від структури платівки, яку в цьому випадку називають «фазовою» . Якщо ж платівка змінює головним чином яскравість і колір фону, такий мікроскоп слід назвати амплітудно-контрастним (велике поширення набуло більш коротке, хоча і не зовсім правильне назва «аноптральний»). Таким чином, різниця між фазово-контрастним та амплітудно-контрастним мікроскопом визначається властивостями платівки в об'єктиві, що змінює властивості недифрагованих променів фону. Зображення, побудовані цими мікроскопами, значно яскравіше і багатшими деталями (рис. 3 і 4), ніж темнопольні картини.

Мал. 3. Культура багатоклітинної бактерії Caryophanon latum Peshkoff. Амплітудно-контрастна мікроскопія.
Мал. 4. Мікроколонії Вас. megatherium, зараженої фагом. Амплітудно-контрастна мікроскопія.

З появою фазово- та амплітудно-контрастних мікроскопів вітальна мікроскопія отримала чудову техніко-методичну базу, можливості якої близькі до граничних для світлової оптики. Жодної фіксації або фарбування об'єкта ці прилади не вимагають. Сучасна вітальна мікроскопія надзвичайно розширила наші знання про поведінку та динаміку живих мікрооб'єктів у природних та лабораторних умовах проживання та експерименту. Прискорена (рапід) і уповільнена (цейтрафферна) мікрокінозйомка зробили доступними для дослідження процеси, швидкість перебігу яких занадто велика або занадто мала візуального спостереження.

фазово-контрастні та амплітудно-контрастні (аноптральні) пристрої, що випускаються промисловістю, недорогі, легко монтуються на серійних мікроскопах; використання їх не становить труднощів. Ці прилади, безсумнівно, будуть знаходити нові галузі застосування як у наукових дослідженнях, так і в медичній практиці.

Ультрафіолетова мікроскопіязаснована на здатності деяких речовин вибірково поглинати ультрафіолетові промені з певною довжиною хвилі. Це дозволяє наочно демонструвати та вивчати, у тому числі кількісно, ​​розподіл речовин у живих клітинах чи фіксованих препаратах. Так, наприклад, білки та нуклеїнові кислоти однаково прозорі для видимого світла; розглядаючи незабарвлену клітину у видимому світлі, не можна визначити, де розташований білок чи нуклеїнова кислота. Але ультрафіолетове проміння певної довжини нуклеїнова кислота поглинає значно сильніше, ніж білок. Тому в ультрафіолетовому мікроскопі ділянка, що містить нуклеїнову кислоту, виглядає значно темнішою. Так як ультрафіолетові промені безпосередньо оком не сприймаються, доводиться застосовувати спеціальні перетворювачі світла. Ультрафіолетова мікроскопія технічно значно складніша за звичайну світлову, її апаратура дорожча і методика тонша. Незважаючи на це, застосування її виправдане, оскільки наукова значущість швидкого топографічного опису хімічного складу живої клітини дуже велика.

Набагато доступніша і перспективніша люмінесцентна мікроскопія (див.), що широко застосовується нині в науково-дослідних та клініко-діагностичних лабораторіях. При цьому живий об'єкт обробляють спеціальними барвниками, які, освітлені синім, фіолетовим або ультрафіолетовим світлом, починають світитися, випромінюючи довші хвилі (зелені, жовті). Колір збудженого вторинного світіння залежить від хімічних властивостей об'єкта і введеного барвника.

Поляризаційна мікроскопіязаснована на зміні площини коливань світлової хвилі після проходження через кристали. У практичній медицині не застосовується.

Сучасна мікроскопія потребує застосування різноманітної допоміжної апаратури. Нагрівальні столики та термостати дозволяють витримувати та спостерігати об'єкт тривалий час при заданій температурі. Для тривалого вирощування мікробів або тканинних культур у полі зору сильного об'єктиву служать різноманітні мікрокамери. Окулярні та об'єктивні мікрометри уможливлюють точні вимірювання мікрооб'єктів. Промисловість випускає мікроманіпулятори для операцій на мікрооб'єктах. Для отримання стереоскопічного зображення при збільшення до 100 разів призначені бінокулярні лупи (див.) і стереомікроскопи (рис. 5). Широко виробляється та використовується апаратура для мікрофотографії та мікрокінозйомки (рис. 6). також Мікроскопічна техніка.

Мал. 5. Стереоскопічний мікроскоп МБС-1.

Мал. 6. Мікрокіноустановка МКУ-1.

Крім світлооптичної мікроскопії до методів мікроскопії відносять: темнопольну, фазово-контрастну, люмінесцентну та електронну мікроскопії.

4.3.4.1 Темнопольна мікроскопія

Метод спостереження в темному полі, розроблений австрійським ученим Зігмонді, дає можливість підвищити роздільну здатність мікроскопа в 10 разів. В основі методу лежить явище Тіндаля - висвітлення об'єкта косими променями світла. Ці промені, не потрапляючи в об'єктив, залишаються невидимими для ока, тому поле зору виглядає темним. У той же час оптично неоднорідні клітини, що знаходяться в полі зору і потрапляють у сферу проходження променів, відхиляють їх настільки, що промені потрапляють в об'єктив. Тоді спостерігач бачить у темному полі об'єкти, що інтенсивно світяться, оскільки промені світла йдуть саме від них.

Темне поле зору можна створити у світлооптичному мікроскопі, замінивши звичайний конденсор темнопольним та застосувавши для освітлення джерело сильного світла. Однак ефект темного поля може бути досягнутий тільки в тому випадку, якщо апертура конденсора перевищує 0,2 ... 0,4 одиниці апертуру об'єктива. Для дослідження у темному полі рекомендується конденсор з апертурою близько 1,2 та об'єктиви з апертурою від 0,65 до 0,85.

Метод використовується для дослідження живих клітин мікроорганізмів. Особливо він цінний функціонально-морфологічного вивчення великих об'єктів типу дріжджів. Цитоплазма дріжджових організмів (за умови яскравого джерела світла та гарного апохроматичного імерсійного об'єктива) слабко та рівномірно опалескує. На її тлі чітко розрізняються чорні оптично пусті вакуолі. Краплі жиру виділяються як сильно блискучі гранули. Протопласт клітин, що гинуть, опалескує молочно-білим кольором.

4.3.4.2 Фазово-контрастна мікроскопія

Людське око виявляє лише відмінності у довжині (кольорі) та амплітуді (інтенсивності, контрастності) світлової хвилі, але не вловлює відмінностей у фазі.

Майже всі живі клітини прозорі, оскільки світлові промені, проходячи через живу клітину, не змінюють своєї амплітуди, хоч і змінюються фазою.

Перетворити фазовий (неконтрастний) препарат на «амплітудний» (контрастний) можна, або забарвлюючи об'єкт (для живих клітин цей прийом малопридатний), або знижуючи апертуру конденсора шляхом прикриття діафрагми (прийом також небажаний, оскільки знижується роздільна здатність мікроскопа).

Метод фазово-контрастної мікроскопії, запропонований голландським фізиком Цернике для спостереження за прозорими об'єктами, заснований на перетворенні фазових змін, що зазнають світлової хвилі при проходженні через об'єкт, видимі амплітудні за допомогою спеціального оптичного пристрою. Якщо в об'єктив звичайного мікроскопа вмонтувати спеціальний диск - фазову пластинку з кільцем, а в конденсор - кільцеву діафрагму (непроникну для променів світла пластинку, в якій є прозора щілина у вигляді кільця), так щоб через конденсор і об'єктив проходило лише кільце світла, яке потім поєднується з кільцем фазової пластинки об'єктива, то фази проходить світлового променя зсуваються і можна спостерігати ефект фазового розмаїття.

Для проведення досліджень необхідно на додаток до світлового мікроскопа мати фазово-контрастний пристрій (в даний час найбільш широко застосовуються моделі КФ-1 або КФ-4), який складається з фазових об'єктивів, конденсорів з набором кільцевих діафрагм та допоміжного мікроскопа (оптичного пристрою, що міститься у тубус замість окуляра при встановленні фазового розмаїття).

Метод застосовують для дослідження живих клітин мікроорганізмів, контрастність яких досягається оптичним шляхом без втручання у фізіологічні процеси об'єктів, що вивчаються.

4.3.4.3 Люмінесцентна мікроскопія

Заснована на явищі фотолюмінесценції. Люмінесценція (від lumen – світло) – світіння речовин, що виникає після на них будь-яких джерел енергії: світла, електронних променів, іонізуючого випромінювання. Фотолюмінесценція – люмінесценція об'єкта під впливом світла. Деякі біологічні об'єкти здатні при освітленні короткохвильовими променями (синьо-фіолетовими, ультрафіолетовими) поглинати їх і випускати промені з довшою хвилею (світитися жовто-зеленим або помаранчевим світлом). Це так звана власна (первинна)люмінесценція, що спостерігається без попереднього забарвлення об'єкта. Вторинна (наведена)люмінесценція виникає після забарвлення препаратів спеціальними люмінесцентними барвниками – флюорохромами (акридином жовтим, акридином помаранчевим, аураміном, примуліном, конго червоним, тетрацикліном, хініном). Препарати, пофарбовані флюорохромами, вивчають у середовищах, що не люмінескують під дією короткохвильових променів, - у воді, гліцерині, вазеліновому маслі або фізіологічному розчині.

Переваги люмінесцентної мікроскопії в порівнянні зі звичайними методами:

У поєднанні кольорового зображення та контрастності об'єктів;

Можливості вивчення морфології живих та вбитих клітин мікроорганізмів у поживних середовищах та тканинах тварин та рослин;

Дослідження клітинних мікроструктур, вибірково поглинають різні флюорохроми, які є при цьому хіба що специфічними цитохімічними індикаторами;

Вивчення функціонально-морфологічних змін клітин;

Використання флюорохромів при імунологічних реакціях та підрахунку бактерій у зразках з невисоким їх вмістом.

Для люмінесцентної мікроскопії готують на предметному склі препарати-мазки або нативні препарати, які фарбують спеціальними флюоресцентними барвниками. При роботі з іммерсійним об'єктивом використовують нефлюоресцентне масло.

4.3.4.4 Електронна мікроскопія

Дозволяє спостерігати об'єкти, розміри яких лежать за межами роздільної здатності світлового мікроскопа (0,2 мкм). Електронний мікроскоп застосовується для вивчення вірусів, тонкої будови різних мікроорганізмів, макромолекулярних структур та інших субмікроскопічних об'єктів. Висока роздільна здатність електронного мікроскопа, що практично становить від 0,1 до 0,2 нм, дозволяє отримувати загальне корисне збільшення до 1000000 разів.

Пристрій електронного мікроскопа в принципі аналогічно світлооптичному мікроскопу, але роль світлових променів в електронному мікроскопі грає пучок електронів, випромінюваних спеціальним джерелом - електронною гарматою. Електрони потрапляють у магнітну конденсорну лінзу. Використовувати скляні лінзи або дзеркала для фокусування електронів не можна, оскільки скло непроникне для електронів. У електронному мікроскопі роль лінз виконує кругове магнітне поле, під впливом якого електрони можуть відхилятися чи центруватися. Функція конденсорної лінзи електронного мікроскопа аналогічна виконуваної конденсором звичайного мікроскопа - зведення пучка електронів в одній точці на об'єкті. Пройшовши через об'єкт, електрони потрапляють в об'єктну лінзу, яка знову фокусує пучок, що розходиться, і дає перше проміжне зображення об'єкта. Магнітний проектор (проекційна лінза, аналогічна за функцією лінзі окуляра) дає остаточне збільшення зображення об'єкта на флюоресцентному екрані – металевій пластинці, покритій тонким шаром сірчистого цинку або мінералу віллеміту. При попаданні на екран електронного проміння кожна частка цього шару починає світитися; Замінюючи екран фотографічною платівкою, зображення об'єкта можна сфотографувати.

На сьогоднішній день електронні мікроскопи бувають трьох видів: трансмісійні (просвічують), скануючі та електронні мікроскопи високої напруги. В останніх велике прискорення електронів дозволяє їм проходити через порівняно товсті зрізи (1...5 мкм), при цьому одержують тривимірне зображення структур, що полегшує вивчення об'єкта. Скануючі електронні мікроскопи забезпечують рельєфне зображення поверхні об'єкта. Дозволяюча поверхня цих приладів значно нижча, ніж у електронних мікроскопів типу «просвічує».

Препарати для електронно-мікроскопічних досліджень поміщають на спеціальні сітки, на які нанесена найтонша целюлозна або пластмасова плівка - підкладка. Для збільшення контрастності об'єкта проводять його напилення важкими металами (хромом, золотом, паладієм) у вигляді пар або проводять обробку контрастними речовинами (фосфорно-вольфрамова кислота).

Контрольні питання

1. Яких правил необхідно дотримуватись при роботі в мікробіологічній лабораторії?

2. Як влаштовано мікробіологічну лабораторію?

3. Яке основне обладнання та для яких цілей його використовують у мікробіологічній лабораторії?

4. Перерахуйте основні інструменти та посуд, які застосовуються в мікробіологічній лабораторії. У чому їхнє призначення?

5. Які види світлових мікроскопів ви знаєте, навіщо вони призначені?

6. З яких частин складається світловий мікроскоп?

7. Що належать до механічної частини мікроскопа?

8. Яке призначення макро- та мікрометричних гвинтів? Як ними користуватися?

9. У чому особливості оптичної системи мікроскопа, із яких частин вона складається?

10. Що таке сухі та імерсійні об'єктиви?

11. Як регулювати рівень освітленості препарату?

12. Чому з одного боку дзеркало плоске, з другого увігнуте? Коли та яким дзеркалом користуються?

13. Яку будову має окуляр і в чому її призначення?

14. Що означають поняття «збільшувальна здатність мікроскопа» і «роздільна здатність мікроскопа», і як їх можна визначити?

15. Наведіть основні правила роботи з біологічним мікроскопом.

16. Який порядок роботи при мікроскопії препаратів із сухим об'єктивом?

17. Перерахуйте правила та порядок роботи з імерсійним
об'єктивом.

18. Які методи мікроскопії ви знаєте, у чому їх особливості?

19. На чому ґрунтується метод фазово-контрастної мікроскопії?

20. З чого складається фазово-контрастний пристрій?

21. Що означає терміни «люмінесценція», «флюорохроми»? Які види люмінесценції ви знаєте?

22. У чому переваги люмінесцентного методу мікроскопії?

23. Яке явище є основою методу темнопольної мікроскопії? З якою метою використовується цей метод?

24. У чому особливості пристрою електронного мікроскопа та принцип його роботи?

ЛІТЕРАТУРА

1. Асонов, Н.Р. Практикум з мікробіології / Н.Р. Ассонів. - М.: Агропроміздат, 1988. - 155 с.

2. Борисов, Л.Б. Керівництво до лабораторних занять з мікробіології / Л.Б. Борисов [та ін]. - М.: Медицина, 1984. - 256 с.

3. Градова, Н.Б. Лабораторний практикум із загальної мікробіології / Н.Б. Градова [та ін]. - М.: ДеЛі принт, 2001. - 131 с.

4. Леріна, І.В. Лабораторні роботи з мікробіології/І.В. Леріна, А.І. Педенко. - М.: Економіка, 1986. - 158 с.

5. Мармузова, Л.В. Основи мікробіології, санітарії та гігієни у харчовій промисловості. - М.: ПрофОбрІздат, 2001. - 136 с.

6. Нетрусов А.І. Практикум з мікробіології / А.І. Нетрусів [та ін]. - М.: Академія, 2005. - 608 с.

7. Прозоркіна, Н.В. Основи мікробіології, вірусології та імунології / Н.В. Прозоркіна, Л.А. Рубашкіна. - Ростов н / Д.: Фенікс, 2002. - 416 с.

8. Теппер, Е.З. Практикум з мікробіології/Е.З. Теппер, В.К. Шильникова, Г.І. Переверзєва. - М.: Дрофа, 2004. - 256 с.

9. Трушіна, Т.П. Мікробіологія, гігієна та санітарія у торгівлі / Т.П. Трушина. - Ростов н / Д.: Фенікс, 2000. - 320 с.

10. Шлегель, Г. Загальна мікробіологія/Г. Шлегель. - М.: Світ, 1987. - 567 с.

Важливість науки у житті всього суспільства заперечувати дуже складно. Вчені та їх розробки дали суспільству все те, чим тепер користується з радістю і насолоджується. Розробки вчених у різних галузях дозволяють перемагати смертельні хвороби, боротися з психічними розладами, створювати унікальну «розумну» техніку і навіть роботів. Можливості науки воістину безмежні. Нові особи завжди приносять із собою нові ідеї, які стають основою майбутніх розробок. Однак безліч розробок базується на простих та перевірених методах.

Багато мудреців минулого говорили про те, що існує макро-, мікросвіт. На тому етапі розвитку люди не могли зрозуміти всю глибину цих слів. Адже макро- та мікросвіт справді існують і дуже тісно взаємодіють. Крихітні зміни у структурі клітини можуть бути викликані глобальними змінами у Сонячній системі. На сьогоднішній день довести або спростувати такий взаємозв'язок дуже складно, але дослідження світу бактерій і клітин говорять про те, що клітина – це маленький Всесвіт.

Мікроскопія

Мікроскопія – це наукове за допомогою мікроскопа. У перекладі з грецької це слово означає маленький, невеликий. Мікроскопія може поділятися на кілька підвидів: оптичну, багатофотонну, рентгенівську, лазерну та електронну. Мета цього способу дослідження полягає у збільшеному спостереженні за об'єктом та реєстрацією помічених змін.

Історія мікроскопа

На початку свого історичного розвитку мікроскопи являли собою використовувані промені видимого світла. Такі прилади були дуже слабкі спостереження і підходили лише найпростіших операцій. Ідея виникнення електронного мікроскопа виникла у той момент, коли вчені замислилися про заміну електромагнітного випромінювання на електронний пучок. Ця подія стала для розвитку електронного мікроскопа, що значно розширив можливості спостереження за об'єктом.

Методи мікроскопії

Для того щоб правильно і ретельно обстежити якийсь об'єкт, необхідно працювати за певним алгоритмом. Подібні алгоритми виробляються один раз і використовуються роками. Для того, щоб вивчати навколишній світ за допомогою спеціальної техніки, необхідно володіти особливими методами. Методи мікроскопії - це сукупність різних алгоритмів, за якими можна грунтовно і системно вивчити конкретний об'єкт мікросвіту. Проходження пучка світла через мікроскоп супроводжується деякими змінами початкових характеристик, які можуть бути спричинені структурною будовою предмета. Цей процес може супроводжуватися рядами оптичних ефектів, таких як відбиття, поглинання, заломлення, дисперсія тощо.

Методи світлової мікроскопії

Світлова мікроскопія – це система методів, які використовують різні оптичні ефекти для достовірного відображення результатів. Видимі елементи та характер отриманого зображення багато в чому залежатимуть від освітлення. Усього налічується велика кількість методів мікроскопії: світлого поля, косого освітлення, інтерференційного розмаїття, темного поля, поляризаційний метод, фазово-контрастна, ультрафіолетова, люмінесцентна, інфрачервона мікроскопія, конфокальний мікроскоп.

Всі ці методи мають певні переваги та недоліки. Працюючи зі зразком вибирати той чи інший метод слід з його адекватності у цій ситуації. Сильні та слабкі сторони кожного методу не важливі загалом, головне, щоб метод був застосовний у заданих умовах.

Мікроскопія та медицина

Застосування мікроскопії у медицині має величезний потенціал. На сьогоднішній день завдяки мікроскопам можна досліджувати різні клітини організму людини, щоб точно визначати стан здоров'я. Клітини організму дають найбільш точний і достовірний результат, який донедавна було неможливо отримати, оскільки мікроскопи було неможливо дати вичерпної інформації.

Використання таких приладів дуже перспективне, адже методи лікування та діагностики можуть разюче перетворитися і зовсім перейти на новий рівень. Дослідження за допомогою мікроскопів відоме і застосовується тривалий час, проте наука стоїть на порозі того, щоб лікувати людину клітинами. Це унікальна можливість, яка дозволить відійти від звичних методів лікування та забути про ліки. Клітина – найпотужніший елемент організму. Говорити про те, яку користь може принести пересадка хворій людині здорових клітин просто безглуздо, адже це очевидно.

Дослідження сечі

Загальний аналіз сечі - це комплекс заходів, спрямованих на дослідження властивостей сечі та її фізико-хімічного складу. Важливими показниками при цьому є колір, запах, реакція, прозорість, щільність, а також вміст сечі різних речовин. Мікроскопія осаду сечі дозволяє визначити наявність солей, клітинних елементів та циліндрів. Слід розуміти, що сеча - це кінцевий продукт діяльності нирок, який може точно відображати стан обмінних процесів і крові в організмі.

Аналіз осаду сечі

Мікроскопія сечі дозволяє створити повнішу картину при повному обстеженні організму. Також мазок часто використовують для звичайної та диференціальної діагностики хвороб сечовивідних шляхів та нирок. Під час лікування мікроскопію сечі можуть призначати для отримання оцінки ефективності докторського втручання. Дослідження сечі дозволяє виявити конкретні чи потенційні проблеми у водно-електролітному балансі організму, а також у процесі обміну речовин. Аналіз сечі дуже ефективний при діагностиці на хвороби шлунково-кишкового тракту, а також при інфекційних та запальних процесах в організмі. Іноді мікроскопію сечі використовують для того, щоб стежити за станом пацієнта в період терапевтичного або хірургічного лікування.

Дослідження крові під мікроскопом

Кров'яні тільця формуються у червоному кістковому мозку, а потім викидаються у кровотік. Кожна виконує певну функцію. Лейкоцити потрібні для боротьби з інфекційними клітинами, еритроцити сприяють збагаченню клітин киснів та видаленню їх вуглекислого газу, тромбоцити дуже важливі для гемостазу. У нормальних умовах тіло людини виробляє нормативне значення всіх клітин, яке виходить за певні рамки. При виникненні будь-яких ускладнень або хвороби клітини крові можуть змінювати свої розміри, форму, колір і кількість. Тільки завдяки точному мікроскопічному дослідженню можна визначити стан клітин та зробити відповідні висновки.

Кров - це цілюща рідина організму, яка забезпечує обмін корисними речовинами між усіма клітинами. Мікроскопія мазка крові – це дослідження, яке проводиться під мікроскопом. Досліджується препарат, виготовлений з однієї краплі крові. Ця процедура входить до загального аналізу крові або лейкоцитарної формули і окремо не відбувається.

Мікроскопія мазка

Мікроскопія мазка крові дає фахівцеві дуже важливі знання про стан здоров'я людини. За допомогою цього аналізу можна визначити кількісне співвідношення еритроцитів, тромбоцитів, лейкоцитів, а також їх форми та розмір. Крім того, дозволяє визначати кількісний вираз незрілих лейкоцитів, що є дуже важливим моментом у низці захворювань. Також мазок крові дозволяє якісно діагностувати захворювання, які можуть бути пов'язані з порушеннями функцій крові, її утворення, згортанням, а також руйнуванням Дуже важливим завданням мікроскопічного мазка на кров є регулярне відстеження стану клітин крові, їх зрілість після променевої та хіміотерапії при проблемах з гемоглобіном , і навіть при лейкозах.

Призначається мазок на кров у тому випадку, якщо загальний аналіз крові показав, що збільшено кількісний вираз лейкоцитів, незрілих або атипових клітин. Для мазка можна використовувати біоматеріал із крові або капілярів.

Біологія та мікроскопи

Біологія значно розширює можливості використання мікроскопів. Як уже говорилося раніше, цитологія багато в чому спирається на сучасні та потужні мікроскопи. Мікроскопія в біології відкриває для вчених небачені простори для дослідів та досліджень. Сучасні розробки дозволяють вже зараз говорити про те, яке майбутнє на нас чекає.

Мікроскопія у біології має дуже широке застосування. Прилади дозволяють досліджувати організми, які недоступні для ока людини, але дуже важливі для наукових експериментів. У біології найчастіше використовують метод електронної мікроскопії, який дає зображення рахунок спрямованого потоку електронів. У цьому навіть світловий мікроскоп дозволяє досліджувати живі біологічні об'єкти.

p align="justify"> Метод мікроскопії в біології застосовується дуже активно, так як практично всі різновиди застосовні для біологічних досліджень. Інтерференційна мікроскопія дозволяє досліджувати прозорі рідини та об'єкти, а також давати їх якісний аналіз. Це можливо завдяки тому, що промінь світла, проходячи через прилад, роздвоюється: одна частина проходить через об'єкт, а інша - повз. Таким чином, два промені інтерферують та з'єднуються, даючи повноцінне зображення.

Мікроскопія в різних сферах застосування

Область застосування мікроскопії дуже широка. Незважаючи на те, що спочатку мікроскопи були призначені для досліджень в галузі біології, на сьогоднішній день сфера їх впливу значно розширилася. Мікроскопія - це комплекс методів, який знайшов своє застосування при аналізі твердих та кристалічних тіл, структурі та будов поверхонь. Також мікроскопи активно використовують у медицині як для діагностики, а й у виконанні мікрохірургічних операцій. Більше того, відомо, що вченими було розроблено підводний лазерний мікроскоп, мета якого полягає у пошуку позаземного життя на Європі.

Також не слід забувати про бурхливий розвиток нанотехнологій, які немислимі без мікроскопів. Розвиток цієї галузі призводить до того, що різновиди мікроприладів постійно вдосконалюються. Більше того, з'являються нові, які призначені для дослідження певного середовища.

Підбиваючи деякі підсумки, слід сказати, що мікроскопія - це перспективна область, яка з кожним роком розвивається все більш активно. Інтерес до стовбурових клітин людини, а також розвиток нанотехнологій веде до того, що мікроскопи стають невід'ємною частиною будь-якої дослідницької роботи.

у мікробіології: пристрій мікроскопа та основні прийоми мікроскопування живих мікроорганізмів

1 Особливості різних видів мікроскопії

2 Пристрій світлопольного мікроскопа

3 Правила роботи з імерсійним об'єктивом

4 Прийоми мікроскопування живих мікроорганізмів

1 Особливості різних видів мікроскопії

Основними завданнями мікроскопії є:

Виявлення мікроорганізмів у різних матеріалах.

Орієнтовна ідентифікація мікроорганізмів у зразку.

Вивчення деяких морфологічних ознак та структур мікроорганізмів (наприклад, капсул, джгутиків тощо).

Вивчення пофарбованих мазків із колоній та чистих культур.

На сьогоднішній день найбільш використовується світлова мікроскопія.

Світлова мікроскопіязабезпечує збільшення до 2–3 тисяч разів, кольорове та рухоме зображення живого об'єкта, можливість мікрокінозйомки та тривалого спостереження одного й того ж об'єкта, оцінку його динаміки та хімізму. Зображення у світловому мікроскопі формується внаслідок того, що об'єкт та різні його структури вибірково поглинають світло з різною довжиною хвилі (абсорбційний контраст) або внаслідок зміни фази світлової хвилі під час проходження світла через об'єкт (фазовий контраст).

Основними характеристиками будь-якого мікроскопа є здатність і контраст. Роздільна здатність– це мінімальна відстань, де знаходяться дві точки, демонстровані мікроскопом раздельно. Роздільна здатність людського ока в режимі найкращого бачення дорівнює 0,2 мм. Контраст зображення– це відмінність яскравостей зображення та фону. Якщо ця відмінність становить менше 3–4 %, то її неможливо вловити ні оком, ні фотопластинкою; тоді зображення залишиться невидимим, навіть якщо мікроскоп дозволяє його деталі. На контраст впливають як властивості об'єкта, що змінюють світловий потік у порівнянні з фоном, так і здатності оптики вловити відмінності у властивостях променя. Можливості світлового мікроскопа обмежені хвильовою природою світла. Фізичні властивості світла – колір (довжина хвилі), яскравість (амплітуда хвилі), фаза, щільність та напрямок поширення хвилі змінюються залежно від властивостей об'єкта. Ці відмінності використовуються у сучасних мікроскопах до створення контрасту.

Збільшення мікроскопавизначається як добуток збільшення об'єктива на збільшення окуляра. У типових дослідницьких мікроскопів збільшення окуляра дорівнює 10, а збільшення об'єктивів – 10, 40 і 100. Відповідно, збільшення такого мікроскопа становить від 100 до 1 000. Деякі з мікроскопів мають збільшення до 2 000. Ще більш високе збільшення немає сенсу, оскільки при цьому роздільна здатність не покращується. Навпаки, якість зображення погіршується.

Числова апертуравикористовується для вираження роздільної здатності оптичної системи. Числова апертура - це оптичне "охоплення" лінзи, вона є мірою кількості світла, що потрапляє в лінзу. Числова апертура об'єктива вказана з його оправі. Апертура конденсора повинна відповідати числовій апертурі об'єктива. Числова апертура будь-якої лінзи, що межує з повітрям (тобто «сухої системи»), не може перевищити 1, оскільки показник заломлення повітря дорівнює 1. Числову апертуру можна підвищити, якщо збільшити показник заломлення середовища між фронтальною об'єктивною лінзою і предметним склом, наблизивши його до показника заломлення скла (1,5). Для цього між фронтальною лінзою об'єктива і об'єктом, що досліджується, поміщають краплю рідини з показником заломлення більшим, ніж показник заломлення повітря, наприклад, краплю води (n = 1,3), гліцерину (n = 1,4) або кедрового (імерсійного) масла (n = 1,5). Для кожної із зазначених вище рідин випускаються спеціальні об'єктиви, які називаються імерсійними.

Світлова мікроскопіявключає звичайну просвічуючу мікроскопію (світло-, темнопольну), фазово-контрастну, люмінесцентну. Останнім часом розроблено й інші способи мікроскопії та мікроскопи – інверсійна і конфокальна лазерна мікроскопія, що сканує.

Світлопольна мікроскопія дозволяє досліджувати об'єкти в світлі, що проходить у світлому полі. Даний вид мікроскопії призначений для дослідження морфології, розмірів клітин, їхнього взаємного розташування, структурної організації клітин та інших особливостей. У світлового мікроскопа максимальна роздільна здатність становить 0,2 мкм, що забезпечує високоточне збільшення мікроскопа до 1500х.

Фазово-контрастна мікроскопія дозволяє чіткіше спостерігати живі прозорі об'єкти, які мають коефіцієнти заломлення, близькі до коефіцієнтів заломлення середовища. Дія фазово-контрастного мікроскопа заснована на інтерференції світла у площині зображення, обумовленої зсувом по фазі (при використанні фазового кільця в апертурній діафрагмі). При фазово-контрастній мікроскопії часто застосовують біологічні мікроскопи із зворотним розташуванням оптики – інвертовані мікроскопи. У таких мікроскопів об'єктиви розташовані знизу, а конденсор зверху.

За допомогою фазово-контрастної мікроскопії вивчають форму, розміри, взаємне розташування клітин, їх рухливість, розмноження, проростання спор мікроорганізмів і т.д. ) або світлими на темному тлі (негативний фазовий контраст).

Темнопільна мікроскопія заснована на освітленні об'єкта косими променями світла. При такому освітленні промені не потрапляють до об'єктиву, тому поле зору виглядає темним. Таке освітлення препарату досягається використанням спеціального конденсора темнопольного. Темнопольна мікроскопія є дуже простим, але ефективним методом і добре підходить для отримання зображення живих та незабарвлених біологічних зразків. Враховуючи простоту установки, якість одержуваних зображень дуже хороша.

При мікроскопуванні в темному полі можна побачити об'єкти, величина яких вимірюється сотими частками мікрометра, що знаходиться за межами роздільної здатності звичайного світлопольного мікроскопа. Однак спостереження за об'єктами у темному полі дозволяє досліджувати лише контури клітин та не дає можливості розглянути їхню внутрішню структуру.

Люмінесцентна (флуоресцентна) мікроскопія заснована на здатності ряду речовин біологічного походження або деяких барвників світитись при їх освітленні невидимим ультрафіолетовим або синім світлом. При використанні ультрафіолетового світла роздільна здатність мікроскопа може досягати 0,1 мкм.

Клітини мікроорганізмів обробляють спеціальними барвниками – флуорохромами (акридиновий помаранчевий, примулін, родамін та ін.) у вигляді сильно розведених водних розчинів: 1:500–1:100 000. Такі розчини слабо токсичні, що дає можливість вивчати неушкоджену клітину. Залежно від хімічного складу клітинні структури різною мірою адсорбують барвники і люмінескують по-різному. Крім того, флуорохроми неоднаково адсорбуються живими та мертвими клітинами. Це дозволяє використовувати даний вид мікроскопії для цитологічних та імунологічних досліджень, визначення життєздатності клітин тощо.

Електронна мікроскопія дозволяє виявити об'єкти, які не дозволяються при використанні світлових чи ультрафіолетових променів. Теоретично Дозвіл електронного мікроскопа, що просвічуєскладає 0,002 нм; реальний дозвіл сучасних електронних мікроскопівнаближається до 0,1 нм. На практиці роздільна здатність для біологічних об'єктів досягає 2 нм.

Коротка довжина хвилі електронів дозволяє розрізнити об'єкти розміром 0,5-1,0 нм. У сучасних електронних мікроскопах на екрані досягається збільшення 5000-200 000. Завдяки такому високому дозволу стає можливим виявлення деталей бактеріальних структур. Наприклад, за допомогою напилення солей важких металів, що оточують бактерію та проникають у поверхневі нерівності, отримують контрастування за рахунок диференціальної затримки електронів. Цей ефект отримав назву негативного контрастування .

Електронний мікроскоп, у якому зображення формується завдяки проходженню (просвічуванню) електронів через зразок, називають що просвічує (або трансмісійним ).

У скануючий електронний мікроскоп (Растрова електронна мікроскопія (РЕМ)пучок електронів швидко сканує поверхню зразка, викликаючи випромінювання, яке формує зображення на екрані, що світиться. Для РЕМ характерні висока роздільна здатність, великий діапазон збільшення (до 100 000 і вище), велика глибина фокусування (~100 мкм), різноманіття режимів роботи. Скануючий мікроскоп дає картину поверхонь і дозволяє отримувати тривимірне зображення.

Лазерна конфокальна мікроскопія дає можливість отримати чітке зображення та спостерігати об'єкти у фокусі по всьому полю. Даний метод придатний лише дослідження самосвітящихся (флуоресцентних) об'єктів. При поєднанні з комп'ютерною технікою можлива просторова реконструкція об'єкта, що вивчається. У конфокальному лазерному мікроскопі, що сканує, зображення внутрішніх перерізів формуються за рахунок сканування сфокусованим лазерним пучком від різних (405, 488, 532, 635 нм) лазерів і просторової фільтрації випромінювання. При використанні скануючої мікроскопії ближнього поля (СМШП) досягається висока роздільна здатність. Найменший розмір елемента, отриманого за допомогою СМШП, становить 20 нм за довжини хвилі світла 0,486 нм. У зображенні контрольованого елемента відсутні дифракційні або інтерференційні ефекти, що ускладнюють визначення меж. Відмінною особливістю СМШП у порівнянні з атомно-силовим мікроскопом є чутливість до оптичних характеристик поверхні контрольованого зразка, довжини хвилі світла, люмінесценції та ін.

Комп'ютерна інтерференційна мікроскопія дозволяє отримати висококонтрастне зображення під час спостереження субклітинних структур; у багатьох випадках застосовується вивчення живих клітин. Принцип дії автоматизованого інтерференційного мікроскопа заснований на інтерференції світлових пучків лазерного випромінювання, відбитого від опорного дзеркала та дзеркала, на якому розміщено вимірюваний фазовий об'єкт. Теоретично гранично досяжна роздільна здатність може становити в середньому 0,2 нм, практично вона становить 0,4 мкм.

Рентгенівська комп'ютерна томографія (РКТ), позитронна емісійна томографія (ПЕТ) дозволяють спостерігати об'єкти у звичайних умовах.