Пероксидазы. Опыты с ферментами: оксидазы и пероксидазы

Введение

Тиреоидные гормоны трийодтиронин (Т3) и тироксин (Т4) имеют важное значение во многих процессах регуляции метаболизма. Ключевым ферментом биосинтеза Т4 и Т3 является тиреоидная пероксидаза (ТПО), которая катализирует две реакции: окисление ионорганического йодида (I-) и связывание йодированных тирозинов. Щитовидная железа (ЩЖ) является органом-мишенью при многих аутоиммунных заболеваниях (АЗЩЖ), таких как болезнь Грейвса, протекающая с тиреотоксикозом, и тиреоидит Хашимото, который приводит к гипотиреозу. Характерной особенностью этих заболеваний является потеря иммунологической толерантности к тиреоидной пероксидазе, а специфическим маркером этих заболеваний являются антитела к тиреоидной пероксидазе. Таким образом, помимо того что ТПО имеет важнейшую функцию в процессе синтеза тиреоидных гормонов, это еще и один из основных антигенов при аутоиммунных заболеваниях ЩЖ.

Экспрессия гена ТПО

Тиреоидная пероксидаза — ключевой фермент в процессе биосинтеза тиреоидных гормонов и один из трех главных антигенов при аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы. Помимо ТПО, к ним относятся тирео-глобулин — основной компонент коллоида и рецептор ТТГ, который располагается на базальной мембране фолликулярных клеток ЩЖ. ТПО является гликозилированным трансмембранным белком 1-го типа, который локализуется в апикальной части фолликулярных клеток, где обычно осуществляются важнейшие этапы синтеза тиреоидных гормонов — окисление и органификация йода. ТПО катализирует окисление йода, йодирование остатков тирозина и соединение йодтирозинов с образованием йодтиронинов Т4 и Т3. Таким образом, ТПО играет ключевую роль в биосинтезе тиреоидных гормонов и необходима для нормального функционирования ЩЖ .

Ген ТПО человека локализуется на коротком плече хромосомы 2 и содержит 17 экзонов и 16 интронов общим объемом 16 килобаз . ДНК ТПО содержит 3048 пар оснований и кодирует белок, состоящий из 933 аминокислот, с крупным экстрацеллюлярным фрагментом, коротким одиночным трансмембранным сегментом и коротким цитоплазматическим хвостом . Экспрессия ТПО находится под контролем специфических факторов транскрипции, таких как TTF-1, TTF-2 и PAX-8 . В начале были изолированы две матричные ДНК ТПО : ТПО-1, которая кодирует полноцепочечный белок, и более короткая ТПО-2, кодирующая полипептид, в котором отсутствуют 57 аминокислотных остатков вследствие делеции 171-й пары оснований в экзоне 10. Кроме того, в фолликулярных клетках были идентифицированы фрагменты мРНК, образованные в результате альтернативного сплайсинга: ТПО-3 (экзон 16), ТПО-4 (экзон 14) и ТПО-5 (экзон 8) , а также мультисплайсинга: ТПО 2/3 (делеция экзонов 10 и 16), ТПО 2/4 (делеция экзонов 10 и 14) и ТПО-6 (делеция экзонов 10, 12, 13, 14 и 16) . Среди всех изоформ ТПО только ТПО-1, ТПО?3 и ТПО-4 обладают ферментативной активностью . ТПО-2 неактивна, поскольку лишена способности связывать гем из-за отсутствия His 586 и Asn 579 . Сплайсинговые варианты мРНК ТПО экспрессируются на различном уровне в нормальной ткани ЩЖ и при различной патологии, например при раке ЩЖ . Продукты транскрипции ТПО-2, ТПО-5 и мультисплайсинговых вариантов быстро деградируют, поскольку они не способны достичь клеточной поверхности, тогда как полипептиды ТПО-3 и ТПО-4 правильно встраиваются в апикальную мембрану, но ни физиологическое, ни патофизиологическое значение этих соединений неизвестно.

Структура белка ТПО

ТПО относится к суперсемейству пероксидаз животных (оксидоредуктазы, ЕС 1.7.1.11), семейству миелопероксидаз, которое, кроме того, включает миелопероксидазу гранулоцитов (МПО), лактопероксидазу (ЛПО), слюнную пероксидазу и пероксидазу эозинофилов (ЭПО) . Сверка первичной структуры пероксидаз показала, что этим ферментам свойственен высокий уровень гомологии внутри одного семейства . Аминокислотная последовательность ТПО человека в высокой степени сходна с ТПО свиньи, крысы и мыши за исключением вариации N- и С-концов . В эктодомене ТПО (остатки 1-848) присутствуют пять содержащих аспарагин потенциальных мест гликозилирования (Asn 129, 307, 342, 478, 569). Гликозилирование аспарагина 478 маловероятно, поскольку пролин присутствует в позиции Х в общей последовательности Asn-X-Thr . В свиной молекуле ТПО на долю углеводов приходится около 10 % молекулярного веса, при этом только 4 из 5 потенциальных мест гликозилированы . Экстрацеллюлярный С?конец ТПО по структуре гомологичен доменам белков контроля комплемента (БКК-подобный), C4b-b2 гликопротеину и эпидермальному ростовому фактору
(ЭРФ?подобный) .

Структурная гомология позволяет предположить, что молекула человеческого ТПО (чТПО) состоит из трех модулей, аналогичных миелопероксидазе (МПО-подобный), белкам контроля комплемента (БКК-подобный) и эпидермальному фактору роста (ЭРФ-подобный) . С целью определения пространственной структуры трех фрагментов ТПО были получены ее кристаллы, но они оказались слишком малы для проведения кристаллографического анализа; самые большие кристаллы оказались способны преломлять рентгеновские лучи лишь с малым разрешением . По сравнению с другими ТПО первичная структура человеческого фермента (остатки 1-735) обладает наибольшим сходством (42 %) с МПО, что предполагает общее происхождение этих двух ферментов и схожесть их трехфрагментной пространственной структуры . Среди пероксидаз млекопитающих МПО является единственным ферментом, для которого выяснена его трехфрагментная структура . Представление об аналогичном строении ТПО как раз и базируется на структуре кристаллов МПО. Вторичная структура ТПО преимущественно состоит из a-спирали и в меньшей степени — из b-пластины .

Простетическая группа в каталитическом участке ТПО, содержащая гем, является производным ферропротопорфирина IX . В геме ТПО железо находится в форме FeIII. Оно реагирует с перекисью водорода (Н2О2), в результате чего образуется соединение I, содержащие на 2 электрона больше, чем ТПО в исходном состоянии. Два электрона переносятся с железа, в результате чего образуется оксиферрил (FeIV = 0) гем, а также с порфирина, в результате чего образуется порфирин-р-катион радикал. Гем связывает участок в центре основной части белка, где, так же как и в МПО и ЛПО, бис-гидроксилированный гем b ковалентно связан при помощи эфирных мостиков с остатками Glu 399 и Asp 238 . Проксимальными лигандами гема ТПО являются His 494 и Asn 579 (необходимы для достижения редокс-потенциала железа), а дистальными — His 239, Arg 396 и Gln 235 . Предполагается, что связи белка и гема формируются за счет механизма внутреннего процессинга. Ферментативно очищенная активная человеческая ТПО по данным электрофореза в SDS-полиактиламидном геле формирует плотно расположенные дублеты размером 105-110 кДа . ТПО, синтезируемая на полисомах, поступает в эндоплазматический ретикулум, где происходит гликозилирование белкового ядра молекулы, после чего созревание фермента заканчивается в аппарате Гольджи.

Большая часть фермента обнаруживается на перинуклеарной мембране, в эндоплазматическом ретикулуме и во внутриклеточных везикулах. Этот пул внутриклеточной ТПО преимущественно имеет неправильную пространственную структуру и быстро распадается . Созревшая, с правильной структурой, ферментативно активная ТПО транспортируется к апикальному полюсу тироцитов. Там обнаруживается только 1,5-2 % от всей синтезированной ТПО .

Функция ТПО

ТПО является ключевым ферментом биосинтеза тиреоидных гормонов. Она катализирует две ферментативные реакции: йодирование остатков тирозина в тиреоглобулине (ТГ) и окислительное связывание моно- и дийодтирозинов с образованием Т4 и Т3, связанных с ТГ . Этот процесс происходит в области апикального полюса тироцитов, который обращен к просвету фолликула, где помимо этого локализуются и другие ферменты, вовлеченные в биосинтез тиреоидных гормонов . Эти отдельные, но одновременно катализируемые реакции не специфичны для ТПО, а характерны и для пероксидаз животных, таких как ЛПО и МПО .

Для энзиматических реакций, осуществляемых ТПО, необходимы йод, Н2О2 и ТГ. Для того чтобы воздействовать как йодирующий агент, йодид, аккумулирующийся в тиреоците, в начале должен быть окислен. Эта реакция катализируется ТПО в присутствии Н2О2. Перекись водорода генерируется у апикального полюса тироцитов двойными оксидазами 1 и 2 (DUOX 1/2) — ферментами, принадлежащими к семейству НАДФ-Н оксидаз, которым необходимы НАДФ-Н и Са2+ .

Предполагается три возможных механизма, по которым осуществляется йодирование, катализируемое ТПО: свободнорадикальный механизм, ТПО-I+ — как промежуточный продукт или промежуточное йодирование с образованием гипойодита . В последнем случае железо гема, входящего в ТПО, выступает в окисленной форме (ТПО-FeIII). FeIII окисляется Н2О2 с образованием каталитического промежуточного соединения I (Ep+.-FeIV = O порфирин-p-катион), содержащего оксиферрил-гем, и по сравнению с нативным ферментом — два дополнительных окислительных эквивалента . Соединение I катализирует окисление двух электронов йодида с образованием ферментсвязанного гипойодида (E-OI-), который йодирует остатки тирозина в тиреоглобулине до моно- и дийодтирозина (МИТ, ДИТ) .

Второй реакцией, катализируемой ТПО, является связывание остатков йодтирозина с образованием тиреоидных гормонов T4 (DIT-DIT) и T3 (MIT-DIT) . Эта реакция включается в окислительный этап и неокислительное связывание и этап декомпозиции . В соответствии с этой предполагаемой моделью окисление одного электрона остатков йодтирозина продуцирует заряд, в итоге обеспечивающий связывание радикалов йодтирозина с образованием комплекса ТГ-Т4. Образование Т4 и Т3 зависит от нативной трехмерной структуры ТГ, поскольку оно происходит в результате специфической конформации пептидов, являющихся акцепторами и донорами остатков йодтирозина . В результате реакции отщепления образуются тиреоидные гормоны и остатки дегидроаланина в донорских участках ТГ . Активная форма ТПО как для йодирования, так и для соединения йодтирозинов — наиболее вероятно p-катион I (ТПОp+ - FeIV = O).

Дефекты органификации йода, которые в тяжелых случаях приводят к гипотиреозу, могут быть результатом нарушения синтеза ТГ, синтеза ТПО или продукции Н2О2. Мутации гена ТПО, вероятно, являются одной из двух основных причин нарушения органификации йода. Редукция или полное отсутствие активности ТПО, которое может быть следствием снижения связывания гема или субстрата, а также неправильной локализации или подавления ферментативной активности, являются важными причинами врожденного гипотиреоза .

ТПО и аутоиммунные заболевания щитовидной железы

Аутоиммунные заболевания щитовидной железы являются наиболее распространенной органоспецифической аутоиммунной патологией, которая встречается примерно у 5 % населения во всем мире. К настоящему времени прошло уже 47 лет с тех пор, как были описаны антитела к антигену, отличающемуся от ТГ, — антигену микросомальной фракции ЩЖ . Несмотря на проведение ряда исследований, природа микросомального антигена оставалась неизвестной почти 30 лет. Спустя много лет, в 1985 году, были получены первые данные о том, что микросомальным антигеном является ТПО .

ТПО, экспрессирующаяся на поверхности тироцита, является одним из основных антигенов ЩЖ, при этом предполагается, что аутоиммунная патология ЩЖ развивается вследствие направленной на ТПО агрессии как гуморального, так и клеточного звеньев иммунитета.

Антитела к ТПО (АТ-ТПО) являются маркером АЗЩЖ. Они присутствуют в сыворотке у большинства пациентов с болезнью Грейвса (80 %), тиреоидитом Хашимото (более 90 %), послеродовым тиреоидитом (2/3); их распространенность среди лиц без нарушения функции ЩЖ достигает 26 % . АТ-ТПО преимущественно продуцируются В-лимфоцитами, инфильтрирующими ЩЖ, и их уровень отражает выраженность лимфоидной инфильтрации . Аутоиммунный ответ к ТПО поликлонален, и циркулирующие АТ-ТПО преимущественно относятся к субклассам IgG 1 и IgG 4 с легкими k-цепями; тем не менее у тех же пациентов были обнаружены IgG 2 и IgG 3 с l-цепями . ТПО и АТ-ТПО вовлечены в комплементзависимую цитотоксичность и антителзависимые клеточно-опосредованные механизмы цитотоксичности, включающие NK-клетки . Кроме того, было обнаружено, что ТПО может активировать каскад комплемента в несвязанном с антителами состоянии . Наряду с этим было показано, что некоторые АТ-ТПО могут in vitro связывать ТПО и подавлять ее ферментную активность, хотя эти данные весьма противоречивы . Недавно было высказано предположение, что для оказания эффектов АТ-ТПО необходимо участие FcR — рецептора иммуноглобулина, экспрессируемого тироцитами, который участвует в трансцитозе IgG сквозь эпителий . Аутоиммунные процессы в ЩЖ являются Т-лимфоцитзависимыми процессами. Эпитопы, которые распознаются Т-клетками,— короткие линейные пептиды, образующиеся при процессинге ТПО в антигенпрезентирующих клетках, которые после связывания с молекулами МНС II класса (CD4+ T-клетки) распознаются рецепторами Т-клеток. При использовании различных методов (синтетические пептиды, короткие пептиды бактериального происхождения) на молекуле ТПО, включая ее трансмембранный домен, были идентифицированы некоторые эпитопы для Т-клеток . Несмотря на то что речь идет преимущественно об экспериментальных данных, они имеют большое значение, поскольку конкретный эпитоп ТПО, который задействован при АЗЩЖ, остается до конца неизвестен. Кроме того, в целом необходимо еще выяснить роль Т-клеток в инициации АЗЩЖ. Специфические антитела могут видоизменять Т-клеточную реакцию на ТПО при помощи модулирования презентации различных пептидов для Т-клеток .

ТПО как антиген

Поликлональные АТ-ТПО, присутствующие в сыворотке крови пациентов с АЗЩЖ, реагируют с некоторыми эпитопами В-клеток, локализованными на поверхности ТПО. Первое отграничение эпитопов ТПО было сделано в сравнительном эксперименте с человеческими АТ?ТПО и мышиными моноклональными АТ-ТПО, распознававшими эпитопы, расположенные на четырех доменах ТПО: A, B, C и D . Эти пионерские исследования показали, что иммунодоминантный регион (ИДР) ТПО, распознаваемый антителами, ограничен участком, перекрывающим домены A и B . Этот вывод был сделан позднее после того, как были проведены исследования с моноклональными человеческими антителами в форме Fab-фрагментов, продуцируемых В-лимфоцитами, инфильтрировавшими ЩЖ при болезни Грейвса и тирео-идите Хашимото . Оба региона, распознававшиеся человеческими моноклональными антителами, представляли собой одни и те же домены А и В . Кроме того, незначительная часть линейно расположенных эпитопов, распознанных АТ-ТПО вне ИДР, включала домены С2 и С21 . Было показано, что большая часть эпитопов, которые распознаются АТ-ТПО, конформационны, то есть зависят от третичной пространственной структуры и правильности складчатости молекулы ТПО . Точная локализация и структура прерывистого ИДР молекулы ТПО пока не выяснена. Недавние достаточно убедительные данные свидетельствуют о том, что ИДР ТПО ограничен МПО-подобным доменом . Влияние конформации ИДР ТПО было продемонстрировано в эксперименте с использованием человеческого Fabs и поликлональных антител против пептидов, которые могут экспрессироваться на поверхности человеческой АТ-ТПО . Некоторые исследования идентифицировали фрагменты эпитопов ТПО и подтвердили переменчивую природу ИДР ТПО . Моделирование структуры ТПО на основании ее гомологии с МПО позволяет предсказать потенциальную поверхность антигенов ТПО. Так были идентифицированы пептиды, прилежащие к эпитопам, локализованным в МПО-подобных доменах ТПО: остатки 713-717, 599-617, 210-225, 353-363, 549-563 . Кроме того, было постулировано наличие в ИДР БКК-подобного и ЭРФ-подобного доменов . ЭРФ-подобная порция ТПО была исключена, тогда как БКК-подобный модуль, вероятно, влияет на ИДР лишь неспецифично . Недавние экспериментальные данные позволили предположить, что БКК-подобный модуль ТПО является одной из частей варьирующего ИДР ТПО . Фрагмент ТПО, участвующий в связывании АТ-ТПО, к настоящему времени идентифицирован (остатки 210-225, 353-363, 549-563, 599-617, 713-720 и 766-775) в доменах А и В ИДР, локализованных в МПО-подобном и БКК-подобном модулях. В целом эти данные свидетельствуют о прерывистой и сложной природе ИДР. В нативной структуре ТПО, МПО- и БКК-подобные модули, вероятно, расположены в близком соседстве, образуя поверхность, узнаваемую АТ-ТПО у большинства пациентов с АЗЩЖ. Изучение ИДР ТПО с использованием человеческих, мышиных и кроличьих антител позволило предположить, что ИДР (А и В) образует отдельный комплекс в молекуле ТПО, расположенный в области остатков 599-617, лежащий в МПО-подобном домене . Это свидетельствует о том, что складчатая структура молекулы ТПО имеет очень высокую плотность и генерирует отдельную высококонформационную иммунодоминантную поверхность, к которой образуются АТ-ТПО. Несмотря на это, БКК-подобный (содержащий остаток Tyr 772) и ЭРФ-подобный модули вместе с петлевым регионом ТПО, вероятно, имеют важное значение для формирования трехмерной пространственной структуры, необходимой для связывания с антителами. Считается, что соотношение различных АТ-ТПО, направленных против отдельных эпитопов ИДР, не отражается на функции ЩЖ, сохраняется постоянным на протяжении длительного времени и детерминировано генетически .

Заключение

ТПО является важнейшим ферментом, участвующим в биосинтезе гормонов ЩЖ, и важнейшим антигеном при ее аутоиммунных заболеваниях. АТ-ТПО являются наиболее значимым маркером аутоиммунных тиреопатий, тем не менее их роль в аутоиммунных процессах противоречива. В последние годы предпринималось много попыток идентификации и характеристики иммунодоминантного региона ТПО и последовательности аминокислотных остатков, которые контактируют с АТ-ТПО. Имеющиеся в настоящее время и ожидаемые в будущем данные об иммунодоминантном регионе ТПО могут в существенной мере помочь разработке подходов к модулированию иммунного ответа при аутоиммунных заболеваниях ЩЖ.

Список литературы

1. Taurog A. Hormone synthesis: thyroid iodine metabolism // Werner and Ingbar’s. The Thyroid: a Fundamental Text / L.E. Braverman, R.D. Utiger (eds.). — 8th edn. — Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2000.

2. Kimura S., Kotani T., McBride O.W. et al. Human thyroid peroxidase: complete protein sequence, chromosome mapping, and identification two alternately spliced mRNAs // Proc. Natl. Acad. Sci. — 84. — 5555-9.

3. De Vijlder J.J., Dinsart C., Libert F. et al. Regional localization of the thyroid peroxidase to human chromosome 2pter-p12 // Cell. Genet.— 1988. — 47. — 170-2.

4. Damante G., Di Lauro R. Thyroid-specific gene // Biochеm. Biophys Acta. — 1994. — 1218. — 255-66.

5. Kambe F., Seo H. Thyroid-specific transcription factors // J. — 1997. — 44. — 775-84.

6. Zanelli E., Henry M., Charvet B., Malthiery Y. Evidence alternate splicing in the thyroperoxidase messenger patients with Graves’ disease // Biochem. Biophys. — 1990. — 17. — 735-41.

7. Ferrand M., Le Fourn V., Franc J.L. Increasing diversity thyroperoxidase generated by alternative splicing // 2003. — 278. — 3793-800.

8. Le Fourn V., Ferrand M., Franc J.L. Differential expression thyroperoxidase mRNA splice variants in human thyroid // Biochеm. Biophys. Acta. — 2004. — 1689. — 134-41.

9. Niccoli P., Fayadat L., Panneels V. et al. Thyroperoxidase in its alternatively spliced form (TPO2) enzymatically inactive and exhibits changes in intracellular processing and trafficking // J. Biol. Chem. — 1997. — 272. — 29487-92.

10. Niccoli-Sire P., Fayadat L., Siffroi-Fernandez S., Franc J.L. Alternatively spliced form of human thyroperoxidase, TPOzanelli: activity, intracellular trafficking, and hormonogenesis // Biochemistry. — 2001. — 40. — 2572-9.

11. Fayadat L., Niccoli-Sire P., Lanet J., Franc J.L. Role of intracellular trafficking of thyroperoxidase and involvement generated at the apical surface of thyroid cells in covalent heme binding // J. Biol. Chem. — 1999. — 274. — 10533-8.

12. Elisei R., Vassart G., Ludgate M. Demonstration of the alternatively spliced form of thyroid peroxidase normal thyroid // J. Clin. Endocrinol. Metab. — 1991. — 72. — 700-2.

13. Gardas A., Lewartowska A., Sutton B.J. et al. Human thyroid peroxidase (TPO) isoforms, and TPO-2: analysis of protein expression in Graves’ tissue // J. Clin. Endocrinol. Metab. — 1997. — 82. — 3752-7.

14. Kimura S., Ikeda-Saito M. Human myeloperoxidase peroxidase, two enzymes with separate and distinct physiological functions, are evolutionary related members gene family // Proteins. — 1988. — 3. — 113-20.

15. Johnson K.R., Nauseef W.M., Care A. et al. Characterization of cDNA clones for human myeloperoxidase: predicted amino acid sequence and evidence for multiple mRNA species // Nucleic. Acids Res. — 1987. — 15. — 2013-28.

16. Morishita K., Tsuchiya M., Asano S. et al. Chromosomal gene structure of human myeloperoxidase and regulation of its expression by granulocyte colony-stimulating factor // J. Biol. Chem. — 1987. — 262. — 15208-13.

17. Dull T.J., Uyeda C., Strosberg A.D. et al. Molecular cloning of cDNAs encoding bovine and human lactoperoxidase // DNA Cell.
Biol. — 1990. — 9. — 499-509.

18. Kiser C., Caterina C.K., Engler J.A. et al. Cloning and sequence analysis of the human salivary peroxidase-encoding cDNA // Gene. — 1996. — 173. — 261-4.

19. Sakamaki K., Tomonaga M., Tsukui K., Nagata S. Molecular cloning and characterization of a chromosomal gene for human eosinophil peroxidase // J. Biol. Chem. — 1989. — 264. — 16828-36.

20. Daiyasu H., Toh H. Molecular evolution of the myeloperoxidase family // J. Mol. Evol. — 2000. — 51. — 433-5.

21. Magnusson R.P., Gestautas J., Seto P. et al. Isolation and characterization of a cDNA clone for porcine thyroid peroxidase // FEBS Lett. — 1986. — 208. — 391-6.

22. Libert F., Ruel J., Ludgate M. et al. Thyroperoxidase, an auto-antigen with a mosaic structure made of nuclear and mitochondrial gene molecules // EMBO J. — 1987. — 13. — 4193-6.

23. Derwahl M., Seto P., Rapoport B. Complete nucleotide sequence of the cDNA for thyroid peroxidase in FRTL5 rat thyroid cells // Nucleic. Acids Res. — 1989. — 17. — 8380.

24. Kotani T., Umeki K., Yamamoto I. et al. Nucleotide sequence of the cDNA encoding mouse thyroid peroxidase // Gene. — 1993. —
123. — 289-90.

25. Roitsch T., Lehle L. Structural requirement for protein glycosylation. Influence of acceptor peptides on cotranslational glycosylation of yeast invertase and site-directed mutagenesis around a sequon sequence // Eur. J. Biochem. — 1989. — 181. — 525-9.

26. Rawitch A.B., Pollock G., Yang S.X., Taurog A. Thyroid peroxidase glycosylation: the location and nature of the N-linked oligosaccharide units in porcine thyroid peroxidase // Arch. Biochem. Biophys. —
1992. — 297. — 32132-7.

27. Hobby P., Gardas A., Radomski R. et al. Identification of an immunodominant region recognized by human autoantibodies in a three-dimensional model of thyroid peroxidase // Endocrinology. — 2000. — 141. — 2018-26.

28. Gardas A., Sohi M.K., Sutton J. et al. Purification and crystallization of the autoantigen thyroid peroxidase from human Graves’ thyroid tissue // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1997. — 234. — 366-70.

29. Hendry E., Taylor G., Ziemnicka K. et al. Recombinant human thyroid peroxidase expressed in insect cells is soluble at high concentrations and forms diffracting crystals // J. Endocrinol. — 1999. — 160. — R13-R5.

30. Kimura S., Hong Y.S., Kotani T., Kikkawa F. Structure of the human thyroid peroxidase gene: Comparison and relationship to the human myeloperoxidase gene // Biochem. — 1989. — 28. — 4481-9.

31. Zeng J., Fenna R.E. X-ray crystal structure of canine myeloperoxidase at 3 A resolution // J. Mol. Biol. — 1992. — 226. — 185-207.

32. Fenna R., Zeng J., Davey C. Structure of the green heme in myeloperoxidase // Arch. Biochem. Biophys. — 1995. — 316. — 653-65.

ях между ними [Воронова и др., 1981]. Применение хрома-тографических методов исследований позволило выделить два белка с пероксидазной активностью и изучить некоторые каталитические свойства их в опыте и контроле [Андреева и др., 1979; Андреева, 1981]. Это дало возможность получить новую информацию об активности изопероксидаз вирозных растений.

Из работ, вышедших за последнее время, наибольшее внимание заслуживает коллективный труд авторов «Биохимия иммунитета, покоя, старения растений» , выполненный в Институте биохимии им. А. Н. Баха. Изучая различные стороны метаболизма растений, пораженных грибными заболеваниями, авторы дают анализ различных биотических индукторов защитных реакций растений и возможные пути их практического использования. Однако в нем не проанализированы сведения о биохимии защитных реакций растений, зараженных вирусами. Взаимодействие растений-хозяев и вирусов, их поражающих, происходит иначе, чем при заражении грибами и бактериями, так как у вирусов нет

собственной ферментной системы. Вирус индуцирует в клетках растений* процессы, полностью зависящие от метаболических путей хозяина. К тому же один и тот же вирус может вызывать различную реакцию у разньш хозяев, а разные вирусы - неидентичные реакции у одного и того же хозяина. В настоящее время мы имеем, как правило, разрозненный мате* риал, полученный на растениях-хозяевах в различные сроки заражения и взятия проб для эксперимента. Исследователи выделяют отдельные мета4 болические реакции и на их основе пытаются понять взаимодействие вирус-растение. Очевидно, совершенно необходимо проводить исследования на одном растении-хозяине, поражаемом как вирусным, так и грибным заболеванием, в целях четкого понимания общих закономерно! стей и определенных различий в путях иммунных процессов инфицирован-, ных растений.

Современная сельскохозяйственная практика (посев семенами одного сорта на больших площадях, применение фунгицидов, инсектицидов и т. д.) способствует возникновению новых рас патогенов, которые могут в сильной степени поражать ранее устойчивые сорта растений. Если в прежние годы сорта могли сохраняться 2-3 десятилетия, то теперь устойчивость к возбудителям теряется уже через 5-7 лет [Конарев, 1985]. В условиях промышленного возделывания растений из природной популяции могут выделяться и накапливаться сильновирулентные штаммы вирусов, поражающие постоянно высеваемые культуры. Все это определяет необходимость глубокого изучения биохимических основ механизмов фитоиммунитета, а полученные теоретические разработки более эффективно использовать для приемов борьбы и защиты растений от патогенов.

Автор выражает искреннюю признательность сотрудникам Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО АН СССР кандидатам химических наук Олегу Борисовичу Максимову, Раисе Петровне Горшковой и Нине Арвидовне Василевской за консультацию и помощь в выполнении работ по определению углеводов и фенольных соединений, а также Светлане Ильиничне Омельченко, принимавшей активное участие в проведении совместных исследований.

ПЕРОКСИДАЗА - ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЙ

1.1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА

Проявление пероксидазной функции у биологических объектов было замечено еще в прошлом веке, на заре изучения органических веществ. Самое раннее сообщение о пероксидазе появилось в 1855 г., после того как Шенбейн провел окисление ряда органических соединений разбавленными растворами перекиси а присутствии экстрактов из растений и животных . Название «пероксидаза» дал Линозье ферменту, выделенному им из гноя лизированных лейкоцитов и катализирующему окисление разных соединений за счет перекисного кислорода (Linossier, 1898, цит. [Михлин, 1947]). Линозье первым привел различия между «оксидазами» и «пероксидазами». Как пишет Д. М. Михлин, выделением пероксидазы в сравнительно чистом виде и изучением основных ее свойств мы обязаны Алексею Николаевичу Баху и его сотрудникам. В 1903 г. они выделили пероксидазу, относительно свободную от других ферментов (в том числе от каталазы), чем было окончательно опровергнуто долгое время господствовавшее мнение о тождественности пероксидазы и каталазы.

А. Н. Бах и Р. Шода для оценки активности растительной пероксидазы использовали окисление пирогаллола до окрашенного пурпурогаллина (Bach, Shodat, 1903, цит. по: [Роговин и др., 1977]). Они нашли, что скорость образования пурпурогаллина пропорциональна концентрации.фермента и перекиси водорода. Этим методом пользуются биохимики и поныне для оценки активности как растительных, так и животных пероксидаз. В дальнейших исследованиях были определены оптимум действия пероксидазы, температурная зависимость, оптимум концентрации водородных ионов, установлено также значение концентрации субстрата в реакциях с ферментом и т. д. Для уровня исследований тех лет это было значительным шагом вперед в области изучения белков-ферментов растений. Именно тогда А. Н. Бахом была высказана гипотеза об участии перекисей в окислении органических соединений.

С годами интерес к ферменту пероксидазе не ослабевал. В 30-50-е годы внимание многих исследователей было приковано к таким геми-новым белкам, как пероксидаза, каталаза, цитохромы и гемоглобин. Подтверждением тому служит работа Д. М. Михлина «Пероксиды и пероксидазы», вышедшая в 1947 г. В 60-70-е годы большое внимание уделялось пероксидазам больного растения на кафедре физиологии

растений МГУ членом-корреспондентом ВАСХНИЛ Б. А. РубиныЛ и его сотрудниками. В 80-е годы на кафедре химической энзимологии МГУ, возглавляемой членом-корреспондентом АН СССР И. В. Бере! зиным, успешно велось изучение каталитических свойств пероксидазы, вы! деленной из растений хрена. Согласно сводке литературы, представленное швейцарскими и канадскими исследователями, только с 1970 по 1980 г. вышло из печати 1600 научных статей , посвященных этому ферменту. В них освещены различные стороны физико-химического строения, биологического действия и участия в метаболических процессах пероксидаз, в основном растительного происхождения. Представленный авторами список работ не является полным, так как не были учтены работы, касающиеся пероксидаз микро- и макроорганизмов.

Повышенное внимание к этому ферменту прежде всего вызвано тем, что до сих пор остается невыясненным наличие большого набора изоэнзимов (от 3 до 42) у многих исследуемых растительных пероксидаз. Скандалиоз считает пероксидазы «семейством» ферментов со сходными физиолого-биохимическими свойствами, где многое еще необходимо выяснить . Другой, не менее интересный вопрос заключается в широкой субстратной специфичности или, в узком понимании этого определения, в отсутствии таковой для пероксидаз. Установлено, что пероксидазы неспецифичны в отношении доноров водорода, но строго специфичны а отношении второго субстрата - перекиси водорода при проявлении пероксидазной функции фермента. Возможное участие пероксидаз в защитных реакциях или в других проявлениях патогенеза также способствует сохранению постоянного внимания исследователей к этому ферменту.

1.2. ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ МОЛЕКУЛЫ

Пероксидаза - двухкомпонентный фермент, представляющий собой сочетание активной группы, вступающей в химическое взаимодействие с субстратами, и коллоидального белкового «носителя», усиливающего каталитическое действие этой группы. Это глобулярный белок диаметром 50 A , который содержит около 43% а-спираль-ных участков в составе белковой части молекулы . По номенклатуре ферментов, принятой на Международном биохимическом съезде в 1979 г., пероксидаза - фермент, действующий на перекись водорода в качестве акцептора. Единственный подподкласс (1.11.1) составляют пероксидазы, где под кодовым номером семь стоит истинная пероксидаза - донор: Нг СЬ-оксидоредуктаза (КФ 1.11.1.7), о каталитическом действии которой более подробно будет сказано ниже.

Изученные до настоящего времени пероксидазы состоят из неокрашенного гликопротеина и соединенного с ним коричнево-красного ферри-порфирина. Геминовая часть молекулы (гем, гемин)-железопротопор-фирин IX представлен на рис. 1. Выполняя роль активного центра, он участвует в разложении или активации перекиси водорода, в результате чего возникают радикалы соответствующих субстратов . Простетическая группа пероксидаз хрена и японской редиски, цитохрома с, хлоропероксидазы известна как феррипротопорфи-рин IX. Полагают, что все известные пероксидазы и их изоформы содержат этот гем, поскольку они ингибируются азидами и цианидами.

Пероксидаза

Протогематин IX Гликопротеин

Fe3* Протопорфирин IX

Феррипротопорфирин IX входит в активный центр, составляя порфи-риновое кольцо гема, являющегося высокоароматичным и гидрофобным соединением. Именно гидрофобное взаимодействие порфиринового макроцикла с белком формирует третичную структуру нативной пероксидазы. Известно, что протопорфирин оказывает важное стабилизирующее влияние на белковую глобулу гемсодержащих ферментов. Так, комплексообра-зование апопероксидазы хрена с гемином резко повышает устойчивость белка к действию ультрафиолета и тепла. Удаление простетической

группы фермента ведет к потере пероксидазной активности, но не ска1 зывается на ее оксидазной функции .

Хилл и Холден в 1926 г. впервые добились успеха в расщеплении молекулы пероксидазы на простетическую группу и протеин, применяв обработку соляной кислотой и ацетоном . Маэли , используя различные приемы щелочного и кислотного гидролиза гем-протеиновой связи, показал, что при нейтрализации щелочью НСЫ расщепляющего раствора в присутствии подходящего буфера происхо-1 дит рекомбинация протогемина и протеина в активную пероксидазу] И эта обратимая реакция может быть повторена несколько раз с тем же энзимом без заметных потерь активности. Автор также отметил, чтя белок пероксидазы хрена устойчив при щелочном рН, а цвет ге

ПЕРОКСИДАЗЫ - группа окислительно-восстановительных ферментов (КФ 1.11.1.1 - 1.11.1.10), использующих в качестве акцептора электронов перекись водорода (H 2 O 2); катализируют реакцию:

Биол, значение П. определяется их участием в окислении различных субстратов на мембранах митохондрий и микросом. Основными биол, субстратами растительных П. являются полифенолы (см.). Катализируя окисление полифенолов при участии H 2 O 2 , П. принимают участие в процессе дыхания растительной клетки. У животных и человека П. также принимают участие в ряде окислительных процессов, протекающих в тканях. Так, П. в присутствии H 2 O 2 катализируют окисление адреналина, гистамина, жирных к-т, нуклеотидов, йодида. Образующийся в результате перокси-дазного окисления йодид-иона йод используется в процессе синтеза гормона щитовидной железы - тироксина. П. щитовидной железы, кроме окисления йодида, катализирует также ковалентное связывание дийодотирозиновых остатков, приводящее к образованию тироксина. Лакто-пероксидаза и П. лейкоцитов катализируют перекисное окисление липидов в присутствии H 2 O 2 и 1~. Предполагают, что такие системы придают антимикробную активность молоку, слюне и полиморфно-ядерным лейкоцитам. Степень активности П. в лейкоцитах служит дополнительным тестом при диагностике острого миелобластного лейкоза. П. слюны играют определенную роль в патогенезе пародонтоза. Определение активности П. в слюне используют в качестве вспомогательного теста при диагностике пародонтоза и для контроля эффективности его терапии.

В тканях животных содержится активная глутатионпероксидаза. В печени с действием этого фермента связано разрушение H 2 O 2 , которая образуется в результате деятельности различных оксидаз. Реакция, катализируемая глутатионпероксидазой, связана с окислением глюкозо-6-фосфата и одновременным восстановлением окисленного глутатиона, образующегося при восстановлении H 2 O 2 в пероксидазной реакции. Описано окисление восстановленной формы пиридиновых нуклеотидов системой O 2 -Mn 2+ -Пероксидаза.

П. используют для клинико-биохимического анализа в качестве одного из компонентов реакционной смеси при определении содержания глюкозы в биол, жидкостях глюко-зооксидазным методом (см. Городецкого методы).

Пероксидазная реакция была открыта в 1855 г. Шенбейном (Ch. F. Schonbein), а название этой группы ферментов «пероксидазы» предложил в 1898 г. Линоссье (М. Linossier).

П. широко распространены в животном и растительном мире. В больших количествах они содержатся в корнях хрена и турнепса, в млечном соке фигового дерева. У животных П. присутствуют в молоке, печени, слизистой оболочке кишок, слюнных железах, лейкоцитах, эритроцитах.

Физ.-хим. и биол, свойства П. наиболее детально изучены на примере пероксидазы из корней хрена, которая в 1941 г. была получена X. Теореллем в кристаллическом виде.

П. представляют собой гемопротеиды с мол. весом (массой) от 40 000 до 100 000. Была показана возможность обратимого отделения апофермента от простетической группы, которая является протогематином. Добавление чистого протогематина к апоферменту П. вызывало почти полное восстановление активности фермента. Установлено, что в процессе пероксидазной реакции окисляемый субстрат присоединяется непосредственно к атому железа простетической группы фермента. Пероксидазной активностью (хотя и относительно слабой) обладает и гемоглобин; это его свойство используют для экспресс-определения присутствия крови или гемоглобина, напр, в моче, а также идентификации следов крови в суд.-мед. практике.

Р-ры чистой П. имеют характерные максимумы поглощения в видимой области спектра при 645, 583, 548 и 498 нм.

П. проявляют высокую специфичность к перекисной группировке и во многих случаях мало специфичны по отношению к донору водорода (за исключением бактериальных П. и пероксидазы из земляного ореха). В отсутствие донора водорода (окисляемого субстрата) П. образуют комплексы с H 2 O 2 , что сопровождается изменением спектра поглощения фермента. П. образуют с H 2 O 2 четыре типа комплексов, легко обнаруживаемых спектрофотометрически (см. Спектрофотометрия). Комплекс I образуется сразу же при добавлении H 2 O 2 к ферменту и представляет собой нестойкое соединение зеленого цвета, к-рое обычно быстро превращается в комплекс II светло-красного цвета. При избытке H 2 O 2 образуются комплексы III и IV - соединения темно-красного цвета. Эти комплексы каталитически неактивны, их образование приводит к генактивации фермента.

П. относительно термостабильны. В низких концентрациях их ингибируют так наз. дыхательные яды (цианид, азид, сульфид), связывающие железо в геминовых группах П., а также гидроксиламин, тиомочевина, окись азота.

Активность П. можно определять по количеству пирогаллола (см.), окисленного H 2 O 2 в присутствии фермента. Продукт окисления пирогаллола пурпурогаллин экстрагируют после осаждения белка из инкубационной смеси эфиром и определяют фотометрически. Об активности П. судят по рассчитанному количеству пурпурогаллина (пур-нурогаллиновое число), образуемого при действии 1 мг сухого ферментного препарата в течение 5 мин. при 20° из 5 г пирогаллола, растворенного в 2 л воды, содержащей 10 мл 0,5% р-ра H 2 O 2 .

Библиография: Барабаш Р. Д. и др. Роль пероксидазы в патогенезе пародонтоза, Вопр. мед. хим., т. 25, № 3, с. 333, 1979; Диксон М. и У э б б Э. Ферменты, пер. с англ., с. 96 и др., М., 1966; Номенклатура ферментов, пер. с англ., под ред. А. Е. Браунштейна, с. 75, М., 1979.

И. В. Веревкина.

Перекись водорода, образующаяся в процессе двухэлектронного восстановления кислорода или более сложным путем, например, при дисмутации супероксид-анионов разрушается пероксидазами и каталазами.

Пероксидазы катализируют двухэлектронное восстановление Н202 до Н20, используя в качестве донора электронов различные восстановители:

Н202 + SH2 - 2Н20 + S

Пероксидазы широко распространены в растительных тканях, где они находятся в пероксисомах.

В животных организма фермент содержится в слюне, печени, почках, лейкоцитах и других органах и тканях. Несколько изоформ пероксидаз (лактоперокси- даза, миелопероксидаза лейкоцитов, цитохром-С-пероксидаза дрожжей, пероксидаза хрена) выделены в кристаллической форме. Все перечисленные пероксидазы активируют Н202 и ROOH, а также имеют много общего в их свойствах, так как в качестве простетической группы содержат железопорфирин. В отличие от цитохрома Р450 пятым лигандом иона железа является гистидин, а шестое координационное место могут занимать различные лиганды (Н20, CN и др.). По-видимому, обмен лигандов в шестом положении имеет существенное значение для функционирования пероксидаз.

Максимум поглощения фермента в окисленной форме составляет 420 и 541 нм, а в восстановленной - 432, 535 и 565 нм. Пероксидаза в своей структуре содержит высокоспиновое железо (Fe3+) и по своим свойствам напоминает мет- гемоглобин (раздел 8.1.3). При восстановлении (Fe2+) фермента возможно необратимое присоединение кислорода (оксиперокси- даза).

Механизм действия пероксидаз еще во многом неясен. При его изучении особенно большое внимание уделяется различным окислительно-восстановительным состояниям фермента, которых может быть не менее пяти: Fe2+, Fe3+, комплексы I-III .

Не вдаваясь в подробности электронной структуры комплекса 1, которая детально рассмотрена в работах отметим, что он содержит два окислительных эквивалента.

Один из них локализован на ионе железа, а другой - на порфириновом кольце гемопротеина.

Комплекс 1 неустойчив и легко превращается в соединение красного цвета с максимумом поглощения при 417, 530 и 561 нм. Это так называемый комплекс II. Титрование показывает, что комплекс I превращается в комплекс II одноэлектронным восстановлением.

Избыток Н202 приводит к образованию комплекса III, обладающим максимумом поглощения при 417, 545 и 583 нм. По своим свойствам и действию он аналогичен оксипероксидазе и по спектральным характеристикам напоминает оксимиоглобин и оксигемоглобин. Однако предполагается, что кислород в комплексе III более активирован, чем в названных гемопротеинах.

Пероксидаза катализирует незначительное число реакций окисления ксенобиотиков, в том числе и лекарственных средств. Это могут быть реакции окисления аминов, фенолов, периодиро- вания, переалкилирования .

Отмечено , что как и в случае CYP при окислении фенил- гидразина пероксидазой в качестве продукта реакции образуется фенильный радикал, алкилирующий гем (раздел 10.2).

Значительную роль в клетке играет и глутатионперокси- даза, эффективная при низких концентрациях перекиси водорода. Этот фермент также катализирует процессы с участием гидроперекисей липидов, что особенно важно в реакциях со- окисления лекарств (раздел 8.1.1.5).