روش های تعیین ترکیب اسید آمینه پروتئین ها. تعیین ترکیب اسید آمینه پروتئین ها

محتویات مقدمه 1. اجزای اصلی شیر 2. روشهای تجزیه اسید آمینه 1. روش کروماتوگرافی تجزیه و تحلیل 2. روش اسپکتروفتومتری تجزیه و تحلیل 3. روش تجزیه تیترومتری 4. روش الکتروشیمیایی تجزیه و تحلیل 3. روشهای تعیین ترکیب اسید آمینه 1. تعیین اسیدهای آمینه توسط کروماتوگرافی لایه نازک 3.2. تعیین آمینو اسیدها به روش اسپکتروفتومتری 4. بررسی مجلات چکیده فهرست ادبیات استفاده شده مقدمه مشکل تغذیه یکی از مهمترین مشکلات اجتماعی است.

زندگی، سلامتی و کار انسان بدون غذای مغذی غیرممکن است. بر اساس تئوری تغذیه متعادل، رژیم غذایی فرد نه تنها باید حاوی پروتئین، چربی و کربوهیدرات در مقادیر مورد نیاز باشد، بلکه باید حاوی موادی مانند اسیدهای آمینه ضروری، ویتامین ها و مواد معدنی به نسبت های معینی باشد که برای انسان مفید است.

در سازماندهی تغذیه مناسب، نقش اولیه به محصولات لبنی داده می شود. این به طور کامل در مورد شیر صدق می کند که ارزش غذایی آن به دلیل غلظت بالای پروتئین و چربی شیر در آن، وجود اسیدهای آمینه ضروری، نمک های کلسیم و فسفر است که برای رشد طبیعی بدن انسان بسیار ضروری است. هضم آسان یکی از مهمترین خواص شیر به عنوان یک محصول غذایی است. علاوه بر این، شیر جذب مواد مغذی از سایر غذاها را تحریک می کند.

شیر به رژیم غذایی تنوع می بخشد، طعم سایر محصولات را بهبود می بخشد و خواص درمانی و پیشگیری کننده دارد. شیر حاوی بیش از 120 جزء مختلف از جمله 20 اسید آمینه، 64 اسید چرب، 40 ماده معدنی، 15 ویتامین، ده ها آنزیم و غیره است. ارزش انرژی 1 لیتر شیر خام 2797 کیلوژول است. یک لیتر شیر نیاز روزانه یک فرد بالغ به چربی، کلسیم، فسفر، 53 درصد به پروتئین، 35 درصد به ویتامین A، C و تیامین و 26 درصد به انرژی را برطرف می کند. هدف اصلی این دوره، شناسایی ترکیب اسید آمینه شیر است. 1.

اجزای اصلی شیر

از دیدگاه فیزیکوشیمیایی، شیر یک پلی پراکنده پیچیده است... 5.1). بزرگترین وزن مخصوص در شیر آب است (بیش از 85 درصد، بقیه ... باقیمانده خشک شامل تمام مواد مغذی شیر است. تعیین کننده بازده محصولات نهایی در تولید لبنیات...

روش کروماتوگرافی تجزیه و تحلیل

یکی از امیدوار کننده ترین روش ها روش بسیار موثر است... اما مزایای روش به طور قابل توجهی بیشتر از معایب آن است. علاوه بر این، می توان از آن برای تکمیل تجزیه و تحلیل شیمیایی استفاده کرد.... بر روی ستون های مویرگی کروماتوگرافی گازی مدرن در یک ... این روش با حساسیت بالا مشخص می شود و اجازه می دهد تا کمی...

روش تیترومتری آنالیز

روش تیترومتری آنالیز. از روش های تیترومتری برای تعیین کمی، وسیع ترین ... تیتراسیون را می توان با یک نشانگر (بنفش کریستالی...) انجام داد اما این روش دارای تعدادی معایب قابل توجه است: استفاده از ... برای تجزیه و تحلیل کمی آمینوهای منفرد اسیدها، ملاقات ...

روش تجزیه و تحلیل الکتروشیمیایی

در دهه‌های اخیر، الکتروشیمیایی‌ها به طور فزاینده‌ای گسترش یافته‌اند... 3.. در شرایط بهینه، تعیین تنها am فردی را ممکن می‌سازند... بنابراین، روشی برای تعیین پلاروگرافی تریپتوفان توسعه داده شده است. روش تجزیه و تحلیل الکتروشیمیایی

روش های تعیین ترکیب اسید آمینه

روشهای تعیین ترکیب اسید آمینه 3.1.

تعیین اسیدهای آمینه با کروماتوگرافی لایه نازک

84 گرم مونوهیدرات اسید سیتریک در 1 لیتر آب مقطر حل می شود... 3.2.. پس از 10 دقیقه، فیلم در یک محفظه CG با بافر نیترات (بافر... روش شناسی: 2 (10) میکرولیتر p. هیدرولیز به خط شروع صفحه اعمال می شود... نمونه های قطره و اسیدهای آمینه استاندارد روی خط شروع روی صفحه اعمال می شود.

تعیین اسیدهای آمینه به روش اسپکتروفتومتری

اسیدهای آمینه، آمین های اولیه، پلی پپتیدها و پپتون ها هنگامی که با ... 0.2 - 3% محلول نین هیدرین گرم می شوند در حلال های مختلف تهیه می شوند (isobu... 2007. volume 2. Tsvetkova N.D.

با مطالب دریافتی چه خواهیم کرد:

اگر این مطالب برای شما مفید بود، می توانید آن را در صفحه خود در شبکه های اجتماعی ذخیره کنید:

چکیده ها، دروس و پایان نامه های بیشتر در این زمینه:

تعریف آنتروپی تعیین تلفات اطلاعات هنگام انتقال پیام از طریق کانال های ارتباطی با نویز

تعریف ماهیت سیستم مدیریت مالی: موضوع و روش. می‌توانیم تعریف تقریبی از هدف مدیریت ارائه دهیم: ارائه اطلاعات مفید برای مدیریت سازمان
Buu بخشی از سیستم اطلاعات سازمانی است، از یک طرف، از طرف دیگر، فعالیتی است که هدف آن ارائه اطلاعات به مدیریت است. ماهیت yu در ماهیت تحلیلی اطلاعات نهفته است، جمع آوری، گروه بندی، شناسایی و مطالعه می شود.

این دستورالعمل‌ها برای کمک به دانش‌آموزان در انجام کارهای آزمایشگاهی بر روی توصیف و شناسایی کانی‌ها و سنگ‌ها در نظر گرفته شده است. این دستورالعمل‌ها اصطلاحات و تکنیک‌های توصیفی لازم را ارائه می‌دهند. دستورالعمل‌ها گزینه‌های کار و نمونه‌هایی را برای انجام کارهای ساخت‌وساز محاسباتی و گرافیکی ارائه می‌دهند.

اموال شرکت: ترکیب، هدف. تعیین نیاز به سرمایه ثابت و در گردش
سرمایه یک بنگاه اقتصادی را می توان از چند منظر در نظر گرفت؛ اول از همه، بهتر است بین سرمایه تمایز قائل شد.

جرم جنایت به ما اجازه می دهد که یکی از دیگری را تشخیص دهیم... برای پرداختن به جسم جرم ابتدا باید به دلایل جرم نگاه کنیم... ابتدا باید بفهمیم که دلایل جرم چیست و سپس خواهیم دید که تنها اساس این است که ...

تعریف آنتروپی تعیین تلفات اطلاعات هنگام انتقال پیام از طریق کانال های ارتباطی با نویز. گزینه هایی برای انجام وظایف
وظیفه تعیین آنتروپی است. یک پیام از n کاراکتر تشکیل شده است، m نوع نماد، تعداد حروف وجود دارد. وظیفه تعیین تلفات اطلاعات هنگام انتقال پیام از طریق کانال های ارتباطی با نویز است.

تکالیف برای برگزاری کلاس های عملی در درس حسابداری 1. بر اساس ترکیب دارایی روستوف JSC، دارایی های اقتصادی اموال را بر اساس نوع و ترکیب گروه بندی کنید.
دانشکده حسابداری و اقتصاد.. خاخونوا ن.. تکالیف کلاسهای عملی..

کلاس های اصلی ترکیبات معدنی تعیین جرم مولی معادل روی. تعیین گرمای واکنش خنثی سازی. سرعت یک واکنش شیمیایی. کاتالیزور
مقدمه.. هنگام مطالعه شیمی، کار عملی آزمایشگاهی از اهمیت بالایی برخوردار است. یک آزمایش درست انجام شده اجازه می دهد.

محیط یکپارچه و ترکیب شیء زبان پاسکال. ترکیب زبان
مطالب.. سخنرانی محیط یکپارچه و ترکیب زبان پاسکال آبجکت.. کار با ویرایش ویندوز در آبجکت پاسکال..

مقدمه ای بر سیستم عامل ها. تعریف، هدف، ترکیب و عملکرد سیستم عامل ها
موسسه آموزشی دولتی آموزش عالی حرفه ای.. دانشگاه خدمات دولتی تولیاتی..

برای تعیین اسیدهای آمینه سازنده پروتئین ها از هیدرولیز اسیدی (HC1)، قلیایی (Ba(OH)2) و هیدرولیز آنزیمی استفاده می شود. هنگامی که پروتئین خالص، عاری از ناخالصی، هیدرولیز می شود، 20 اسید آمینه مختلف آزاد می شود.

آمینو اسید،اجزای پروتئین ها هستند
اسیدهای آمینه a. همه آنها به سری L تعلق دارند و بزرگی و علامت چرخش نوری به ماهیت رادیکال های اسید آمینه و مقدار pH محلول بستگی دارد. اسیدهای آمینه D در پروتئین های انسانی یافت نمی شوند، اما در دیواره سلولی باکتری ها به عنوان بخشی از برخی آنتی بیوتیک ها (اکتینومایسین ها) یافت می شوند.

اسیدهای آمینه در ماهیت شیمیایی رادیکال R با یکدیگر متفاوت هستند، که در تشکیل پیوند پپتیدی شرکت نمی کند.

طبقه بندی منطقی مدرن اسیدهای آمینه بر اساس قطبیت رادیکال ها است:

غیر قطبی (آب گریز)

قطبی (آب دوست)

شارژ منفی

در برخی پروتئین ها یافت می شود مشتقات اسید آمینه. کلاژن پروتئین بافت همبند حاوی هیدروکسی پرولین و اکسی لیزین است. دیودوتیروزین اساس ساختار هورمون های تیروئید است.

اسیدهای آمینه یک خاصیت مشترک دارند - آمفوتریک(از یونانی amphoteros - دو طرفه). در محدوده pH 4.0-9.0، تقریباً تمام اسیدهای آمینه به شکل یون های دوقطبی (zwitterions) وجود دارند. معنی نقطه ایزوالکتریک یک اسید آمینه (IEP, pI)با فرمول محاسبه می شود:

.

برای اسیدهای مونو آمینو دی کربوکسیلیک، pI به عنوان نیمی از مجموع مقادیر pK (جدول 1) گروه های a- و w-کربوکسیل، برای اسیدهای دی آمینو مونو کربوکسیلیک - به عنوان نصف مجموع مقادیر pK a- و w- محاسبه می شود. گروه های آمینه

اسیدهای آمینه غیر ضروری (که می توانند در بدن انسان سنتز شوند) و اسیدهای آمینه ضروری هستند که در بدن تشکیل نمی شوند و باید با غذا تامین شوند.

اسیدهای آمینه ضروری: والین، لوسین، ایزولوسین، لیزین، متیونین، ترئونین، تریپتوفان، فنیل آلانین.

اسیدهای آمینه ضروری:گلیسین، آلانین، آسپاراژین، آسپارتات، گلوتامین، گلوتامات، پرولین، سرین.

قابل تعویض مشروط(از سایر اسیدهای آمینه در بدن می توان سنتز کرد): آرژنین (از سیترولین)، تیروزین (از فنیل آلانین)، سیستئین (از سرین)، هیستیدین (با مشارکت گلوتامین).

برای کشف و تعیین کمیت اسیدهای آمینه در اشیاء بیولوژیکی، از واکنش با نین هیدرین استفاده می شود.

جدول 1. ثابت های تفکیک اسید آمینه

تعیین ترکیب اسید آمینه پروتئین ها را می توان با روش های مختلفی انجام داد: شیمیایی، کروماتوگرافی، میکروبیولوژیکی و ایزوتوپی. روش های کروماتوگرافی بیشتر مورد استفاده قرار می گیرند.

کروماتوگرافی کاغذی کروماتوگرافی کاغذی برای شناسایی اجزای ترکیبی از اسیدهای آمینه با دی و تری پپتیدهای حاصل از هیدرولیز جزئی پروتئین ها و پلی پپتیدها استفاده می شود.

هیدرولیز را می توان با روش های اسیدی، قلیایی یا آنزیمی انجام داد. روش اسیدی بیشتر مورد استفاده قرار می گیرد (6 N HCl، 8 N H 2 SO 4). هیدرولیز با حرارت دادن انجام می شود، گاهی اوقات در فشار بالا. شاخص های پایان هیدرولیز می تواند: توقف رشد گروه های کربوکسیل یا آمین در هیدرولیز یا واکنش بیورت منفی باشد. معرف هیدرولیز اضافی حذف می شود: اسید سولفوریک با Ca(OH) 2 رسوب می کند، اسید کلریدریک در خلاء تقطیر می شود و اسید باقی مانده با نیترات نقره رسوب می کند.

اجزای هیدرولیز بین آب جذب شده روی سلولز، که فاز ساکن است، و یک حلال آلی، فاز متحرک، که در طول ورق به بالا یا پایین حرکت می کند، توزیع می شود. مخلوطی از بوتانول-اسید استیک-آب (4:1:5) به عنوان فاز متحرک استفاده می شود. اسیدهای آمینه چربی دوست بیشتر به شدت جذب حلال آلی می شوند، در حالی که آمینو اسیدهای آبدوست بیشتر تمایل بیشتری برای اتصال به فاز ساکن نشان می دهند. ترکیبات همولوگ که حتی یک واحد متیلن با هم تفاوت دارند با سرعت های متفاوتی حرکت می کنند و به راحتی قابل جداسازی هستند. در پایان کروماتوگرافی، کاغذ خشک شده و با یک توسعه دهنده (محلول 5/0 درصد نین هیدرین در مخلوطی از استون-اسید استیک یخبندان-آب) درمان شده و برای چند دقیقه حرارت داده می شود. اسیدهای آمینه به صورت لکه های رنگی ظاهر می شوند. تحرک یک مقدار ثابت مشخصه هر ترکیب است و با افزایش وزن مولکولی افزایش می یابد. برای اسیدهای آمینه با زنجیره مستقیم، مقدار تحرک کمی بیشتر از ایزومرهای مربوطه است. ورود گروه های قطبی به مولکول باعث کاهش تحرک ترکیب می شود. اسیدهای آمینه با زنجیره‌های جانبی غیرقطبی حجیم (لوسین، ایزولوسین، فنیل آلانین، تریپتوفان و غیره) سریع‌تر از اسیدهای آمینه با زنجیره‌های جانبی غیرقطبی کوتاه‌تر (پرولین، آلانین، گلیسین) یا با زنجیره‌های جانبی قطبی (ترئونین، آرژنین، سیستئین، هیستیدین)، حرکت می‌کنند. لیزین). این به دلیل حلالیت بیشتر مولکول های قطبی در فاز ساکن آبدوست و مولکول های غیر قطبی در حلال های آلی است.

از کروماتوگرافی کاغذی می توان برای تعیین کمیت اسید آمینه استفاده کرد. هر نقطه برداشته شده و با یک حلال مناسب شسته می شود. سپس یک سنجش رنگ سنجی کمی (نین هیدرین) انجام می شود. در تجسم دیگر، کاغذ با نین هیدرین پاشیده می شود و شدت رنگ لکه با استفاده از نور سنج در نور منعکس شده یا عبوری اندازه گیری می شود. در یک ارزیابی نیمه کمی، محتوای اسید آمینه با مساحت نقاط روی کروماتوگرام، که متناسب با غلظت اسیدهای آمینه در مخلوط جدا شده است، ارزیابی می شود.

کروماتوگرافی لایه نازک. همچنین می توان از کروماتوگرافی لایه نازک برای جداسازی و تعیین اسیدهای آمینه استفاده کرد. همانطور که مشخص است TLC در دو نسخه وجود دارد. TLC پارتیشن مشابه TLC پارتیشن روی کاغذ است و TLC جذب بر اصول کاملا متفاوتی استوار است.

هنگام انجام RTLC روی پودر سلولز یا سایر حامل های نسبتاً بی اثر، می توان از همان سیستم های حلال و همان معرف های در حال توسعه مانند کروماتوگرافی کاغذی استفاده کرد.

جداسازی توسط ATLC با توانایی یک حلال (این حلال لزوماً یک مخلوط دوتایی یا پیچیده تر نیست) برای شستشوی اجزای نمونه از محل جذب آن بر روی جاذب فعال شده تعیین می شود. به عنوان مثال، روی سیلیکاژل گرم شده. ATLC برای جداسازی ترکیبات غیر قطبی مانند لیپیدها مفید است، اما برای جداسازی اسیدهای آمینه و بیشتر پپتیدها مفید نیست. برای جداسازی اسیدهای آمینه از RTLC استفاده می شود که به شما امکان می دهد 22 اسید آمینه هیدرولیز پروتئین را به سرعت جدا و تعیین کنید.

اسیدهای آمینه موجود در پروتئین هیدرولیز شده را نیز می توان با کروماتوگرافی گازی تعیین کرد، اما قبل از تجزیه و تحلیل کروماتوگرافی، اسیدهای آمینه معمولاً به ترکیبات فرار تبدیل می شوند.

تعامل با نین هیدرین آلدهیدهای مربوطه تشکیل می شوند.

بنابراین، مخلوطی از آلدئیدها به دست می آید و تجزیه و تحلیل می شود. این ساده ترین مورد است که فقط برای برخی از اسیدهای آمینه مناسب است.

اسیدهای آمینه به استرهای فرار (الکیل استرها، متیل استرهای هیدروکسی اسیدها، متیل استرهای اسیدهای کلردار و غیره) تبدیل می شوند.

انتخاب مشتقات به مخلوط آمینو اسیدهای مورد مطالعه بستگی دارد.

کروماتوگرافی تبادل یونی. در حال حاضر، ترکیب اسید آمینه محصولات غذایی منحصراً با استفاده از کروماتوگرافی تبادل یونی خودکار تعیین می شود.

روش مور و استین از ستون های کوتاه و بلند پر شده با رزین پلی استایرن سولفونه شده به شکل Na + استفاده می کند. هنگامی که یک هیدرولیز اسید در pH = 2 به ستون اعمال می شود، اسیدهای آمینه از طریق تبادل کاتیونی با یون های سدیم متصل می شوند. سپس ستون با محلول سیترات سدیم در pH و مقادیر دما از قبل برنامه ریزی شده شسته می شود. یک ستون کوتاه با یک بافر، یک ستون بلند با دو بافر شسته می شود. مایع شستشو با نین هیدرین تصفیه می شود و شدت رنگ را با استفاده از رنگ سنج اندازه گیری می کند. داده ها به طور خودکار روی یک ضبط کننده نمودار ثبت می شوند و می توانند برای محاسبه مساحت زیر پیک به رایانه منتقل شوند.

الکتروفورز ولتاژ بالا بر روی حامل های بی اثر. در بیوشیمی، جداسازی اسیدهای آمینه، پلی پپتیدها و سایر آمفولیت ها (مولکول هایی که بار کل آنها به pH محیط بستگی دارد) تحت تأثیر میدان الکتریکی ثابت اعمال شده کاربرد گسترده ای پیدا کرده است. این یک روش الکتروفورز ولتاژ بالا بر روی حامل های بی اثر است. هنگام جداسازی اسیدهای آمینه، نوارهای کاغذ یا لایه های نازک پودر سلولز اغلب به عنوان حامل های بی اثر استفاده می شود. جداسازی به مدت 0.5-2 ساعت با ولتاژ 2000-5000 ولت انجام می شود که بستگی به بار کل آمفولیت ها و وزن مولکولی آنها دارد. در بین مولکول هایی که بار یکسانی دارند، مولکول های سبک تر سریع تر مهاجرت می کنند. اما پارامتر مهمتر در هنگام جداسازی، شارژ کل است. این روش برای جداسازی اسیدهای آمینه، پپتیدهای با وزن مولکولی کم، برخی پروتئین ها و نوکلئوتیدها استفاده می شود. نمونه بر روی حامل قرار می گیرد، با یک بافر در pH مناسب مرطوب می شود و با یک نوار کاغذ صافی به مخزن بافر متصل می شود. کاغذ با یک صفحه شیشه ای پوشانده می شود یا برای خنک شدن در یک حلال هیدروکربنی غوطه ور می شود. در میدان الکتریکی، مولکول هایی که حامل بار منفی در pH معین هستند به آند مهاجرت می کنند و مولکول هایی که حامل بار مثبت هستند به کاتد مهاجرت می کنند. سپس، الکتروفروگرام خشک شده با نین هیدرین (هنگام کار با اسیدهای آمینه، پپتیدها) یا اندازه گیری جذب در نور UV (هنگام کار با نوکلئوتیدها) "توسعه" می یابد.

انتخاب pH با مقادیر pK گروه های تفکیک کننده موجود در مولکول های مخلوط تعیین می شود. در pH 6.4، گلوتامات و آسپارتات بار -1 را حمل می کنند و به سمت آند حرکت می کنند. جداسازی آنها به دلیل تفاوت در وزن مولکولی انجام می شود. لیزین، آرژنین و هیستیدین در جهت مخالف حرکت می کنند و سایر اسیدهای آمینه تشکیل دهنده پروتئین در نزدیکی محل مصرف باقی می مانند. هنگام جداسازی پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی، کاهش pH به 3.5 بار گروه های کاتیونی را افزایش می دهد و جداسازی بهتری را فراهم می کند.

روش های کاغذ، کروماتوگرافی لایه نازک، میکروبیولوژیک، کروماتوگرافی گازی و تعدادی روش دیگر به دلیل تکرارپذیری ضعیف و طولانی مدت در حال حاضر عملاً مورد استفاده قرار نمی گیرند. کروماتوگراف های مدرن امکان تعیین ترکیب اسید آمینه یک مخلوط حاوی تنها 10-7-10-9 مول از هر جزء را با تکرارپذیری تا 5٪ در 2-4 ساعت ممکن می سازد.

تجزیه و تحلیل ترکیب اسید آمینه شامل هیدرولیز کامل پروتئین یا پپتید مورد مطالعه و تعیین کمی تمام اسیدهای آمینه موجود در هیدرولیز می باشد. از آنجایی که پیوندهای پپتیدی در pH خنثی پایدار هستند، از کاتالیز اسیدی یا قلیایی استفاده می شود. کاتالیز آنزیمی کمتر برای هیدرولیز کامل مناسب است. هیدرولیز کامل یک پروتئین به اسیدهای آمینه تشکیل دهنده آن ناگزیر با از دست دادن جزئی برخی از باقی مانده اسیدهای آمینه همراه است. برای هیدرولیز معمولا از 6N استفاده می شود. محلول آبی اسید هیدروکلریک (110ºС)، در یک آمپول تخلیه شده. تعیین کمی اسیدهای آمینه در هیدرولیز با استفاده از تجزیه و تحلیل اسید آمینه انجام می شود. در اکثر این آنالایزرها، مخلوطی از اسیدهای آمینه روی مبدل های کاتیونی سولفونیک جدا می شود و تشخیص به روش اسپکتروفتومتری با واکنش با نین هیدرین یا فلورمتری با انجام می شود. O-دی آلدئید فتالیک

با این حال، داده ها در مورد ترکیب اسید آمینه محصولات مشابه به دست آمده در آزمایشگاه های مختلف برای اسیدهای آمینه فردی، گاهی اوقات تا 50٪ متفاوت است.

این تفاوت‌ها نه تنها به دلیل تنوع، گونه‌ها یا تفاوت‌های فنی، بلکه عمدتاً به دلیل شرایط هیدرولیز محصول غذایی است. با هیدرولیز اسید استاندارد (6 N HСl، 110-120ºС، 22-24 ساعت)، برخی از اسیدهای آمینه تا حدی از بین می روند، از جمله ترئونین، سرین (10-15٪ و بیشتر، هر چه مدت زمان بیشتری هیدرولیز انجام شود) و به ویژه متیونین (30-60٪) و سیستین 56-60٪، و همچنین تخریب تقریباً کامل تریپتوفان و سیستئین. این فرآیند در حضور مقادیر زیادی کربوهیدرات در محصول افزایش می یابد. برای تعیین کمی متیونین و سیستین، توصیه می شود که اکسیداسیون اولیه آنها با اسید پرمیک انجام شود. در این حالت سیستین به اسید سیستئیک و متیونین به متیونین سولفون تبدیل می شود که در طول هیدرولیز اسیدی بعدی بسیار پایدار هستند.

سیستین سیستئین اسید

یک کار دشوار در تجزیه و تحلیل اسید آمینه، تعیین تریپتوفان است. همانطور که قبلا ذکر شد، در طول هیدرولیز اسید تقریباً به طور کامل (تا 90٪) از بین می رود. بنابراین، برای تعیین تریپتوفان، یکی از انواع هیدرولیز قلیایی 2 نیوتن انجام می شود. NaOH، 100ºС، 16-18 ساعت در حضور 5٪ کلرید قلع یا 2 نیوتن. هیدروکسید باریم، که در آن کمی (تا 10٪) از بین می رود. حداقل تخریب در حضور اسید تیوگلیکولیک و نشاسته پیش هیدرولیز شده رخ می دهد. (در جریان هیدرولیز قلیایی، سرین، ترئونین، آرژنین و سیستئین از بین می روند). پس از خنثی سازی با مخلوطی از اسیدهای سیتریک و هیدروکلریک، هیدرولیز بلافاصله (برای جلوگیری از ژل شدن) روی یک آنالایزر اسید آمینه تجزیه و تحلیل می شود. در مورد روش های شیمیایی متعدد برای تعیین تریپتوفان، آنها، به عنوان یک قاعده، تولید ضعیفی در محصولات غذایی دارند و بنابراین استفاده از آنها توصیه نمی شود.

برای محصولات گوشتی، یک اسید آمینه ضروری اضافی هیدروکسی پرولین است که میزان پروتئین های بافت همبند در گوشت را مشخص می کند. می توان آن را با کروماتوگرافی تبادل یونی با استفاده از آنالایزرهای خودکار یا با روش رنگ سنجی شیمیایی تعیین کرد. این روش مبتنی بر خنثی سازی هیدرولیز اسید تا pH 6.0، اکسیداسیون بعدی هیدروکسی پرولین با استفاده از محلول 1.4 درصد کلرامین T (یا کلرامین B) در مخلوطی از پروپیل الکل و بافر، تعیین رنگ سنجی در 533 نانومتر از محصولات اکسیداسیون است. هیدروکسی پرولین پس از واکنش با 10٪ - محلول پارا دی متیل آمینو بنزآلدئید در مخلوطی از اسید پرکلریک و پروپیل الکل (1: 2).

با توجه به اینکه تیروزین، فنیل آلانین و پرولین می توانند تا حدی در حضور اکسیژن اکسید شوند، هیدرولیز اسید استاندارد توصیه می شود در اتمسفر نیتروژن انجام شود. تعدادی از اسیدهای آمینه از جمله لوسین، ایزولوسین و والین برای جداسازی کامل آنها از پروتئین ها به هیدرولیز اسیدی طولانی تری نیاز دارند - تا 72 ساعت. در بیوشیمی، هنگام تجزیه و تحلیل پروتئین ها، نمونه های موازی به مدت 24، 48، 72 و 96 ساعت هیدرولیز می شوند.

برای تعیین کمیت تمام اسیدهای آمینه، لازم است 5 هیدرولیز مختلف انجام شود که تعیین را بسیار طولانی می کند. معمولاً هیدرولیز 1-2 انجام می شود (استاندارد با اسید هیدروکلریک و با اکسیداسیون اولیه با اسید پرمیک).

برای جلوگیری از از دست دادن اسیدهای آمینه، حذف اسید اضافی در طول هیدرولیز اسید باید بلافاصله با تبخیر مکرر در یک خشک کن خلاء با اضافه کردن آب مقطر انجام شود.

هنگامی که آنالایزر به درستی کار می کند، ستون های تبادل یونی برای مدت طولانی بدون جایگزینی رزین کار می کنند. با این حال، اگر نمونه ها حاوی مقادیر قابل توجهی رنگ و لیپید باشند، ستون به سرعت مسدود می شود و بازسازی های متعدد، گاهی اوقات شامل بسته بندی مجدد ستون، برای بازیابی قابلیت های جداسازی آن لازم است. بنابراین برای محصولاتی که بیش از 5 درصد چربی دارند، توصیه می شود ابتدا چربی ها را با عصاره گیری حذف کنید. جدول 2.3 شرایط آماده سازی نمونه محصولات غذایی اصلی را هنگام تجزیه و تحلیل ترکیب اسید آمینه نشان می دهد.

جدول 2.3. - شرایط آماده سازی نمونه های غذا برای آنالیز

سوالات کنترلی:

1. مفهوم "پروتئین" را تعریف کنید.

2. پروتئین ها بر اساس عملکردشان در بدن به چه گروه هایی تقسیم می شوند؟

3. نقش پروتئین ها در تغذیه انسان چیست؟

6. چه اسیدهای آمینه ضروری را می شناسید و کدام آمینو اسیدها می توانند ضروری شوند؟

7. محتوای نیتروژن کل در محصولات غذایی چگونه تعیین می شود؟

8- ترکیب اسید آمینه پروتئین ها چگونه تعیین می شود؟

9. چه روش هایی برای تعیین اسیدهای آمینه می شناسید؟

§ 2.4. کربوهیدرات ها

کربوهیدرات ها به طور گسترده در گیاهان و حیوانات وجود دارند، جایی که آنها عملکردهای ساختاری و متابولیکی را انجام می دهند. در گیاهان، در طی فرآیند فتوسنتز، گلوکز از دی اکسید کربن و آب سنتز می شود که سپس به شکل نشاسته ذخیره می شود یا به سلولز، پایه ساختاری گیاهان، تبدیل می شود. حیوانات قادر به سنتز تعدادی کربوهیدرات از چربی ها و پروتئین ها هستند، اما بیشتر کربوهیدرات ها از غذاهای گیاهی به دست می آیند.

سنتز پروتئین بر روی ریبوزوم ها به شکل یک ساختار اولیه، یعنی. در یک مقدار معین و یک توالی معین از اسیدهای آمینه که توسط پیوندهای پپتیدی تشکیل شده توسط گروه‌های کربوکسیل و α-آمینه از بقایای اسید آمینه همسایه به هم متصل شده‌اند. پیوند پپتیدی سفت، کووالانسی و از نظر ژنتیکی تعیین می‌شود. در فرمول‌های ساختاری به صورت یک پیوند منفرد نشان داده می‌شود. : با این حال، در واقع این پیوند بین کربن و نیتروژن دارای ویژگی یک پیوند دوگانه جزئی است:

چرخش به دور آن غیرممکن است و هر چهار اتم در یک صفحه قرار دارند، یعنی. هم صفحه. چرخش سایر پیوندها در اطراف ستون فقرات پلی پپتیدی کاملاً آزاد است.

ساختار اولیه در سال 1898 توسط Danilevsky، استاد دانشگاه کازان کشف شد. در سال 1913، امیل فیشر اولین پپتیدها را سنتز کرد.

این توالی اسیدهای آمینه برای هر پروتئین منحصر به فرد است و از نظر ژنتیکی ثابت است. هنگامی که روند سنتز ساختار پروتئین اولیه روی ریبوزوم مختل می شود، بیماری های ژنتیکی مختلف می توانند ایجاد شوند. به عنوان مثال، هنگامی که دو اسید آمینه در هموگلوبین مختل می شود، کم خونی سلول داسی شکل ایجاد می شود.

برای مطالعه ترکیب اسید آمینه پروتئین ها، از ترکیب (یا یکی از آنها) اسیدی (HCl)، قلیایی (Ba(OH)2) و کمتر هیدرولیز آنزیمی استفاده می شود. مشخص شده است که در جریان هیدرولیز پروتئین خالص که حاوی ناخالصی نیست، 20 اسید آمینه مختلف آزاد می شود. تمام اسیدهای آمینه دیگر کشف شده در بافت حیوانات، گیاهان و میکروارگانیسم ها (بیش از 300) در طبیعت به صورت آزاد یا به صورت پپتیدهای کوتاه یا کمپلکس با سایر مواد آلی وجود دارند.

اسیدهای آمینه α مشتقاتی از اسیدهای کربوکسیلیک هستند که در آنها یک اتم هیدروژن، در کربن α، با یک گروه آمینه (-NH2) جایگزین می شود، به عنوان مثال: باید تأکید کرد که تمام اسیدهای آمینه که پروتئین های طبیعی را می سازند، یک اسیدهای آمینه، اگرچه گروه آمینه در اسیدهای آمینه کربوکسیلیک آزاد را می توان، همانطور که در زیر خواهیم دید، در موقعیت های β، γ، δ، ε قرار داد.

9. ساختار ثانویه پروتئین ها - مارپیچ α و ساختارهای β. ساختار و نقش عملکردی دامنه ها.

ساختار ثانویه آرایش فضایی یک زنجیره پلی پپتیدی به شکل مارپیچ α یا ورقه β، بدون توجه به انواع رادیکال های جانبی و ترکیب آنها است. با پیوندهای هیدروژنی که بین گروه‌های پپتیدی، آمیدی (-N-H) و کربنیدی (-C=O) بسته است، تثبیت می‌شود. در واحد پپتیدی گنجانده شده اند و دی سولفیدی بین باقی مانده های سیستئین پل می شوند

پاولینگ و کوری مدلی از ساختار ثانویه پروتئین را به شکل یک مارپیچ α چپ ارائه کردند که در آن پیوندهای هیدروژنی بین هر اولین و چهارمین اسید آمینه بسته می شود که امکان حفظ ساختار بومی پروتئین را فراهم می کند. ساده ترین عملکردهای آن و محافظت از آن در برابر تخریب. 3.6 باقیمانده اسید آمینه در هر چرخش مارپیچ وجود دارد؛ گام مارپیچ 0.54 نانومتر است. همه گروه های پپتیدی در تشکیل پیوندهای هیدروژنی شرکت می کنند که حداکثر پایداری را تضمین می کند، آب دوستی را کاهش می دهد و آب گریزی مولکول پروتئین را افزایش می دهد. مارپیچ آلفا به طور خود به خود تشکیل می شود و پایدارترین ترکیب است که مربوط به حداقل انرژی آزاد است.

پاولینگ و کوری همچنین ساختار مرتب دیگری را پیشنهاد کردند - صفحه β تا شده. بر خلاف مارپیچ α متراکم، لایه های β تقریباً کاملاً کشیده هستند و می توانند هم موازی و هم ضد موازی باشند.

پل های دی سولفیدی و پیوندهای هیدروژنی نیز در تثبیت این ساختارها شرکت دارند.

ساختار فوق ثانویه سطح بالاتری از سازماندهی یک مولکول پروتئین است که توسط مجموعه ای از ساختارهای ثانویه در تعامل با یکدیگر نشان داده می شود: α-مارپیچ - دو بخش ضد موازی که با سطوح مکمل آبگریز در تعامل هستند (طبق اصل فرورفتگی-برآمدگی) αсα، ابرپیچ. از عناصر α-مارپیچ، (βχβ) در پروتئین های کروی، که توسط دو زنجیره β موازی که توسط یک بخش x به هم متصل شده اند، نشان داده شده است، عناصر βαβαβ، که توسط دو بخش از یک مارپیچ α که بین سه زنجیره β موازی قرار داده شده است، نشان داده شده است.

مراحل زیر را می توان در توضیح ساختار اولیه پروتئین ها و پپتیدها متمایز کرد:

1. جداسازی پروتئین به شکل خالص و تعیین وزن مولکولی آن

2. تعیین ترکیب اسید آمینه

3. تعیین اسید آمینه N ترمینال

4. تعیین اسید آمینه C ترمینال

5. تعیین توالی اسید آمینه

جداسازی پروتئین در شکل خالص آنبه طور معمول، ماده اولیه حاوی بسیاری از پروتئین های مختلف است. در این رابطه، مشکل جداسازی پروتئین مورد نظر به شکل خالص از این مخلوط به وجود می آید. هنگام خالص سازی پروتئین ها از روش هایی استفاده می شود که بر اساس تفاوت های زیر است:

1. بار سطحی پروتئین ها

2. اندازه مولکولی پروتئین ها (بسته به وزن مولکولی آنها)

3. فعالیت بیولوژیکی به دلیل اتصال به بسترها یا بازدارنده ها

جداسازی پروتئین ها بر اساس تفاوت در بار سطحیبار الکتریکی سطح کل پروتئین در یک مقدار pH معین می تواند منفی، خنثی یا مثبت باشد. برای جداسازی پروتئین ها با بارهای مختلف، همانطور که در مورد اسیدهای آمینه وجود داشت، می توان از روش کروماتوگرافی تبادل یونی (به بالا مراجعه کنید) استفاده کرد. غلظت پروتئین در لوله های آزمایش با محلول شستشو با استفاده از یک اسپکتروفتومتر بر اساس شدت جذب نور ماوراء بنفش تعیین می شود و یک وابستگی گرافیکی بر روی حجم مایع خارج شده از ستون کروماتوگرافی ترسیم می شود.

جداسازی پروتئین ها بر اساس وزن مولکولی. اگر مولکول های پروتئین را به شکل توپ هایی با اندازه های مختلف تصور کنید که اندازه آنها به وزن مولکولی آنها بستگی دارد، معلوم می شود که توپ های بزرگتر جرم مولکولی یا اندازه مولکولی بیشتری خواهند داشت. این بدان معنی است که پروتئین ها را می توان مانند ذرات در غربال جدا کرد - غربال مولکولی که توسط یک ژل تشکیل شده است. این روش اغلب نامیده می شود فیلتراسیون ژل یا کروماتوگرافی حذف اندازه. در زیر تصویری از این که چگونه فیلتراسیون ژل می تواند مخلوطی از پروتئین ها با اندازه های مختلف را جدا کند نشان داده شده است (شکل 1.12).

ستون کروماتوگرافی با یک ژل متورم پر شده است. ذرات ژل از مواد پلی ساکارید با پیوند متقابل ساخته شده و حاوی تعداد زیادی ریز منافذ است. اندازه ریز منافذ به گونه ای انتخاب می شود که مولکول های کوچکتر جدا شده به داخل آنها نفوذ کنند، در حالی که مولکول های بزرگتر نمی توانند این کار را انجام دهند. مخلوط پروتئین هایی که قرار است جدا شوند به بالای ستون اعمال می شود و با محلول بافر شسته می شود. مولکول‌های بزرگی که توسط جریان مایع رو به پایین منتقل می‌شوند و قادر به نفوذ به منافذ ذرات ژل نیستند، سریع‌تر حرکت می‌کنند. مولکول های کوچکتر به منافذ نفوذ کرده و در آنجا باقی می مانند. اگر محلول جاری شده از ستون را در قسمت های مساوی در لوله های آزمایش جمع آوری کنید، معلوم می شود که قسمت های قبلی مایع جاری حاوی پروتئین هایی با اندازه های بزرگ و بخش های بعدی حاوی پروتئین هایی با اندازه های کوچکتر است. با انتخاب اندازه منافذ، می توان به جداسازی طیف گسترده ای از مخلوط های پروتئینی دست یافت.

شکل 1.12. تصویر شماتیک جداسازی پروتئین با فیلتراسیون ژل

اگر در نظر بگیریم که اندازه یک مولکول به وزن مولکولی بستگی دارد، معلوم می شود که با جداسازی پروتئین ها با فیلتراسیون ژل، می توان وزن مولکولی آن را همزمان تعیین کرد.

شکل 1.13. نمودار وابستگی وزن مولکولی پروتئین ها به حجم خروجی آنها از ستون کروماتوگرافی در طی فیلتراسیون ژل

حجم مایع خروجی از ستون با لگاریتم وزن مولکولی پروتئین نسبت معکوس دارد. بنابراین، کافی است حجم مایعی را که پروتئین مورد نظر از ستون خارج شده است، بدانیم تا با استفاده از یک نمودار مشابه بتوان وزن مولکولی آن را تعیین کرد (شکل 1.13).

روش دیگری که به شما امکان می دهد پروتئین ها را بسته به وزن مولکولی آنها جدا کنید الکتروفورز ژل(بالا را ببین).

اولتراسانتریفیوژ.اگر ظرفی پر از ماسه و آب را تکان دهید و سپس آن را روی سطح صافی قرار دهید، به دلیل نیروی گرانش، ماسه به سرعت در ته نشست می شود. این در مورد مواد با مولکولی بالا در محلول اتفاق نمی افتد، زیرا حرکت حرارتی (براونی) توزیع یکنواخت آنها را در محلول حفظ می کند. ته نشین شدن ماکرومولکول ها، مانند دانه های شن، تنها در صورتی اتفاق می افتد که تحت شتاب قابل توجهی قرار گیرند.