보렐리아, 웨스턴 블롯 방법에 의한 IgM 클래스 항체(항-보렐리아 IgM, 웨스턴 블롯). 웨스턴 블롯(western blot, protein immunoblot, Western blot) 웨스턴 블롯 실행 오류

블로팅(영어로부터 " 얼룩" - 스팟) - NK, 단백질 및 지질을 고체 기질, 예를 들어 멤브레인 및 고정화로 전달합니다.

블로팅을 위한 분자 분리 방법:

폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동:

등전 포커싱 - 등전점(pI)으로 단백질을 분리합니다.
2차원(2D) 전기영동 - 등전점과 분자량에 따라 단백질을 두 방향으로 분리합니다.
아가로스 겔 전기영동 - NC 분리:

박층 크로마토그래피 - 지질 복합체에서 지질 분리.

전송 방법:

분자의 확산 - 지질에 자주 사용되는 느린 수송;
모세관 블로팅 - 멤브레인을 겔에 대고 누르고 그 위에 여과지 더미를 놓고 이동 버퍼가 겔에 수분을 공급하고 모세관력의 작용으로 상승하여 여과지를 적시고 거대 분자를 겔에서 겔로 옮깁니다. 막; 모세관 블로팅을 수행할 수 있습니다.

진공 블로팅(vacuum blotting) - 모세관 블로팅과 유사하나, 여과지를 적심으로써 생성되는 모세관력 대신에 진공을 사용함으로써 전달이 가속화된다;
전기 블로팅(electroblotting) - 하전된 거대 분자가 막으로 이동하는 것은 전류의 영향으로 발생합니다.
나일론 막에 최종 고정하기 위해 UV 방사선 또는 가열의 작용하에 NK를 막에 "봉제";
도트 블로팅(슬롯 블로팅) - 겔 또는 TLC 플레이트에서 분자를 사전에 분리하지 않고 샘플을 멤브레인에 도트 또는 점선 형태로 직접 적용합니다.

멤브레인 유형:

PVDF 막(폴리비닐리덴 플루오라이드);
NC 막(니트로셀룰로오스);
나일론 막(NDT에 사용).

막에 거대분자를 라벨링하고 검출하는 방법:

염색 - 검출 가능한 거대분자와의 염료 결합(은 이온, 쿠마시, 퐁소, 에티디움 브로마이드);
면역 화학적 라벨링 - 거대 분자의 라벨링은 라벨이 붙은 항체로 인해 발생하며 검출은 다음과 같이 수행됩니다.

방사선 라벨링 - 방사선 라벨(방사성 동위원소)이 거대분자에 도입되며 검출은 다음을 사용하여 수행됩니다.

혼성화 - 상보적인 구조를 가진 표지된 올리고뉴클레오티드에 의한 핵산의 결합, 검출은 일반적으로 표지의 방사선 방출 또는 형광을 기록함으로써 수행됩니다.
질량 분석법 - 지질의 직접적인 구조 분석에 사용됩니다.

블로팅 종류의 허용되는 이름:

서던 블로팅(Southern blotting) - 방법을 제안한 Edwin Southern의 이름으로 - 샘플에서 DNA 서열을 결정하고 게놈 DNA에서 유전자의 복제 수를 결정합니다. 막으로의 이동은 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 샘플을 단편으로 분해하고 아가로스 겔에서 전기영동에 의해 이들을 분별하는 것이 선행됩니다. 막 분석은 공지된 서열의 표지된 올리고뉴클레오티드와의 혼성화에 의해 수행된다;
북부 얼룩- 샘플 내 RNA 서열 결정 및 유전자 발현 연구(mRNA 결정). 서던 블로팅과 유사하지만 샘플에서 분리된 RNA 분자는 엔도뉴클레아제에 의한 절단 없이 검사됩니다. 분자 분리는 포름알데히드가 첨가된 아가로스 겔(RNA 변성용) 또는 요소가 첨가된 폴리아크릴아미드 겔(마이크로RNA 분석에 사용됨)에서 수행됩니다. 멤브레인에 대한 RNA 분자의 고정화는 UV 조사를 사용한 진공 또는 "봉합" 하의 가열로 인해 발생합니다.
웨스턴 블로팅- 단백질 면역블롯팅(protein immunoblotting) - 샘플에서 특정 단백질을 결정하는 데 사용되는 분석 방법입니다. 막으로의 이동은 폴리아크릴아미드 겔에서 단백질의 분리에 의해 선행된다. 막의 단백질 분석은 면역화학적으로 수행됩니다.
파 웨스턴 블로팅- 단백질 블로팅, 웨스턴 블로팅과 유사하지만 단백질-단백질 상호 작용을 결정하는 데 사용되지만 항체 대신 연구 중인 단백질에 특이적으로 결합하는 다른 단백질이 사용됩니다.
남서부 얼룩- DNA 결합 단백질 및 DNA 분자의 단백질 결합 부위 결정 - Western blotting과 유사하지만 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 후 단백질은 요소의 존재 하에 소디움 도데실 설페이트에서 세척되고 확산으로 인해 니트로셀룰로스 막으로 전달됩니다. . 샘플로서, 게놈 DNA의 더 큰 연구 단편의 절단에 의해 수득된 상이한 길이의 표지된 DNA 단편이 사용된다. 결합된 DNA 분자는 각 단백질-DNA 복합체에서 세척되고 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석됩니다.
동부 블로팅- 단백질의 번역 후 변형 결정(지질, 당다당류, 이들과 관련된 인산염 잔기) - 웨스턴 블롯팅과 유사하지만 항체는 단백질이 아닌 지질, 당다당류 등에 사용됩니다. 또한 항체 외에도 연구된 것과 결합하는 다른 단백질 분자(예: 렉틴)가 샘플로 사용됩니다.
극동 블로팅- 고성능 박층 크로마토그래피로 분리된 지질 분석 원칙적으로 막으로의 이동은 확산에 의해 수행됩니다. 정합은 직접 질량 분석 구조 분석에 의해 수행됩니다.

DNA, RNA 또는 단백질이 분리되면 검출 및 젤에서 어려운 다른 작업을 위해 고체 지지체로 옮겨야 합니다. 로 이어지는 이적 과정 분자의 고정화 , 즉. 정지 상태에서의 고정을 호출합니다. 얼룩 (영어로. - 얼룩 ). 나일론 또는 니트로셀룰로스 멤브레인이 기판으로 사용됩니다.

블로팅(영어 blotting에서 - blotting)은 전기 영동 DNA 조각을 단일 가닥 DNA 분자를 결합 (고정화)하는 니트로 셀룰로오스로 만든 특수 필름 (막)으로 옮기는 방법입니다.

서던 블로팅(제안한 저자의 이름으로) 모세관 효과로 인한 DNA 조각의 움직임을 기반으로 합니다. 여과지를 사용하여 아가로스 젤의 DNA 조각을 니트로셀룰로오스 필름으로 옮기는 과정은 블로팅과 유사합니다.

분석은 다음과 같이 수행됩니다.

– 분리, 정제, 변성 및 조각난 DNA를 아가로스 젤 시트에 놓고 조각을 전기영동으로 질량 및 전하로 분리합니다.

– 농축 식염수(완충액)로 적신 여과지 위에 Agarose gel 시트를 놓습니다.

- 그런 다음 단일 가닥 DNA 단편의 고정화(또는 흡착 또는 고정)가 발생하는 젤에 니트로셀룰로오스 필터를 적용합니다.

- 겔을 통해 버퍼 용액의 느린 흐름을 제공하는 필터 위에 마른 여과지 시트 스택을 놓습니다(즉, 일종의 모세관 펌프 역할을 함). 아가로스 젤을 통과하는 식염수는 니트로셀룰로오스에 의해 유지되고 결합되는 DNA 조각을 따라 이동하며 용액은 마른 여과지에 흡수됩니다.

– 다음으로 DNA를 알칼리로 변성시키고 필터를 80 °C의 온도에서 진공 상태로 유지하면 단일 가닥 DNA 조각이 니트로셀룰로오스에 비가역적으로 고정(고정)됩니다. 이 경우 고정된 DNA 밴드의 배열은 겔에서의 위치와 정확히 일치합니다.

– 필터에 결합된 DNA는 라벨이 붙은 DNA 프로브가 있는 용액에 놓이며, 여기서 혼성화가 발생합니다. 그것과 상보적인 DNA 조각만이 X선 필름에서 밝은 줄무늬로 감지될 수 있는 특정 탐침과 혼성화(수소 결합 형성)합니다. 니트로셀룰로오스 필터의 사인

도트 블로팅. 도트 블롯을 준비하기 위해 DNA 또는 RNA 준비가 필터에 직접 적용됩니다. 약물 방울은 필터의 점처럼 보이며 블로 팅 유형의 이름을 설명합니다 (영어 점-점). 1) 초음파로 전처리된 genomic DNA로부터 5~10 염기쌍 길이의 절편이 형성된다.

2) 프로브에서 DNA 또는 RNA 프로브를 사용할 수 있도록 하려면 변성되어야 합니다. 단일 가닥 형태로 변환됩니다. 이것은 100 ° C의 온도의 영향으로 발생합니다.

3) 변성된 핵산은 얼음 위에서 배양됩니다. 온도가 급격히 감소하면 재생성되지 않습니다. 체인의 상호보완적인 쌍. 변성된 DNA 또는 RNA는 프로브가 포함된 용액에서 배양되는 필터에 직접 적용됩니다.

4) 분석된 핵산이 용액에 들어가지 않도록 필터(멤브레인)에 고정시켜야 합니다. 이를 위해 니트로셀룰로오스와 나일론의 두 가지 유형의 필터가 사용됩니다.

핵산을 니트로셀룰로오스 필터에 고정화하기 위해 진공 상태에서 80°C에서 튀기는 방법을 사용하고 나일론 필터에 3~5분 동안 UV 조사를 사용합니다.

5) 핵산 제제를 동위원소 표지 프로브와 함께 배양한 후 특수 카세트에서 자가방사선법을 수행하거나 비방사성 방법으로 동정한다.

도트 블로팅을 사용하면 주어진 샘플에 원하는 뉴클레오티드 서열이 있는지라는 한 가지 질문에만 답할 수 있습니다.

노던 블롯 분석적용:

1) RNA의 분리 및 분석을 위해(예를 들어, 주어진 유전자로부터 판독된 mRNA가 주어진 세포 유형에 존재하는지, 즉 유전자가 발현되는지 여부를 알아내기 위해;

2) 주어진 세포 유형의 발달에서 이 RNA의 양과 그 변화를 결정하기 위해;

3) 일부 유전자의 전사 크기를 결정합니다.

이 경우 세포에서 분리한 RNA 분자를 겔 전기영동을 이용하여 크기별로 분리한 후 필터로 옮긴다. 표지된 단일 가닥 프로브와 혼성화한 후 RNA와 프로브의 혼성화(상동성) 부위를 확인합니다.

원하는 유전자(또는 mRNA)의 염기서열은 모르지만 합성을 조절하는 단백질을 알면 소량의 순수한 단백질을 분리할 수 있고 일부 부분의 아미노산 서열을 결정할 수 있다. 5~6개의 아미노산 잔기에 대한 지식이면 충분합니다.) 유전자 코드 표를 사용하면 주어진 아미노산 서열을 암호화하는 mRNA(또는 유전자 자체)의 해당 부분에서 가능한 모든 뉴클레오티드 서열을 확립할 수 있습니다. 이 경우 프로브를 합성하여 유전자 라이브러리에서 원하는 클론을 검색할 수 있습니다.

웨스턴 블롯틴G(immunoelectroblotting, protein blotting)은 독특한 단백질을 식별하는 방법입니다. 이것은 고도로 특이적인 항원-항체 상호작용 현상에 기반을 두고 있습니다. 따라서 항원(표적)은 결정되는 단백질이고 프로브는 이에 대한 항체입니다.

연구 중인 단백질에 대한 항체는 다양한 방법으로 얻습니다. 가장 간단한 방법은 실험실 동물(일반적으로 토끼)의 혈류에 정제된 단백질 샘플을 도입하는 것입니다. 그의 몸에서는 이 외래 단백질에 대한 항체(면역글로불린)가 생성됩니다. 이들은 표적 단백질과 상호 작용할 1차 항체입니다.

그러나 이러한 항체에 식별용 라벨을 직접 도입하는 것은 합리적이지 않습니다. 서로 다른 단백질을 검출하려면 서로 다른 항체에 라벨을 부착해야 하므로 비용이 많이 듭니다. 보다 합리적인 사용이 가능해졌습니다 범용 항체 – 접합 항면역글로불린, 실제로 식별 가능한 단백질을 항원으로 사용하여 생성된 항체에 대한 항체입니다. 예를 들어, 토끼 Ig에 접합된 항면역글로불린은 다른 항원에 대해 토끼에서 합성된 모든 면역글로불린과 상호작용할 것입니다. 따라서 동위원소 또는 비방사성 표지를 지닌 것은 이러한 보편적인 2차 항체입니다. 여러 반응 과정에서 불용성 유색 화합물이 형성되는 비동위원소 표지 외에도(핵산 블로팅의 경우와 같이) 감도가 더 높은 화학발광 표지가 자주 사용됩니다.

1) 균질액에서 단백질 추출

2) 폴리아크릴아미드 겔(PAAG)에서 SDS-전기영동을 사용하여 분자량에 따른 단백질 분리. SDS 전기영동 방법은 천연 단백질의 변성을 포함합니다. 따라서 동일한 분자량을 가진 단백질 분자는 젤에서 동일한 경로를 거쳐 밴드 형태로 정렬됩니다. 다양한 크기의 단백질 분자가 혼합물에 존재하기 때문에 많은 밴드가 형성됩니다. 전기영동 결과는 단백질 염색(쿠마시 브릴리언트 블루, 아미도 블랙, 실버 염색)으로 시각화할 수 있습니다. 은염색은 고유한 감도를 가지고 있어 결과 밴드에서 단 0.1ng의 단백질만 검출할 수 있습니다. 이것은 젤에 적용되는 단백질의 양을 조절하는 데 매우 중요합니다.

3) 젤에서 막으로 단백질의 이동. 이는 폴리아크릴아미드가 큰 면역글로불린 분자가 단백질로 확산되는 것을 허용하지 않기 때문입니다. 그리고 막에 고정된 단백질은 항체가 사용할 수 있게 됩니다. 핵산 블로팅과 달리 멤브레인으로의 단백질 전달은 전기력, 즉 전기장에서.

4) 생성된 블롯을 단백질 항혈청과 항면역글로불린과 함께 배양합니다. 결과는 사용된 레이블 유형에 따라 렌더링됩니다.

제한:

1) DNA 프로브의 길이를 상당히 초과하고 직접적인 분자 분석을 방지하는 연구된 단편의 큰 크기;

2) 원래 DNA 분자에 상응하는 제한 부위의 존재에 의해 결정되는 연구된 서열의 끝을 임의로 선택할 수 없음;

3) 잘 정제된 다량의 고분자 게놈 DNA(반응당 최소 10μg, 혈액 0.5-1ml에 해당)의 대량 필요,

4) 게놈 혼성화의 경우 - 제한된 시간 동안 작동하는 최소 109 펄스/분 * μg의 높은 비활성을 갖는 방사성 DNA 프로브의 존재 및 특수 장착된 동위원소 장치. 또한 사인을 장시간 노출하면 결과를 얻는 데 걸리는 시간이 크게 늘어납니다.

5) 높은 노동 강도 연구

웨스턴 블롯팅이란 무엇입니까?

복잡한 혼합물 또는 다양한 조직의 추출물에서 단백질 식별은 자주 발생하는 문제 중 하나입니다. 특정 항체와 같은 도구를 사용하면 최소한의 시간과 비용으로 연구 중인 단백질을 결정할 수 있습니다.

Western blotting 방법은 첫 번째 단계에서 SDS(sodium dodecyl sulfate) 존재하에서 단백질 혼합물을 전기영동으로 분리한 후 electroblotting으로 nitrocellulose membrane으로 옮긴다. 이 방법의 본질은 전기 영동 후 겔이 여과지 층 사이의 니트로 셀룰로스 막에 놓여 있다는 사실에 있습니다. 이러한 방식으로 조립된 "샌드위치"는 단백질-SDS 복합체가 겔 플레이트를 가로질러 이동하고 니트로셀룰로스 막 표면에 고정화되도록(비특이적 수착의 결과로) 전기장에 배치됩니다.

단백질-SDS 복합체가 니트로셀룰로스 막에 결합하는 데에는 주로 전기력이 관여하며, 이 상호 작용은 다중점이며 막 표면에 단백질이 "확산"됩니다. 따라서, 전기전이 후, 우리는 폴리아크릴아미드 겔에서와 같은 방식으로 단백질이 배열된 니트로셀룰로스 상의 겔 복제물을 얻는다.

SDS - 전기영동, 젤에서 니트로셀룰로스 막으로의 단백질 전기이동 및 흡착 후, 단백질의 3차 형태가 크게 변경됩니다. . 따라서 연구 중인 단백질의 면역화학적 검출을 위해 일반적으로 단백질 분자의 선형 영역에 특이적인 단클론 또는 다클론 항체만 사용됩니다. 구조적 에피토프(또는 서브유닛 간 접촉을 포함하는 부위)에 특이적인 항체는 일반적으로 웨스턴 블롯 방법에 사용하기에 적합하지 않습니다.

단백질 전달 후 멤브레인은 연구 중인 단백질에 특이적인 항체와 순차적으로 인큐베이션된 다음 효소(또는 다른) 라벨과 결합된 1차 항체의 Fc 단편에 특이적인 2차 항체와 함께 배양됩니다(그림 1A). 연구된 항원에 특이적인 1차 항체가 라벨과 직접 결합되는 경우 2차 항체가 필요하지 않습니다(그림 1B). 연구된 단백질 국소화 부위에서 형성된 면역 복합체는 발색 기질(표지 유형에 따라 다름)의 도움으로 "나타납니다".

방법의 민감도와 특이성은 연구에 사용되는 항체에 따라 크게 달라집니다. 사용된 항체는 연구 중인 단백질에만 특이적인 고유한 아미노산 서열에 특이적이어야 합니다. 그렇지 않으면 여러 단백질 분자와 항체의 상호 작용(특히 거친 단백질 추출물의 경우)이 가능하며, 이는 차례로 멤브레인에 여러 색상의 밴드가 나타날 것입니다. 이 경우 연구 중인 단백질의 식별은 종종 어렵거나 심지어 불가능합니다.

항체를 선택할 때 염두에 두어야 할 두 번째 중요한 요소는 친화도입니다. 사용하는 항체의 친화도가 높을수록 protein bands stain이 더 밝고 선명해지며, 분석법의 민감도가 높아집니다. 고친화성 항체를 사용하면 1ng 이상의 감도를 얻을 수 있습니다.

막 결합 항원과 항체의 상호작용 결과를 가시화하기 위해 특정 조건에서 특정 신호를 줄 수 있는 물질이 결합된 2차 항체를 사용합니다. 일반적으로 효소(peroxidase 또는 phosphatase)가 이러한 제제로 사용되며, 그 반응 생성물은 색상을 가지며 막에 불용성 침전물의 형태로 침전됩니다. 이 방법에서 형광 라벨을 사용하는 것도 가능합니다.

쌀. 1. 연구된 단백질의 면역화학적 염색 방식: A - 효소 표지와 접합된 2차 항체 사용; B - 1차 항체는 효소 라벨과 직접 접합됩니다.

규약:

I. 겔 및 막 제조 및 단백질 전기전이

전기영동 후 폴리아크릴아마이드 겔을 블로팅 완충액(25mM Tris, pH 8.3, 192mM 글리신, 10% 에탄올)이 담긴 수조에 넣었다. 블로팅 카세트 모양으로 절단하고 블로팅 버퍼로 적신 두 장의 여과지를 카세트의 양극을 향할 부분에 놓습니다. 그런 다음 동일한 버퍼로 미리 적신 니트로셀룰로스 막을 여과지 위에 놓고 막과 종이 사이에 기포가 없는지 확인합니다. 그 후 겔을 멤브레인 위에 조심스럽게 놓고 겔과 멤브레인 사이에 기포가 없는지 다시 한 번 특별한 주의를 기울여야 합니다. 샌드위치는 젤 표면에 놓인 젖은 여과지 두 겹으로 완성됩니다(그림 2). 생성된 샌드위치는 카세트에 고정되고 멤브레인이 양극을 향하도록 전극 사이에 배치됩니다.

쌀. 2. 단백질을 막으로 전기 전달하는 방식.

II. 전기 이동

니트로셀룰로스 막으로의 단백질 전기이동은 25mM Tris, pH 8.3, 192mM 글리신, 10% 에탄올을 포함하는 완충액에서 100V의 정전압에서 30-50분 동안 수행됩니다. 전기이동 시간은 크기에 따라 다릅니다. 전달된 단백질, 단백질이 클수록 전달 시간이 더 오래 걸립니다. 1% 아세트산에 0.3% Ponceau S로 니트로셀룰로스 막을 염색하여 전기 수송의 품질과 단백질 밴드의 배열을 평가했습니다. 면역염색 전에 멤브레인을 약알칼리성 Tris 수용액으로 여러 번 세척하여 단백질 결합 염료를 제거해야 합니다.

III. 니트로셀룰로오스 막에 고정된 단백질의 면역화학적 염색

비특이적 항체 결합 부위를 차단하기 위해 PBST에서 30분 동안 실온에서 일정하게 교반하면서 멤브레인을 배양합니다(더 나은 차단을 위해 10% 탈지유 분말을 포함하는 PBST 용액을 사용할 수 있음). 차단 후, 막을 1-10㎍/ml의 특정 항체를 함유하는 PBST에서 일정하게 교반하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 항체의 최적 농도는 경험적으로 선택되며 항체와 항원의 상호 작용 친화도에 따라 달라집니다. 배양이 끝나면 멤브레인을 PBST로 5회 세척하고 양고추냉이 퍼옥시다아제가 결합된 2차 항체 용액으로 옮겼습니다. 접합체의 희석은 일반적으로 제조업체가 포장에 표시하거나 연구원이 경험적으로 선택합니다. 일정하게 저어주면서 1시간 동안 2차 항체 용액에 멤브레인을 배양합니다.

철저한 세척(최소 5-6회 버퍼 변경) 후, PBST 멤브레인을 0.1M Tris-HCl(pH 7.6) 10ml에 3mg 디아미노벤지딘(DAB) 및 10μl의 30% 과산화수소를 함유하는 발색 기질 용액으로 옮깁니다. . 인큐베이션은 5-10분 동안 교반하면서 수행된다. 기질과의 인큐베이션 종료 후 멤브레인은 PBST로 세척하고 여과지로 닦아 건조시킨 후 즉시 컬러 스캔하여 전자 사본을 만들어야 합니다. 막이 완전히 마르면 염색된 단백질 줄무늬가 희미해지고 이미지의 밝기와 명암이 약해집니다.

참고: DAB는 독성이 있으며 잠재적인 발암 물질입니다. 고무장갑만 끼고 작업하세요!

그리고 다른 자연 과학 분야에서.

다른 관련 방법은 항체를 사용하여 면역염색 및 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 통해 조직 및 세포의 단백질을 검출합니다. 엘리사).

Western blotting은 George Stark의 실험실에서 개발되었습니다. 조지 스타크) 스탠포드에서. Western blot이라는 이름은 W. Neil Burnett이 기술에 부여했습니다. W. 닐 버넷) 이전에 Edwin Southern이 개발한 DNA 검출 기술인 Southern blotting이라는 이름의 말장난입니다. RNA를 검출하는 유사한 방법을 Northern blotting이라고 하며 단백질의 번역 후 변형을 검출하는 것을 Eastern blotting이라고 합니다. 동부 블로팅).

샘플 준비

샘플은 전체 조직 또는 세포 배양에서 채취할 수 있습니다. 대부분의 경우 경조직은 먼저 블렌더(대용량 샘플의 경우), 균질화기(소용량) 또는 초음파 처리를 사용하여 기계적으로 분쇄됩니다. 동시에 박테리아, 바이러스 및 기타 환경 요소도 단백질의 공급원입니다.

겔 전기영동

단백질은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하여 분리됩니다. 단백질 분리는 등전점(pI), 분자량, 전하 또는 이러한 매개변수의 조합에 의해 수행될 수 있습니다.

단백질을 분리하는 가장 일반적인 방법은 소디움 도데실 설페이트가 있는 상태에서 폴리아크릴아미드 겔 전기영동입니다. SDS) Laemmli에 따르면. SDS는 단백질의 변성을 유도하여 변성된 상태로 유지하는데 dithiothreitol, mercaptoethanol과 같은 이황화 결합 환원제는 단백질의 2차 및 3차 구조를 파괴하는 데 사용됩니다. 변성된 폴리펩타이드는 전기장에서 아크릴아마이드 겔을 통해 양극으로 이동하며 더 작은 단백질이 더 빠르게 이동하여 분자량에 따라 분리됩니다. 아크릴아마이드의 농도는 젤의 분해능을 결정합니다. 아크릴아마이드의 농도가 높을수록 저분자량 단백질의 분해능이 좋아집니다. 낮은 농도의 아크릴아미드는 고분자량 단백질의 분해능을 향상시킵니다. 2차원 전기영동(2-D)을 사용하는 것도 가능하다. 이 경우 단백질의 분리는 첫 번째 방향의 등전점에 따라 두 번째 방향의 분자량에 따라 두 방향으로 수행됩니다.

젤 위의 샘플을 주머니에 바릅니다. 일반적으로 "트랙" 중 하나는 분자량 마커(알려진 질량을 가진 단백질의 혼합물)용으로 남습니다. 전압이 가해지면 단백질은 전기장에서 다른 속도로 움직입니다. 진행 속도의 차이 - 전기 영동 이동성으로 인해 단백질이 밴드로 분리됩니다(eng. 밴드).

멤브레인으로 전송

단백질을 항체 및 추가 검출에 사용할 수 있도록 하기 위해 젤 스트립과 함께 니트로셀룰로오스 또는 폴리비닐리덴 플루오라이드(eng. PVDF). 겔 위에 멤브레인을 적용하고 그 위에 여과지 더미를 놓습니다. 전체 스택은 단백질을 운반하는 모세관 현상에 의해 종이 위로 이동하는 전송 버퍼에 배치됩니다. 또 다른 단백질 전달 방법은 일렉트로블로팅젤에서 막으로 단백질을 운반하는 전류를 사용합니다. 단백질은 위치를 유지하면서 젤에서 막으로 이동합니다. 이 "습윤"의 결과로 (영어에서. 얼룩) 과정에서 단백질은 검출 막의 얇은 표면층에 유지됩니다. 두 막 변이체는 비특이적 단백질 결합 특성 때문에 사용됩니다. 단백질 결합은 소수성 상호작용과 막과 단백질 사이의 정전기적 상호작용 모두에 기반합니다. 니트로셀룰로스 멤브레인은 PVDF보다 저렴하지만 훨씬 더 부서지기 쉽고 재라벨링에 대한 내성이 적습니다.

Coomassie blue 또는 Ponceau S로 멤브레인을 염색하여 젤에서 멤브레인으로의 단백질 전달의 균일성과 전반적인 효율성을 확인할 수 있습니다. Coomassie는 둘 중 가장 일반적이며 Ponceau S는 더 민감하고 수용성이므로 후속 멤브레인의 세척 및 라벨링이 더 쉬워졌습니다. .

블로킹

단백질에 결합할 수 있는 막이 선택되면 항체와 표적 단백질이 선택되고 나면 막과 표적 단백질을 검출하는 데 사용되는 항체 사이의 상호작용을 피하기 위해 주의를 기울여야 합니다(항체 자체가 단백질이기 때문입니다). 비특이적 결합의 차단은 멤브레인을 Tween 20과 같은 소량의 세제와 함께 일반적으로 소 혈청 알부민(BSA) 또는 탈지 분유(둘 다 저렴함)와 같은 희석된 단백질 용액에 두어 이루어집니다. 묽은 용액은 표적이 단백질을 부착하지 않은 모든 위치에서 멤브레인에 부착됩니다. 따라서 항체가 추가되면 특정 표적 단백질의 결합 부위를 제외하고 항체(항체)가 부착할 수 있는 자유 공간이 멤브레인에 없습니다. 최종 웨스턴 블롯의 이러한 배경 "노이즈"는 깨끗한 결과와 위양성을 제거합니다.

발각

검출 과정에서 멤브레인은 적절한 지지대에 유지되는 리포터 효소에 결합된 변형된 항체로 관심 있는 단백질로 "표지"되어 비색 반응을 일으키고 색상을 제공합니다. 다양한 이유로 탐지는 두 단계로 수행되지만 현재 특정 응용 프로그램에 대해 1단계 탐지 방법을 사용할 수 있습니다.

항체는 숙주의 종류 또는 면역 세포의 배양물을 일부 단백질(또는 그 일부)에 노출시켜 생산됩니다. 일반적으로 이것은 면역 반응의 일부이지만 여기서(분석에서) 수집된 항체는 특정 및 단백질에 직접 결합하는 민감한 검출 도구.

차단 후 희석된 1차 항체 용액(보통 0.5~5μg/ml)을 멤브레인과 함께 배양하고 부드럽게 흔듭니다. 일반적으로 용액은 소량의 세제(때때로 분유 또는 BSA)가 포함된 완충 염 용액으로 구성됩니다. 항체 용액과 멤브레인을 함께 닫고 30분에서 밤새 배양할 수 있습니다. 그들은 또한 서로 다른 온도에서 배양될 수 있으며, 상승된 온도에서는 특이적(표적 단백질의 "signal1") 및 비특이적("잡음") 모두 더 나은 결합이 있습니다.

결합되지 않은 일차 항체를 제거하기 위해 멤브레인을 헹군 후 멤브레인은 일차 항체의 클래스 특정 영역에 직접 결합하는 다른 항체에서 배양됩니다. 이들은 2차 항체로 알려져 있으며 표적 특성에 따라 일반적으로 "항마우스", "항염소" 등으로 불립니다. 항체는 동물 공급원(또는 하이브리도마 배양의 동물 공급원)에서 얻습니다. 항마우스 2차 항체는 대부분의 마우스 유래 1차 항체에 결합합니다. 이렇게 하면 개별 실험실에서 단일 대량 항체 생산 소스를 사용할 수 있으므로 약간의 비용을 절감할 수 있으며 훨씬 더 재현 가능한 결과를 얻을 수 있습니다. 이차 항체는 일반적으로 비오틴이나 알칼리성 포스파타제 또는 고추냉이 퍼옥시다제와 같은 리포터 효소에 결합됩니다. 이는 여러 개의 2차 항체가 하나의 1차 항체에 결합하여 신호를 증폭할 수 있음을 의미합니다.

가장 일반적인 양고추냉이 과산화효소 관련 2차 항체는 화학발광제를 절단하는 데 사용되며 반응 생성물은 단백질 양에 비례하여 발광 방사선을 생성합니다. 감광성 사진 필름 시트를 멤브레인에 대고 반응 방사선을 조사하여 얼룩에 항체 밴드의 이미지를 생성합니다. 1% 과산화수소와 혼합된 4-클로로나프톨 염색을 사용하는 저렴하지만 덜 민감한 접근법; 과산화물 라디칼과 4-클로로나프톨의 반응은 짙은 갈색을 나타내며 특수 사진 필름을 사용하지 않고 기록됩니다.

세 번째 대체 방법은 표지된 단백질 A 단백질과 같은 이차 항체에 결합된 효소 대신 방사성 표지를 사용합니다. 포도상구균요오드의 방사성 동위 원소와 함께. 다른 방법은 더 안전하고 빠르며 저렴하므로 방사능 검출은 거의 사용되지 않습니다.

역사적으로 라벨링 공정은 1차 항체와 2차 항체를 별도의 공정으로 생산하는 것이 상대적으로 용이하기 때문에 두 단계로 진행되었습니다. 이는 연구자와 회사에 유연성 측면에서 큰 이점을 제공하고 탐지 프로세스에 증폭 단계를 추가합니다. 높은 처리량의 단백질 분석과 낮은 검출 임계값의 출현을 감안할 때 프로세스를 더 빠르고 저렴한 비용으로 실행할 수 있는 원스텝 라벨링 시스템 개발에 여전히 관심이 있습니다. 그것은(1단계 시스템) 연구 중인 단백질을 인식하고 동시에 검출을 위한 마커(알려진 "단백질 꼬리"에 가장 접근하기 쉬운 태그)를 운반하는 항체 태그를 필요로 합니다. 먼저 라벨을 1차 항체가 있는 2단계 스타일 멤브레인과 함께 배양한 다음 일련의 세척 후 직접 검출할 준비가 됩니다.

분석

결합되지 않은 라벨을 씻어낸 후 웨스턴 블롯은 표적 단백질에 결합된 프로브를 감지할 준비가 된 것입니다. 실제로 모든 서부 단백질이 막에 하나의 밴드만 있는 단백질을 나타내는 것은 아닙니다. 대략적인 크기는 염색된 밴드를 전기영동으로 추가한 분자량 마커와 비교하여 계산합니다. 이 과정은 실험 간에 변하지 않는 액틴 또는 튜불린과 같은 구조 단백질로 반복됩니다. 표적 단백질의 양은 그룹 간의 제어 구조 단백질의 양에 따라 달라집니다. 이 기술은 오류 또는 불완전한 전달의 경우 멤브레인의 총 단백질 양을 수정합니다.

비색 감지

비색 검출 방법은 리포터 효소(양고추냉이 퍼옥시다제 등)와 반응하는 기질과 웨스턴 블롯의 배양을 기반으로 합니다. 고추냉이 과산화효소), 이차 항체에 "앉아". 용해성 염료는 다른 색의 불용성 형태로 변하여 효소 옆에 침전되어 막을 염색합니다. 반점 성장은 용해성 염료를 씻어내어 제한됩니다. 단백질 수준은 염색 강도 또는 분광 광도계에 의해 농도계로 평가됩니다.

화학발광 검출

화학발광 검출 방법은 2차 항체 리포터와의 상호작용 후 발광하는 기질과 함께 니트로셀룰로스 멤브레인의 배양을 기반으로 합니다. 빛은 웨스턴 블롯을 디지털 방식으로 캡처하는 사진 필름 또는 CCD 카메라로 기록됩니다. 이미지는 염색된 단백질의 상대적인 양을 평가하여 밀도계로 분석되고 광학 밀도 단위로 정량적 결과를 제공합니다. 새 소프트웨어는 적절한 표준이 사용된 경우 분자량 결정과 같은 추가 데이터 분석을 허용합니다.

방사능 검출

방사성 라벨에는 효소 기질이 필요하지 않지만 웨스턴 블롯 앞에 의료용 방사선 사진 필름을 배치할 수 있으므로 필름(필름)이 라벨과 상호 작용하고 연구 중인 단백질 밴드에 해당하는 어두운 영역을 만들 수 있습니다(in 오른쪽 이미지). 방사성 검출 방법에 대한 수요는 높은 비용, 높은 건강 및 안전 위험 및 ECL이 제공하는 대안으로 인해 감소하고 있습니다.

형광 검출

형광 라벨은 빛에 의해 여기되고 더 긴 파장의 빛을 방출하며, 이는 적절한 방출 필터가 장착된 CCD 카메라와 같은 광센서에 의해 감지됩니다. 카메라는 웨스턴 블롯의 디지털 사진을 촬영하여 분자량 분석 및 정량적 웨스턴 블롯 분석과 같은 수집된 데이터를 추가로 분석할 수 있습니다.

콘텐츠

- 소개
- 솔루션
- 샘플 용해
- 샘플 준비
- 전기영동 실시
- PAAG에서 멤브레인으로 단백질 전달
- 멤브레인 착색

소개

웨스턴 블로팅은 폴리아릴아마이드 겔 전기영동으로 분리된 샘플에서 특정 단백질을 결정하는 데 사용되는 분석 방법입니다. 다음으로 젤의 단백질을 니트로셀룰로오스 또는 PVDF 멤브레인으로 옮긴 다음 특정 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 연구된 단백질을 검출하고 2차 항체를 사용하여 개발합니다.

솔루션

용해 버퍼
버퍼 NP-40
150mM NaCl
1.0% NP-40(Tergitol® 유형 NP-40)
50mM 트리스-HCl, pH 8.0
프로테아제 억제제

샘플 버퍼(x5)
10% SDS
5% 2-메르캅토에탄올
50% 글리세린
0.01% 브로모페놀 블루
0.4M 이미다졸

pH를 확인하고 pH 6.8로 조정

분리 버퍼(하단, 분리 젤 버퍼)
400mM 트리스-HCl
0.1% SDS
0.01% 테메드
0.1% 과황산나트륨

이송 버퍼(반건조)
16mM 트리스-HCl
200mM 글리신
0.1% SDS
20% 메탄올

pH를 확인하고 pH 8.3으로 조정

차단할 버퍼
150mM NaCl
10mM Na2HPO4
탈지분유 3~5%

워시 버퍼(PBST)
150mM NaCl
10mM Na2HPO4
0.2% 트윈-20

pH를 확인하고 pH 7.5로 조정

샘플 용해

세포 배양에서 용해물의 준비

1. 세포 용기를 얼음 위에 놓고 냉각된 PBS로 세포를 헹굽니다.

2. PBS 용액을 완전히 제거한 다음 냉각된 용해 완충액을 추가합니다(10ml당 1ml). 7셀/150cm 2 ; 5x10 6 세포/75 cm 2 당 0.5 ml).

3. 플라스틱에서 세포를 분리한 다음 조심스럽게 세포 현탁액을 냉각된 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

4. +4℃에서 30분 동안 일정하게 교반하면서 튜브를 현탁액과 함께 인큐베이션합니다.

5. 현탁액을 +4℃에서 원심분리한다. 권장 표준 속도는 20분 동안 12,000rpm이지만 이러한 매개변수는 특정 실험 및 셀 유형에 대해 결정해야 합니다.

6. 생성된 상등액을 수집합니다.

조직 용해물의 준비

1. 깨끗한 기구를 사용하여 검사할 조직의 일부를 분리합니다.

2. 조직을 원심분리기 튜브에 넣습니다. 냉각 용해 완충액(0.3ml/5mg 조직)을 튜브에 추가합니다. 균질화기를 사용하여 샘플을 연마합니다. 0.2ml 냉각 용해 완충액으로 균질기 블레이드를 헹굽니다. 샘플에 세척액을 추가합니다. 과도한 샘플 희석을 피하십시오. 로딩 시 최소 농도는 0.1mg/ml입니다. 최적 범위 - 1-5 mg/ml

3. +4℃에서 2시간 동안 일정하게 교반하면서 현탁액과 함께 튜브를 배양합니다.

4. 현탁액을 +4℃에서 20분 동안 12000 rpm으로 원심분리합니다.

5. 결과 뜨는을 수집

샘플 준비

1. 얻은 용해물의 단백질 농도를 결정합니다.

2. 로딩에 필요한 단백질의 양을 결정하고 5X 샘플에 4배 적은 버퍼를 추가합니다.

재구성되고 변성된 샘플을 사용하는 것이 좋습니다.

3. 샘플을 복원 및 변성시키려면 +100℃의 샘플 버퍼에서 5분 동안 끓여야 합니다.

전기 영동 수행

폴리아크릴아미드 젤의 웰에 동일한 양의 샘플과 분자량 마커를 놓습니다. 용해물의 부하는 총 단백질의 20-30 µg이어야 하며 순수 단백질의 부하는 10-100 ng이어야 합니다.
폴리아크릴아미드 젤에서 단백질 전기영동 수행

단백질 크기	% PAAG
10-40kDa	15 - 20 %
40-100kDa	10 - 15 %
100-300kDa	5 - 10 %
> 300kDa	5 %

그라데이션 젤 사용 가능

PAAG에서 막으로의 단백질 전달

전송을 위해 니트로셀룰로오스 또는 PVDF 멤브레인을 사용할 수 있습니다. PVDF 멤브레인을 메탄올에 1분 동안 담가 활성화합니다. Transfer를 수행하기 전에 Transfer Buffer에서 세척합니다. 단백질을 멤브레인으로 옮길 때는 semi-dry 방법을 사용하는 것이 좋습니다. 막을 차단하기 전에 Ponceau S 염색을 이용하여 단백질이 막으로 이동하는 정도를 확인할 수 있다.

그림과 같이 전사막을 준비합니다.

막 염색

1. 멤브레인을 PBS로 헹굽니다.

2. 비특이적 결합 부위를 차단하려면 차단 완충액에서 +4℃에서 밤새 또는 +37℃에서 40분 동안 일정하게 교반하면서 멤브레인을 배양하십시오.

3. 멤브레인을 세척하려면 PBST 용액에서 5분 동안 +37℃에서 계속 저으면서 3회 배양합니다.

4. PBS 용액에서 연구 중인 단백질에 대한 항체와 함께 +37℃에서 40분 동안 계속 저으면서 배양합니다.

5. 멤브레인을 세척하기 위해 PBST 용액에서 5분간 +37℃에서 5분간 계속 저으면서 3회 배양합니다.

6. 계속 저어주면서 +37℃에서 40분 동안 PBS 용액에서 2차 항종 항체(면역접합체)와 멤브레인을 배양합니다.

7. PBST 용액에 5분 동안 +37℃에서 5분간 계속 저으면서 멤브레인을 세척합니다.

8. 양고추냉이 과산화효소와 접합된 결합 항체의 검출을 위해 DAB 기질 용액을 사용하는 것이 좋습니다.