Генетичний аналіз біохімічних особливостей штамів

Yersinia pestis основного та неосновних підвидів

03.02.03 – мікробіологія

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Саратов – 2010 2

Робота виконана у ФГУЗ «Російський науково-дослідний протичумний інститут «Мікроб» Федеральної служби з нагляду у сфері захисту прав споживачів та благополуччя людини»

Наукові керівники:

член-кореспондент РАМН, доктор медичних наук, професор Кутирьов Володимир Вікторович, доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Єрошенко Галина Олександрівна

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Карпуніна Лідія Володимирівна доктор медичних наук Мікшис Наталія Іванівна

Провідна організація: Установа Російської академії медичних наук «Науково-дослідний інститут епідеміології та мікробіології імені почесного академіка Н.Ф. Гамалії РАМН»

Захист відбудеться «_»2010 р._годин на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 208.078.01 із захисту докторських та кандидатських дисертацій при ФГУЗ «Російський науково-дослідний протичумний інститут «Мікроб»» (410005, м. Саратов4, вул. ).

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці ФГУЗ «Російський науково-дослідний протичумний інститут «Мікроб»».

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор біологічних наук, старший науковий співробітник А.А. Слудський

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Класифікації Yersinia pestis, що використовуються до теперішнього часу, враховували лише морфологічні, культуральні, біохімічні та інші фенотипічні ознаки [Безсонова, 1928; Борзенков, 1938; Туманський, 1957; Тимофєєва, 1968; Кутирьов, Проценко, 1998; Devignat, 1951] і були позбавлені недоліків, що з мінливістю цих властивостей. Однак досягнуті останнім часом успіхи в фундаментальній генетиці та молекулярній мікробіології дозволяють перевести розв'язання задач із систематизації збудника чуми на якісно новий рівень, заснований на використанні його молекулярно-генетичних особливостей.

Відповідно до прийнятої в даний час вітчизняної класифікації штами збудника чуми ділять на основний та 4 неосновних (кавказький, алтайський, гісарський та улегейський) підвиду [Тимофєєва, 1985; Кутирьов, Проценко, 1998]. Згідно з поширеною зарубіжною класифікацією штами Y. pestis на підставі відмінностей по ряду біохімічних властивостей (здатність до ферментації гліцерину, редукції нітратів, окиснення аміаку) і за історико-географічним принципом ділять на три біовари: antiqua (античний), medievalis (середньовічний) та orientalis ( східний). За фенотиповими характеристиками штами основного підвиду відповідають трьом біоварам (античному, середньовічному та східному), прийнятим у зарубіжній класифікації. Однак штами Y. pestis, що циркулюють у природних осередках чуми в РФ та ближньому зарубіжжі, залишаються не систематизованими за їх приналежністю до певних біоварів.

За експресією диференційно-значущих біохімічних ознак найактивнішими є штами античного біовара. Вони ферментують гліцерин і мають денітрифікуючу активність. Штами середньовічного біовара Y.

pestis не здатні редукувати нітрати, але ферментують гліцерин та арабіноз.

Штами східного біовару не ферментують гліцерин, але активно редукують нітрати та утилізують арабінозу.

Штами основного підвиду, що циркулюють біля РФ і близького зарубіжжя, зазвичай, високо вірулентні і мають високу епідемічну значимість. Вони не ферментують рамнозу та мелібіозу, не чутливі до пестицину I, мають високий рівень продукції ізоцитраліази. Штами неосновних підвидів ферментують рамнозу та мелібіозу, чутливі до пестицину I, не виявляють ізоцитрат-ліазної активності, вибірково вірулентні для лаборторних тварин, епідемічно малозначущі.

Генетичні причини різної експресії біохімічних ознак, що використовуються при розподілі штамів Y. pestis на біовари та підвиди, залишаються на даний момент вивченими недостатньо. Достовірно встановлено лише те, що причиною відсутності ферментації гліцерину у штамів східного біовара є мутація в гені гліцерол-3-фосфатдегідрогенази (glpD). Показано, що в цьому гені у всіх штамів східного біовара є делеція розміром 93 п.н. . У літературі є лише поодинокі роботи з визначення відмінностей у структурі генів Y. pestis основного та неосновних підвидів, що кодують редукцію нітратів та ферментацію рамнози [Куклева з співавт., 2008;

2009; Anisimov et al., 2004; Zhou та ін., 2004].

Залишаються не встановленими причини гетерогенності штамів чумного мікроба за поживними потребами. Штами з різних природних осередків чуми відрізняються за поживними потребами, що визначаються порушеннями генів проміжного метаболізму, що може бути використане в генетичній схемі диференціації штамів Y. pestis з різних природних осередків чуми.

Виявлення змін у структурі генів, що лежать в основі різної експресії мікробіологічних та біохімічних ознак, послужить надійною основою для створення генетичної схеми класифікації штамів збудника чуми, а також визначення основних напрямів внутрішньовидової еволюції Y. pestis.

Мета роботи. Визначення генетичних основ різної експресії біохімічних ознак, що використовуються для поділу штамів збудника чуми на підвиди та біовари.

Завдання дослідження:

Охарактеризувати використані в роботі штами Y. pestis, виділені в природних осередках чуми в РФ та ближнього зарубіжжя, за біохімічними властивостями (редукція нітратів, продукція ізоцитрат-ліази, ферментація арабінози та мелібіози), що лежить в основі розподілу на підвиди та. Встановити належність штамів, що циркулюють на території Росії та суміжних країн, до певних біоварів.

Вивчити структурно-функціональну організацію генів, що кодують диференціальні ознаки, що використовуються при розподілі на біовари, – редукцію нітратів та ферментацію арабінози.

Виявити зміни в генах Y. pestis, що детермінують ферментацію мелібіози та продукцію ізоцитрат-ліази, що лежать в основі диференціації основного та неосновного підвидів збудника чуми.

Визначити поживні потреби штамів Y. pestis кавказького підвиду та встановити генетичні основи їхньої ауксотрофності.

Оцінити перспективність використання одержаних результатів для створення генетичної схеми внутрішньовидової класифікації штамів Y. pestis та встановлення основних напрямів внутрішньовидової еволюції цього збудника.

Наукова новизнароботи. На підставі даних комплексного мікробіологічного, біохімічного та генетичного аналізу встановлено, що штами збудника чуми, що циркулюють у природних осередках РФ та ближнього зарубіжжя, відносяться до античного та середньовічного біоварів.

Вперше показано, що причиною відсутності нітратредукуючої активності у частини штамів основного підвиду, що циркулюють на території РФ і ближнього зарубіжжя, є наявність заміни одиничного нуклеотиду G T в позиції гена периплазматичної нітратредуктази - napA, що доводить належність цих бік. Відсутність експресії цієї ознаки у штамів алтайського і гісарського підвидів викликано вставкою тімінового нуклеотиду (+Т) в 302 позиції іншого гена - ssuA, яка призводить до зсуву рамки зчитування і порушення структури транспортного білка, що кодується - SsuA, що також бере участь у відновленні нітратів.

Вперше встановлено, що відсутність ферментації арабінози у штамів Y.

pestis алтайського та гісарського підвидів пов'язано з наявністю мутації в регуляторному гені арабінозного оперону – araС, який містить інсерцію гуанінового нуклеотиду (+G) у позиції 773 від початку гена, що призводить до зсуву рамки зчитування та порушення структури регуляторного білка AraC, необхідного для арабінозного оперону.

Вперше встановлена ​​генетична основа різної продукції ізоцитратліази у штамів збудника чуми основного та неосновних підвидів, пов'язана з наявністю вставки двох нуклеотидів (+СС) у регуляторному гені iclR у позиції 269яка призводить до інактивації кодованого ним білка-репресора ацета ізоцитратліази у штамів основного підвиду Штами неосновних підвидів містять інтактний ген iclR і не здатні до конститутивного синтезу ізоцитрат-ліази.

Показано, що відсутність ферментації мелібіози у штамів Y. pestis основного підвиду обумовлена ​​впровадженням інсерційної послідовності IS285 у ген melB, що кодує фермент галактозидпермеазу. У штамів неосновних підвидів вставка IS285 у гені melB відсутня.

Вперше виявлено генетичні основи ауксотрофності штамів кавказького підвиду, пов'язані з впровадженням інсерційних послідовностей IS100 в гени argA та aroF, вставкою 10 п.н. в ген aroG, інсерцією тімінового нуклеотиду в ген thiH та делецією 13 п.н. у гені thiG.

Отримана молекулярна характеристика штамів Y. pestis основного та неосновних підвидів за генами, що кодують біохімічні ознаки, що лежать в основі поділу на підвиди та біовари, створює основу для розробки генетичної схеми внутрішньовидової класифікації збудника чуми.

За результатами роботи оформлені заявки на винахід «Спосіб визначення підвидової приналежності штамів збудника чуми методом секвенування» (№2009116913. Пріоритет від 14.05.2009. Отримано рішення про видачу патенту) .Пріоритет від 11.12.2009).

Практична значимість роботи. За результатами роботи оформлено та затверджено методичні рекомендації «Визначення підвидової приналежності штамів збудника чуми на основі секвенування генів rhaS і araC, що контролюють ферментацію рамнози та арабінози» (затверджені директором РосНІПЧІ «Мікроб». Протокол № 6 від 16 червня штамів Yersinia pestis методом мультилокусмного сіквенс – типування (затверджено директором РосНІПЧІ «Мікроб». Протокол № 1 від 23 лютого 2010 року).

У Державній колекції патогенних бактерій депоновано три штами: Y. pestis КМ 910 алтайського, КМ 596 гісарського та КМ 1861 улегейського підвидів як референс-штами цих підвидів.

Отримані в ході виконання дослідження дані генетичної організації штамів Y. pestis використовуються при читанні лекцій з предмету «Генетика збудника чуми» на курсах спеціалізації та підвищення кваліфікації при РосНІПЧІ «Мікроб».

Положення, що виносяться на захист:

1. Штами збудника чуми основного підвиду, що циркулюють у природних осередках РФ та ближнього зарубіжжя, відносяться до античного та середньовічного біоварів, про що свідчать дані комплексного аналізу мікробіологічних, біохімічних та генетичних властивостей цих штамів.

2. В основі різного прояву біохімічних ознак, що використовуються при розподілі штамів Y. pestis на підвиди та біовари, лежать різні типи мутацій у генах, що кодують ці ознаки. Відсутність здатності до редукції нітратів у штамів основного підвиду середньовічного біовара пов'язана з наявністю нонсенсмутації (G T) у гені napA периплазматичної нітратредуктази, а у штамів алтайського та гісарського підвидів – з інсерцією одиничного нуклеотиду в ген ssu. Відсутність ферментації арабінози у штамів алтайського та гісарського підвидів обумовлена ​​вставкою гуанінового нуклеотиду в послідовність гена araC.

3. Різна біохімічна активність штамів основного і неосновних підвидів збудника чуми по ряду диференціальних ознак викликана редукцією генів, що кодують, у основного підвиду та їх інтактністю у неосновних підвидів.

Відсутність ферментації мелібіози штамами основного підвиду обумовлена ​​впровадженням IS285 у ген melB галактозидпермеази, а конститутивний синтез ізоцитратліази у штамів цього підвиду – вставкою двох нуклеотидів (СС) у послідовність регуляторного гена iclR. Штами неосновних підвидів містять інтактні гени melB та iclR.

4. Причиною багатьох поживних потреб штамів Y. pestis кавказького підвиду є інактивація у них ряду генів біосинтезу амінокислот та вітамінів. Залежність штамів цього підвиду по аргініну викликана інсерцією IS ген argA, по фенілаланіну - вставкою 10 п.н. в ген aroG, за тирозином - впровадженням IS100 в ген aroF, за тіаміном (B1) делецією 13 п.н. - в ген thiG та інсерцією одиничного нуклеотиду в thiH. На основі всього комплексу виявлених мутацій для штамів кавказького та інших підвидів, а також біоварів збудника чуми визначено характерні генотипи, які можуть бути використані при створенні генетичної схеми внутрішньовидової класифікації Y. pestis.

Апробація роботи. Матеріали дисертації представлені та обговорені на ІХ Міждержавній науково-практичній конференції держав-учасниць СНД «Сучасні технології реалізації глобальної стратегії боротьби з інфекційними хворобами на території держав – учасниць співдружності незалежних держав», Волгоград, 2008; VI Міжнародній конференції «Молекулярна діагностика та біобезпека», М., 2009; науково-практичної школиконференції молодих учених та спеціалістів Федеральної служби з нагляду у сфері захисту прав споживачів та благополуччя людини «Сучасні технології забезпечення біологічної безпеки», 25 – 27 травня 2010 р.; на щорічних підсумкових конференціях РосНІПЧІ «Мікроб», Саратов 2008 – 2010 рр.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація представлена ​​на 157 сторінках машинописного тексту, складається із вступу, глави огляду літератури, п'яти розділів власних досліджень, висновків та висновків. Робота ілюстрована 11 таблицями та 34 малюнками. Бібліографічний покажчик містить 203 вітчизняних та зарубіжних джерел.

ОСНОВНЕ ЗМІСТ РОБОТИ

1.3.2569-09 «Організація робіт лабораторій, які використовують методи ампліфікації нуклеїнових кислот під час роботи з матеріалом, що містить мікроорганізми І – ІV груп патогенності». Аналіз отриманих у ПЛР продуктів проводили в 0,8 - 2% агарозному гелі відповідно до керівництва Т. Маніатіс з співавт. . Визначення нуклеотидних послідовностей генів здійснювали на генетичному аналізаторі моделі "CEQ 8000" (Beckman Coulter) методом F. Sanger . Порівняльний аналіз геномів Y. pestis та Y. pseudotuberculosis та метаболічних шляхів біосинтезу факторів росту проводили за допомогою алгоритму BLAST бази даних NCBI GenBank та KEGG Metabolic Pathways. Філогенетичний аналіз штамів виконували на основі програм Mega 4.0, PHYLIP та SplitsTree4 та дистанційно-матричних методів: UPGMA, FITCH, Kitch, Neighbor-Joining, Minimum Evolution.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

При вивченні біохімічних ознак, що застосовуються при розподілі штамів Y. pestis на біовари, - редукції нітратів, ферментації арабінози та гліцерину було встановлено гетерогенність за цими властивостями у штамів основного та неосновних підвидів. Частина штамів основного підвиду, виділених біля РФ і близького зарубіжжя, не редукувала нітрати, що свідчило про їхню приналежність до середньовічного биовару. Штами неосновних підвидів – алтайського, гісарського та улегейського також не редукували нітрати, тоді як кавказькі штами були позитивні за цією ознакою.

За другою диференційною ознакою – ферментації арабінози, всі досліджені в роботі штами Y. pestis основного, кавказького та улегейського підвидів були однорідними та утилізували цей моносахарид. Штами алтайського та гісарського підвидів не ферментували арабінозу, і генетичні основи різної експресії цієї ознаки залишалися не відомими.

Відсутність здатності ферментувати гліцерин (ще одна диференціальна біохімічна ознака) є характерною ознакою штамів біовара orientalis. Однак у РФ та країнах ближнього зарубіжжя не виявлено вогнищ із постійною циркуляцією таких штамів. У літературі є лише окремі повідомлення про виділення на цих територіях поодиноких гліцериннегативних штамів Y. pestis [Сагимбек з співавт., 2003; Онищенко із співавт., 2004].

Характерною генетичною міткою штамів біовара orientalis є делеція розміром 93 п.н. в гені glpD - гліцерол-3-фосфатдегідрогенази.

Нами встановлено, що всі штами Y. pestis з природних осередків чуми РФ і ближнього зарубіжжя не містили в гені glpD характерної для східного біовара делеції розміром 93 п.н., що підтверджує відсутність серед них штамів біовара orientalis (рисунок 1). Такі штами виявлялися лише серед ізолятів, одержаних у країнах далекого зарубіжжя.

Рисунок 1. ПЛР аналіз штамів Y. pestis з праймерами на ген glpD: 1 – 16 – штами основного підвиду з природних осередків чуми РФ та ближнього зарубіжжя; 17 – 19 – штами східного біовара з далекого зарубіжжя; 20 – негативний контроль.

Стрілками вказані розміри ампліфікатів, що утворюються.

Таким чином, вивчені нами штами Y. pestis, виділені на території РФ та ближнього зарубіжжя, за комплексом біохімічних ознак (ферментація гліцерину, редукція нітратів) належать до античного та середньовічного біоварів, що корелює з загальноприйнятою думкою про приуроченість штами цих биоваров , А штамів східного біовара - до осередків щурячого типу, розташованим уздовж океанічних узбереж.

Велику увагу в ході виконання цієї роботи було приділено дослідженню штамів збудника чуми кавказького підвиду, оскільки, на думку ряду дослідників [Бобров, Філіппов, 1997], вони є найдавнішими з штамів збудника чуми, що збереглися, і найбільш близькі до попередника - Y.

pseudotuberculosis. За біохімічними властивостями штами цього підвиду виявилися найактивнішими серед усіх підвидів Y. pestis. Вони мали нітратредукувальну активність, ферментували гліцерин, арабінозу, рамнозу, мелібіозу. Оскільки в літературі були суперечливі дані щодо поживних потреб штамів цього підвиду [Мартіневський, 1969; Апарін, Голубинський, 1989], нами проведено дослідження щодо уточнення поживних потреб штамів кавказького підвиду.

Встановлено, що це вивчені штами кавказького підвиду поводилися досить однаково. У них виявлено потребу в амінокислотах – фенілаланіні, тирозині, аргініні та вітаміні B1 (тіаміні). У штамів зі Східно-Кавказького високогірного вогнища чуми крім потреб у цих факторах зростання також виявлено залежність по лейцину, тоді як штами кавказького підвиду з Ленінаканського, Присеванського, Зангезуро-Карабахського, Приараксинського природних осередків такої залежності не мали.

Оскільки причини ауксотрофності штамів кавказького підвиду за амінокислотами та вітаміном B1 (тіаміну) не відомі, нами надалі було проведено дослідження генетичних основ ауксотрофності штамів цього підвиду.

2. Визначення структурно-функціональної організації генів, що кодують біохімічні ознаки, що використовуються для диференціації біоварів збудника чуми Відсутність здатності редукувати нітрати є характерною ознакою штамів Y. pestis середньовічного біовара, який відрізняє їх від штамів античного та східного біоварів. Штами неосновних підвидів чумного мікроба, що циркулюють у природних вогнищах на території РФ та країн ближнього зарубіжжя, також відрізняються за їхньою денітрифікуючою активністю. Проте генетичні причини різного прояву вони цієї ознаки залишаються не встановленими.

Нами з урахуванням порівняльного комп'ютерного аналізу геномів штамів Y.

pestis та Y. pseudotuberculosis, представлених у базі даних NCBI GenBank, встановлено, що гени, що беруть участь у редукції нітратів об'єднані в nap оперон, який має у них ідентичну структуру і складається з шести генів: napA-F і napP (рисунок 2).

Були досліджені й інші гени, що також беруть участь у відновленні нітратів, – narP і ssuA, що кодують відповідно регуляторний білок NarP та транспортний білок SsuA. нуклеотидних замін у всіх генах цього оперону, але найбільш значущою виявилася заміна нуклеотиду G Т у позиції 613 від початку гена napA – периплазматичної нітратредуктази, яка була виявлена ​​раніше у Y. pestis KIM та інших штамів біовара medievalis. За даними комп'ютерного аналізу з використанням програми MEGA 4.0 встановлено, що ця мутація призводить до зміни триплету GAA ТОВ, який є стоп-кодоном і є причиною передчасної термінації трансляції поліпептидного ланцюга (після 204 амінокислотного залишку) молекули цього ферменту.

Інша значуща для прояву денітрифікуючої активності мутація виявлена ​​нами в хромосомному гені ssuA (розмір гена - 1123 п.н.), який містив вставку тімінового нуклеотиду в 302 позиції штаму 91001 біовара microtus (NCBI GenBank). За даними комп'ютерного аналізу з використанням програми Mega 4.0, ця мутація призводить до зсуву рамки зчитування і порушення структури білка SsuA.

На варіабельні ділянки генів napA і ssuA були сконструйовані праймери, за допомогою яких проводили ампліфікацію фрагментів цих генів ПЛР і, надалі, визначали їх нуклеотидну послідовність. Для виявлення причин різної денітрифікуючої активності у штамів Y. pestis нами було вивчено 90 штамів Y. pestis основного та неосновного підвидів з різних природних вогнищ чуми, а також 10 штамів Y. pseudotuberculosis різного походження. В результаті проведеного аналізу встановлено, що виділені в РФ та ближньому зарубіжжі штами основного підвиду, нездатні редукувати нітрати, мали одиничну нуклеотидну заміну G Т у позиції 613, характерну для штамів біовара medievalis, яка призводить до зміни кодону (GAA ТОВ) та передчасної поліпептидного ланцюга молекули периплазматичної нітратредуктази Наявність характерної нуклеотидної заміни у позиції 613, що є генетичною міткою біовара medievalis, у частини вивчених штамів основного підвиду, поряд з відсутністю у них денітрифікуючої активності є підставою для віднесення їх до середньовічного біовару.

У той же час нами не було виявлено наявність цієї мутації в гені napA у штамів алтайського та гісарського підвидів, також не здатних редукувати нітрати. Було встановлено, що причиною відсутності денітрифікуючої активності цих штамів є інша мутація, викликана вставкою тімінового нуклеотиду в 302 позиції гена ssuA транспортного периплазматичного білка SsuA. Ця мутація виявлена ​​не тільки у штамів алтайського та гісарського підвидів, а й у штаму 91001 біовара microtus, який також не здатний редукувати нітрати.

Іншою важливою біохімічною ознакою, яка використовується для внутрішньовидової диференціації штамів збудника чуми, є ферментація арабінози. Всі штами основного, кавказького та улегейського підвидів здатні утилізувати цей вуглевод, тоді як штами алтайського та гісарського підвидів, а також біовари microtus не здатні його використовувати. Однак генетичні причини відсутності прояву цієї ознаки у штамів алтайського та гісарського підвидів збудника чуми залишаються не встановленими.

Нами на основі порівняльного комп'ютерного аналізу геномів Y. pestis та Y.

pseudotuberculosis (NCBI GenBank) встановлено, що у всіх штамів чумного та псевдотуберкульозного мікробів арабінозний оперон має ідентичну структуру і складається із шести генів. До нього входять п'ять структурних - araA, araB, araH, araF, araG і один регуляторний ген araC (рисунок 3).

Рисунок 3. Структура арабінозного оперону Y. pestis У результаті порівняльного комп'ютерного аналізу генів арабінозного оперону, а також гена araD у штамів Y. pestis та Y. pseudotuberculosis (NCBI GenBank) було встановлено наявність значної мутації в регуляторному гені araC, який містив делецію 112 п.н. (26 - 137) та інсерцію гуаніну у позиції 773 у штаму 91001 біовара microtus, як це раніше було встановлено D. Zhou et al. .

На варіабельні області гена araC були сконструйовані дві пари праймерів, що перекриваються, фланкуючі повну нуклеотидну послідовність цього гена, і в ПЛР отримані його ампліфікати.

Секвенування повної послідовності гена araC, проведене нами у природних штамів Y. pestis і 10 штамів Y. pseudotuberculosis, встановило, що штами тільки алтайського та гісарського підвидів мали мутацію в гені araC, яка була пов'язана зі вставкою гуанінового 73 як штами інших підвидів та штами псевдотуберкульозного мікроба мали інтактну структуру цього гена. Наявності делеції розміром 112 п.н., характерною для штамів біовара microtus, у вивчених штамів Y. pestis, виділених на території РФ та ближнього зарубіжжя, виявлено не було.

Таким чином, нами вперше встановлено, що відсутність здатності утилізувати арабіноз у штамів алтайського та гісарського підвидів пов'язана з інсерцією одиничного нуклеотиду в гені araC.

3. Виявлення змін у генах, що кодують диференціальні ознаки, що використовуються при розподілі збудника чуми на основний та неосновні підвиди Штами збудника чуми неосновних підвидів, також як і штами Y.

pseudotuberculosis мають ферментативну активність щодо дисахариду мелібіози. Здатність утилізувати мелібіозу виявлено і у штамів Y. pestis біовара microtus. На відміну від них усі високовірулентні штами Y. pestis основного підвиду не ферментують мелібіозу. Генетичні причини відсутності в них біохімічної активності залишаються невідомими.

На основі порівняльного комп'ютерного аналізу геномів штамів Y. pestis та Y. pseudotuberculosis, представлених у базі даних NCBI GenBank, нами встановлено, що мелібіозний оперон збудників чуми та псевдотуберкульозу має ідентичну структуру та представлений трьома генами – melA (YP_14 melR (YP_1471) (рисунок 4).

В результаті аналізу структури цих генів було встановлено, що є важливою для прояву досліджуваної властивості мутації в структурному melB, що кодує транспортний білок MelB – галактозидпермеазу. У нуклеотидній послідовності цього гена у штамів основного підвиду – CO92, KIM, Antiqua та Nepal516 (NCBI GenBank), виявлено вставку інсерційної послідовності – IS285 після 73 нуклеотиду. На відміну від них у штаму Y. pestis Pestoides F (кавказький підвид) та у всіх штамів Y. pseudotuberculosis виявлено інтактну структуру гена melB.

На варіабельні області гена melB була сконструйована пара праймерів, що фланкує область впровадження IS285, і ПЛР проведена ампліфікація фрагмента цього гена. У всіх використаних у роботі штамів Y. pestis основного підвиду (51 штам) ампліфікати, отримані за допомогою цієї пари праймерів, мали розмір 1648 п.н., що свідчило про впровадження IS285 (1324 п.н.) у послідовність гена melB у цих штамів і корелювало з відсутністю вони ферментативної активності щодо мелібіози. На відміну від основного підвиду, у штамів неосновних у ПЛР виявляли ампліфікати меншого розміру (325 п.н.), що свідчило про інтактну структуру гена melB та відповідало їх здатності ферментувати цей дисахарид (рисунок 5).

Таким чином, нами встановлено, що причиною відсутності штамів Y. pestis основного підвиду до ферментації мелібіози є порушення структури гена melB, обумовлене вставкою IS285. Штами неосновних підвидів містять інтактний ген MelB.

Для диференціації штамів основного підвиду збудника чуми від штамів неосновних підвидів та псевдотуберкульозного мікроба використовується також здатність перших до конститутивного синтезу ферменту ізоцитрат-ліази.

Рисунок 5. ПЛР-аналіз гена melB у штамів збудника: 1 – 3 – кавказький підвид;

4 – 5 гісарський підвид; 6 - 7 - алтайський підвид; 8 – улегейський підвид; 9 – 17 – основний підвид; 18 – негативний контроль. Зліва представлені маркери молекулярних мас X174/HincII.

Показано, що штами Y. pseudotuberculosis та Y. pestis неосновних підвидів, на відміну від штамів основного підвиду, не здатні до конститутивного синтезу цього ферменту. Однак генетичні причини відмінностей в експресії цієї ознаки у штамів основного та неосновних підвидів на даний момент не відомі.

За даними проведеного нами аналізу геномів збудника чуми та псевдотуберкульозу у штамів, представлених у базі даних NCBI GenBank, встановлено, що структура ацетатного оперону у всіх штамів збудника чуми ідентична і включає три структурні гени – aceA, aceB, aceK, які знаходяться під негативною регуляцією. iclR (рисунок 6).

Рисунок 6. Структура ацетатного оперону у штамів Y. pestis Порівняльний комп'ютерний аналіз генів ацетатного оперону показав наявність значущої для фенотипного прояву мутації, що досліджується, в регуляторному гені iclR (843 п.н.). Встановлено, що штамів Y. pestis CO92, KIM, Antiqua, Nepal516 (основного підвиду) ген iclR інактивований вставкою двох нуклеотидів (+СС) в позиції 269-270 від початку гена, і його розмір становив у цих штамів 845 п.н. Виявлена ​​нами інсерція (+СС) у 269-270 позиції гена iclR призводить до передчасної термінації трансляції поліпептидного ланцюга білка-репресора IclR, що тягне за собою конститутивну експресію генів ацетатного оперону і, як наслідок, високий рівень синтезу ізоцитрат.

На варіабельну область гена iclR була сконструйована пара праймерів, за допомогою якої було вивчено структуру цього гена у 95 природних штамів Y.

pestis основного та неосновних підвидів та у 10 штамів збудника псевдотуберкульозу. Було встановлено, що нуклеотидні послідовності фрагментів гена iclR у всіх штамів Y. pestis кавказького, алтайського, гісарського та улегейського підвидів ідентичні, становлять 370 п.н. та повністю відповідають аналогічній послідовності штамів псевдотуберкульозного мікроба, а також штаму Pestoides F (NCBI GenBank), що свідчить про інтактність секвенованої ділянки гена iclR та корелює з низькою активністю у них ферменту ізоцитрат-ліази. Іншу картину виявлено у штамів основного підвиду збудника чуми. У гені iclR у них виявлено інсерцію – вставку двох нуклеотидів (+СС) у позиції 269 – 270, що призводить до зсуву рамки зчитування регуляторного гена iclR і, як наслідок, до конститутивного синтезу ферменту ізоцитрат-ліази у штамів Y. pestis основного підвиду.

4. Встановлення генетичних основ ауксотрофності штамів Y. pestis кавказького підвиду Як було показано нами вище, всі штами кавказького підвиду потребують свого зростання в амінокислотах: аргініні, тирозині, фенілаланії та вітаміні B1 – тіаміні. Однак генетичні причини ауксотрофності штамів Y. pestis ssp.caucasica досі не вивчалися.

На першому етапі нами було проведено комп'ютерний аналіз шляху біосинтезу аргініну, тирозину, фенілалану та вітаміну B1 (тіаміну) у штамів Y. pestis та Y. pseudotuberculosis, представлених у базі даних KEGG Metabolic Pathways, та визначено ключові ферменти біосинтезу цих факторів гени. За допомогою алгоритму BLAST проведено порівняльний аналіз нуклеотидних послідовностей генів біосинтезу аргініну, тирозину, фенілалану та вітаміну B1 (тіаміну) у штамів Y. pestis та Y. pseudotuberculosis (NCBI GenBank). За результатами комп'ютерного аналізу значущою для прояву залежності по аргініну виявилася мутація, виявлена ​​нами у штаму Pestoides F в структурному гені Nацетилглутаматсинтази - argA, яка була вставкою інсерційної послідовності IS100 після 196 нуклеотиду від початку гена.

У ПЛР-аналізі з використанням пари праймерів, фланкирующих впровадження IS100, було встановлено, що розмір утвореного фрагмента гена argA у всіх використаних у роботі штамів збудника чуми основного, алтайського та улегейського підвидів, а також псевдотуберкульозу становив 215 пн. структура гена. Фрагменти гена argA у штамів Y. pestis кавказького підвиду мали велику молекулярну масу (2143 п.н.), обумовлену наявністю вставки IS100, що призводить до інактивації гена.

Аналіз генів, що беруть участь у біосинтезі ароматичних амінокислот, показав, що ген aroG (1053 п.н.), що кодує ізофермент ДАГФС-(3-дезокси-Dарабіногептулозонат-7-фосфат-синтазу), у штаму Pestoides F інактивований в позиції 820 – 829), що призводить до зсуву рамки зчитування та порушення синтезу фенілаланіну.

При секвенуванні фрагмента aroG у 95 природних штамів основного та неосновних підвидів було встановлено, що у штамів чумного мікроба основного, алтайського, гісарського та улегейського підвидів цей ген має інтактну структуру та кодує функціонально активний білок ДАГФС-. На відміну від них у штамів кавказького підвиду Y. pestis у гені aroG виявлено інсерцію 10 п.н. у позиції 820 - 829, що призводить до зсуву рамки зчитування та порушення структури ферменту.

Наявність цієї мутації у всіх штамів кавказького підвиду корелювало з відсутністю вони здатності синтезувати фенилаланин.

Інший структурний ген - aroF (1071 п.н.), що кодує ізофермент ДАГФСTyr], у штаму Pestoides F інактивований впровадженням інсерційної послідовності IS100 після 888 нуклеотиду від початку гена, що викликає втрату здатності синтезувати тирозин. У ПЛР-аналізі у штамів основного, алтайського, гісарського та улегейського підвидів утворювалися ампліфікати гена aroF розміром 563 п.н., що відповідало інтактній структурі гена. У штамів кавказького підвиду специфічний ампліфікат гена aroF в ПЛР не утворювався, що свідчило про втрату його фрагмента після впровадження інсерційної послідовності IS100 і корелювало з ауксотрофністю по тирозину Структурний аналіз генів метаболічного шляху біосинтезу тіазолсинтазу – thiG та thiH, які інактивовані у штаму Pestoides F делецією 13 п.н.

у позиції 384 – 396 та інсерцією тімінового нуклеотиду (+Т) у позиції 552.

Проведене нами секвенування фрагментів thiG і thiH у природних штамів Y. pestis виявило інтактну структуру цих генів у штамів основного, алтайського, гісарського та улегейського підвидів, що корелювало з їхньою здатністю синтезувати вітамін В1. На відміну від інших підвидів у штамів кавказького підвиду виявлено інсерцію тімінового нуклеотиду в 552 позиції гена thiH і делеція 13 п.н. у позиції 384 – 396 гена thiG, що збігалося з відсутністю вони здатності синтезувати тіамін.

Таким чином, нами вперше визначено генетичні основи ауксотрофності штамів Y. pestis кавказького підвиду. Встановлено, що ауксотрофність по аргініну обумовлена ​​впровадженням IS100 в ген argA, по фенілаланіну - вставкою нуклеотидів в aroG, по тирозину - інсерцією IS100 в aroF, за вітаміном B1 - делецією в 13 п.н в thiG та інсерцією Такі мутації не зустрічаються у штамів Y. pestis інших підвидів (основного, алтайського, гісарського та улегейського) і тому можуть бути використані як характерні генетичні мітки кавказьких штамів.

5. Оцінка перспективності використання отриманих даних для створення генетичної схеми внутрішньовидової класифікації збудника чуми В результаті виконаних досліджень нами були встановлені генетичні основи різної експресії біохімічних ознак, що використовуються при розподілі штамів Y. pestis на підвиди та біовари. Виявлена ​​в ході виконання цієї роботи варіабельність генів napA, ssuА, araC, melB, iclR, argA, aroH, aroF, thiH і thiG, поряд з раніше встановленою варіабельністю гена glpD , а також варіабельністю регуляторного гена rhaS рамноз. 2008] може бути покладена в основу генетичної схеми класифікації штамів збудника чуми на біовари та підвиди. На основі порівняльного аналізу послідовностей цих генів нами визначено характерні генетичні особливості основного (античний, середньовічний, східний біовари) та неосновних підвидів Y. pestis (таблиця). Варіабельність нуклеотидних послідовностей генів, що кодують диференціальні біохімічні ознаки, а також біосинтез різних факторів росту була використана нами для визначення еволюційних зв'язків штамів Y. pestis і побудови філогенетичних дерев за допомогою комп'ютерних програм Mega 4.0, PHYLIP, Splits , зважених середніх квадратів ФітчаМаргуліса, Kitch, Neighbor-Joining.

Таблиця. Генетичні особливості штамів Y. pestis основного та неосновних підвидів з природних осередків РФ та ближнього зарубіжжя.

Основний п/в Як випливає з малюнка 7, застосування вибраних ДНК-мішеней дозволяє повною мірою проводити диференціацію штамів збудників чуми та псевдотуберкульозу, а також внутрішньовидовий розподіл штамів Y. pestis не тільки на біовари та на основний та неосновні підвиди, але й на окремі підвиди цього збудника.

Аналіз філогенетичних даних підтверджує висловлене раніше припущення про те, що найдавнішою гілкою еволюції чумного мікроба є штами кавказького підвиду, що має найбільшу генетичну схожість із попередником – псевдотуберкульозним мікробом (рисунок 8).

Інші неосновні підвиди – алтайський, гісарський та улегейський філогенетично близькі один до одного і становлять ще одну давню гілок еволюції Y. pestis.

Отримані нами дані вказують на те, що штами microtus, які нещодавно китайські дослідники запропонували виділити в окремий біовар, належать до групи штамів алтайського та гісарського підвидів та є їх різновидом.

Малюнок 7. Дендрограми (програма Mega 4,0, методи: A - UPGMA та Б -Neighbor Joining) штамів Y. pestis основного (античного, середньовічного, східного біоварів) та неосновних (кавказького, алтайського, гісарського, улегейського) підвидів, а також штамів Y. pseudotuberculosis.

Рисунок 8. Схема внутрішньовидової еволюції Y. pestis Проведені в цій роботі дослідження складають основу для розробки молекулярної систематики збудника чуми, метою якого є створення повної внутрішньовидової таксономії Y. pestis на основі варіабельності генів диференційно-значимих мікробіологічних та біохімічних ознак чумного мікроба.

ВИСНОВКИ

2. Причиною відсутності експресії диференціальної біохімічної ознаки – редукції нітратів у штамів Y. pestis основного підвиду, виділених у природних вогнищах чуми в Росії та ближнього зарубіжжя, є наявність мутації – заміни одиничного нутратису у гені napA периплазматів - інсерції одиничного нуклеотиду в гені SSUА периплазматичного транспортного білка.

3. Вперше встановлено генетичні основи різної експресії ознак ферментації мелібіози та продукції ізоцитрат-ліази у штамів основного та неосновних підвидів чумного мікроба. Показано, що відсутність здатності штамів основного підвиду ферментувати дисахарид мелібіозу обумовлена ​​інсерцією IS285 у послідовність структурного гена melB, що кодує галактозидпермеазу. Встановлено, що конститутивний синтез ізоцитрат-ліази, характерний для основного підвиду чумного мікроба, обумовлений вставкою двох нуклеотидів (+СС) у позиції 269 – 270 гена-репресора iclR.

4. Причиною арабінозонегативності штамів Y. pestis алтайського та гісарського підвидів є мутація в регуляторному гені арабінозного оперону - araC, яка викликана вставкою одиничного гуанінового нуклеотиду в 773 позиції цього гена.

5. Вперше визначено генетичні основи ауксотрофності штамів Y. pestis кавказького підвиду. Встановлено, що ауксотрофність аргініну обумовлена ​​впровадженням IS100 в ген argA, фенілаланіну - вставкою 10 р.н. в aroG, за тирозином – інсерцією IS100 в aro F, за вітаміном B1 – делецією 13 п.н в thiG та інсерцією тиміну в thiH.

6. Визначено характерні генотипи основного (античного, середньовічного, східного біоварів) та неосновних підвидів збудника чуми, використання яких дозволяє проводити внутрішньовидову диференціацію Y. pestis. Показано перспективність використання отриманих результатів до створення генетичної схеми внутрішньовидової класифікації штамів Y. pestis.

ПЕРЕЛІКРОБОТ, ОПУБЛІКОВАНИХ З МАТЕРІАЛІВ ДИСЕРТАЦІЇ

2. Одиноков Г.М., Єрошенко Г.А., Відяєва Н.А., Краснов Я.М., Гусєва Н.П., Кутирьов В.В. Структурно-функціональний аналіз генів nap оперону у Yersinia pestis різних підвидів // Проблеми особливо небезпечних инф. - 2008. - Вип. 4 (98). - С. 12 - 16.

3. Єрошенко Г.А., Куклева Л.М., Відяєва Н.А., Одиноков Г.М., Шавіна Н.Ю., Кутирьов В.В. Генетичні особливості неосновних підвидів збудника чуми // Сучасні технології у реалізації глобальної стратегії боротьби з інфекційними хворобами біля держав – учасниць співдружності незалежних держав. Матеріали ІХ Міждержавної науково-практичної конференції держав-учасниць СНД. - Волгоград, 2008. - С. 71 - 73.

4. Єрошенко Г.А., Відяєва Н.А., Одиноков Г.М., Куклева Л.М., Краснов Я.М., Гусєва Н.М., Кутирьов В.В. Структурно-функціональний аналіз гена araC у штамів Yersinia pestis різного походження // Молекул. генетика, мікробіол. та вірусол. - 2009. - №3. - С. 36 - 40.

5. Куклева Л.М., Одиноков Г.М., Єрошенко Г.А., Кутирьов В.В. Диференціація штамів Yersinia pestis основного та неосновного підвидів на основі варіабельності генів rhaS та araC // Збірник матеріалів VI Міжнародної конференції «Молекулярна діагностика та біобезпека». М., 2009. - С. 124.

6. Єрошенко Г.А., Одиноков Г.М., Куклева Л.М., Шавіна Н.Ю., Краснов Я.М., Гусєва Н.П., Кутирьов В.В. Варіабельні локуси генів napA, aspA, rhaS, zwf і tcaB як ефективні ДНК-мішені для генотипування штамів Yersinia pestis // Проблеми особливо небезпечних инф. - 2010. - Вип. 2 (104). - С. 57 - 59.

7. Одиноков Г.М., Єрошенко Г.А. Генетичні особливості біохімічної диференціації штамів Yersinia pestis основного та неосновного підвидів // Мат.

наук.- практ. шк.- конф. молодих вчених та спеціалістів Фед. служби з нагляду у сфері захисту прав споживачів та благополуччя людини «Сучасні технології забезпечення біологічної безпеки», 25 – 27 травня 2010 р., С. 289 – 291.

Формат 60 х 84 1/16 Друк лазерний Папір офісний Надруковано на поліграфічному обладнанні ФГУЗ РосНІПЧІ «Мікроб» фізико-математичних наук Саратов 2012 1 Робота виконана у федеральному державному бюджетному освітньому закладі вищої професійної освіти Оренбурзький державний університет. Науковий керівник: Бердинський Віталій Львович...»

«КУЛИКІВСЬКИЙ МАКСИМ СЕРГІЙОВИЧ ДІАТОМОВІ ВОДОРОСЛИ ДЕЯКИХ СФАГНОВИХ БОЛОТ ЄВРОПЕЙСЬКОЇ ЧАСТИНИ РОСІЇ 03.00.05 – Ботаніка Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук Санкт-Петербург І.Д. Папаніна РАН Науковий керівник доктор біологічних наук Генкал Сергій Іванович Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, Тріфонова Ірина Сергіївна, доктор біологічних...»

«СИЛАЧОВ ДЕНИС МИКОЛАЕВИЧ ВИВЧЕННЯ НОВИХ НЕЙРОПРОТЕКТОРІВ НА МОДЕЛІ ФОКАЛЬНОЇ ІШЕМІЇ ГОЛОВНОГО МОЗКУ 03.00.13 – фізіологія Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук. Білозерського МДУ ім. М.В. Ломоносова (завідувач – д.б.н., професор Д.Б.Зоров), на факультеті біоінженерії та біоінформатики МДУ ім. М.В. Ломоносова (декан -...»

« Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук Санкт-Петербург – 2012 2 Робота виконана у Федеральній державній бюджетній установі науки Зоологічний інститут Російської академії наук Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Медведєв Сергій Глібович доктор...»

«ХАЛИЕВА Анна Сергеевна ВЛИЯНИЕ ПОСТОЯННОГО МАГНИТНОГО ПОЛЯ И УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА ПРОЦЕССЫ РОСТА ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ И ФИТОРЕМЕДИАЦИЮ ИМИ ПОЧВ ОТ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Специальность 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пенза – 2013 Работа выполнена в Энгельсском технологічному інституті (філії) ФДБОУ ВПО Саратовський державний технічний університет імені Гагаріна Ю.О. на...»

«Калмыкова Ольга Геннадьевна ЗАКОНОМЕРНОСТИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ БУРТИНСКОЙ СТЕПИ (ГОСЗАПОВЕДНИК ОРЕНБУРГСКИЙ) 03.00.16 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2008 Работа выполнена в лаборатории биогеографии и мониторинга биоразнообразия Института степи Уральского отделения Российской академии наук Научный руководитель : доктор біологічних наук Сафронова Ірина Миколаївна Офіційні...»

«Астаф'єва Оксана Віталіївна ВИКОРИСТАННЯ GLYCYRRHIZA GLABRA L., ACHILLEA MICRANTHA WILLD. І HELICHRYSUM ARENARIUM L. ДЛЯ РОЗРОБКИ БІОПРЕПАРАТІВ З АНТИБАКТЕРІАЛЬНИМИ ВЛАСТИВОСТЯМИ 03.01.06 – біотехнологія (у тому числі біонанотехнології) АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

«ХОАНГ ТХІ МІНЬ НГУЕТ Дослідження процесу одержання продуктів білкової та вуглеводної природи з білої пелюстки сої Спеціальність 03.00.23 – біотехнологія АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата технічних наук Москва 2009 р Робота виконана на кафедрі Д.І. Менделєєва. Науковий керівник: кандидат хімічних наук, доцент Красноштанова Алла Альбертівна Офіційні опоненти: доктор...»

«Новоселів Сергій Володимирович Нові тіолові оксидоредуктази систем тіоредоксину та глутаредоксину. Їх роль у регуляції окислювально-відновного балансу клітини 03.00.04 – біохімія 03.00.03 – молекулярна біологія АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук Пущино, 2008 1 Департамент біохімії, Лінкольн, Небраска, США Офіційні...»

«Виноградова Галина Юріївна ПОЛІЕМБРІОНІЯ У ALLIUM RAMOSUM L. І ALLIUM SCHOENOPRASUM L. (СЕМ. ALLIACEAE) 03.00.05 – Ботаніка Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук Санкт-Петербург 2009 2 наук Ботанічного інституту ім. В.Л. Комарова РАН Науковий керівник, доктор біологічних наук, член-кореспондент РАН Батигіна Т.Б. Офіційні...»

«Волкович Марк Габрієлевич ЖУКИ-ЗЛАТКИ ПІДСІМІЙСТВА POLYCESTINAE (COLEOPTERA, BUPRESTIDAE): МОРФОЛОГІЯ, ФІЛОГЕНІЯ, КЛАСИФІКАЦІЯ 03.02.05 – ентомологія реферат реферат науки Зоологічний інститут Російської академії наук Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,...»

«Торгашина Ирина Геннадьевна ИССЛЕДОВАНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ФЕРМЕНТАТИВНОГО РЕАГЕНТА ДЛЯ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ ТЕСТОВ 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Красноярск - 2007 Работа выполнена на кафедре биофизики Института естественных и гуманитарных наук ФГОУ ВПО Сибирский федеральный университет Научный руководитель: Доктор биологических наук, професор Кратасюк Валентина Олександрівна...»

«МАЙЕР НИКОЛАЙ КОНСТАНТИНОВИЧ ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ПРОРАСТАНИЮ ЗЕРНА НА КОРНЮ У ТРИТИКАЛЕ Специальность: 03.02.07 – генетика, 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2011 Работа выполнена на кафедрі генетики та біотехнології та у науковоосвітньому центрі молекулярної біотехнології Російського державного аграрного...»

«Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Колупаєв Борис Іванович Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, ПУЗАТКІНА ОЛЕНА ОЛЕКСАНДРІВНА, професор Соколина Флюра Мухаметгаліївна; доктор біологічних наук, професор Диганова Роза Яхіївна Провідна організація Нижегородський державний університет ім. Н.І.Лобачевського ВПЛИВ...»

«Смирнова Людмила Олеговна ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ОВСА ПО ФОТОПЕРИОДИЧЕСКОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И СКОРОСПЕЛОСТИ Специальности: 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений, 03.01.05 – физиология и биохимия растений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2011 Диссертационная работа выполнена в отделе генетичних ресурсів вівса, жита, ячменю та відділу фізіології рослин Всеросійського...»

«Безжонова Оксана Володимирівна Комплекси видів кровосисних комарів роду Anopheles (Diptera, Culicidae) Росії та ближнього зарубіжжя Спеціальності 03.02.05 – ентомологія та 03.02.07 - генетика АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття Московського державного університету імені М.В. Ломоносова та в лабораторії порівняльної генетики тварин Установи...»

«РАХИМОВ Ильгизар Ильясович АВИФАУНА СРЕДНЕГО ПОВОЛЖЬЯ В УСЛОВИЯХ АНТРОПОГЕННОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ЕСТЕСТВЕННЫХ ПРИРОДНЫХ ЛАНДШАФТОВ Специальность 03.00.16 - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва - 2002 Работа выполнена на кафедре зоологии и экологии биолого-химического факультета Московского педагогического государственного университета Научный консультант: доктор біологічних наук, професор КонстантиновВ.М....»

«САЛАХОВА ГУЛЬНАРА МИРЗАЛИФОВНА ИЗМЕНЕНИЯ ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ РАСТЕНИЙ И РИЗОСФЕРНОЙ МИКРОБИОТЫ В УСЛОВИЯХ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ И РЕКУЛЬТИВАЦИИ ПОЧВЫ Специальность 03.00.16 - Экология 03.00.12 - Физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа - 2007 Работа выполнена на кафедре біохімії та біотехнології Державної освітньої установи вищої професійної освіти Башкирський...»

Дисертація

Одинокий, Георгій Миколайович

Вчена ступінь:

Кандидат біологічних наук

Місце захисту дисертації:

Код спеціальності ВАК:

03.02.03, 03.02.07

Спеціальність:

Мікробіологія

Кількість сторінок:

ВСТУП

ГЛАВА 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

1.1. Сучасні уявлення про організацію геному 15 збудника чуми

1.2. Схеми внутрішньовидової класифікації Yersinia pestis 28 ВЛАСНІ ДОСЛІДЖЕННЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

2.1. Штами бактерій, використані в роботі, та умови 36 їх культивування

2.2. Методи дослідження денітрифікуючої активності, 46 ферментації гліцерину, арабінози, рамнози, мелібіози, продукції ізоцитраліази у штамів Y. pestis

2.3. Визначення поживних потреб штамів Y. pestis

2.4. Виділення бактеріальної ДНК

2.5. Проведення полімеразної ланцюгової реакції

2.6. Електрофоретичний облік результатів

2.7. Визначення нуклеотидних послідовностей генів

2.8. Проведення філогенетичного аналізу

ГЛАВА 3. АНАЛІЗ МІКРОБІОЛОГІЧНИХ І БІОХІМИ- 51 ЧЕСКИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ШТАМІВ Y. pestis ОСНОВНОГО І НЕОСНОВНИХ ПІДВИДІВ З РІЗНИХ ПРИРОДНИХ

осередки чуми

3.1. Характеристика штамів Y. pestis з різних природних Оча- 51 гів чуми за біохімічними ознаками, що лежать в основі поділу на підвиди та біовари

3.2. Визначення поживних потреб штамів До резНБ кавказ- 56 ського підвиду

ГЛАВА 4. ВИЗНАЧЕННЯ СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНОЇ 60 ОРГАНІЗАЦІЇ ГЕНІВ, КОДИРУЮЧИХ БІОХІМІЧНІ ОЗНАКИ, ВИКОРИСТОВУВАНІ ДЛЯ ДИФЕРЕНЦІАЦІЇ БІОВА

4.1. Визначення структурно-функціональної організації генів пар 60 оперону та інших генів, що кодують редукцію нітратів.

4.2. Порівняльний аналіз варіабельності нуклеотидних 71 послідовностей генів арабінозного оперону у штамів

ГЛАВА 5. ВИЯВЛЕННЯ ЗМІН У ГЕНАХ КОДИРУЮЧИХ 83 ДИФЕРЕНЦІЙНІ ОЗНАКИ, ЩО ВИКОРИСТОВУЮТЬСЯ ПРИ ДІЛЕННІ ЗБУДИТЕЛЯ ЧУМИ НА ОСНОВНІЙ І НЕОСНОВНІ ПОДВИДИ

5.1. Виявлення змін у структурі генів, у штамів збудника 83 чуми основного та неосновних підвидів, що кодують ферментацію мелібіози

5.2 Визначення мутацій у генах біосинтезу ізоцитрат-ліази у штамів У. реяШ

РОЗДІЛ 6. ВСТАНОВЛЕННЯ ГЕНЕТИЧНИХ ОСНОВ АУКСОТ- 99 РОФНОСТІ ШТАМІВ ДО РЕХГМ КАВКАЗСЬКОГО ПІДВИДКУ

6.1. Порівняльний комп'ютерний аналіз варіабельності нуклео- 100 тидних послідовностей генів, що беруть участь у біосинтезі аргініну.

6.2. Виявлення мутацій у генах біосинтезу фенілаланіну, тирозину та 101 вітаміну В1 (тіаміну)

6.3. Дослідження структурно-функціонального стану генів біо-103 синтезу аргініну, фенілаланіну, тирозину та вітаміну В1 (тіаміну) у штамів кавказького підвиду

ГЛАВА 7. ОЦІНКА ПЕРСПЕКТИВНОСТІ ОТРИМАНИХ ДАН- 113 НИХ ДЛЯ СТВОРЕННЯ ГЕНЕТИЧНОЇ СХЕМИ ВНУТРІШНІ ВІДПОВІДАЛЬНИКА ЧУМИ

Введення дисертації (частина автореферату) На тему "Генетичний аналіз біохімічних особливостей штамів Yersinia pestis основного та неосновного підвидів"

Актуальність проблеми

Чума - зоонозна природно-осередкова особливо небезпечна карантина бактеріальна інфекційна хвороба з трансмісивним механізмом передачі збудника [Черкаський, 1996]. Чума представляє реальну загрозу для населення через існування численних природних вогнищ чуми, 42 з яких розташовані в Російській Федерації та ближньому зарубіжжі [Оніщенко та ін, 2004]. Існує небезпека занесення збудника чуми на територію Росії із сусідніх, неблагополучних із цього захворювання країн, а також внаслідок біотерористичних актів. За даними ВООЗ щорічно у світі реєструється понад 2000 випадків захворювання на чуму, багато з яких закінчуються летальним кінцем. Великий спалах легеневої чуми в 2009 р. стався в Хайнань-Тибетському автономному окрузі Китаю, в якому також було зареєстровано низку смертельних випадків. Всі ці факти вимагають розробки нових, заснованих на сучасних технологіях високоефективних методів діагностики збудника чуми, засобів профілактики та лікування, що викликається ним особливо небезпечної хвороби.

Використані до нашого часу класифікації Yersenia pestis враховували лише морфологічні, культуральні, біохімічні та інші фенотипічні властивості, і навіть відмінності у вірулентності штамів збудника [Безсонова, 1928; Берлін A.JL та ін., 1938; Туманський, 1959; Тимофєєва, 1972; Кутирьов з співавт., 1998; Devignat, 1951; Dale et al., 2002; Cobbs et al., 2004; Dennis et al, 2004; Lazarus et al., 2004]. Такі класифікації, безумовно, зробили свій внесок у систематизацію Y. pestis і загалом відбивають реально існуючі філогенетичні зв'язку всередині цього виду. Вони не втратили свого значення і до цього дня і як і раніше широко використовуються, в практичній мікробіології. Однак досягнуті останнім часом успіхи в фундаментальній генетиці і молекулярній мікробіології дозволяють перевести розв'язання завдань із систематизації збудника чуми на якісно новий рівень, заснований на використанні його молекулярно-генетичних особливостей .Переведення існуючої класифікації збудника чуми на генетичну основу дозволить підвищити надійність, достовірність і якість систематизації, а також уникнути властивих класичним схемам недоліків, обумовлених мінливістю фенотипічних властивостей збудника. випадкових змін системами репарації ДНК , і тому схеми генетичної диференціації є більш надійними, відтворюваними і мають більшу роздільну здатність в порівнянні з фенотиповими класифікаціями, що використовуються.

Відповідно до прийнятої нині вітчизняної класифікацією штами збудника чуми ділять на основний і 4 неосновних (кавказький, алтайський, гісарський та улегейський) підвиду [Кутирьов та ін., 1998]. Відповідно до поширеної зарубіжної класифікації штами 7. реяйБ на підставі відмінностей по ряду біохімічних властивостей (здатність до ферментації гліцерину, редукції нітратів, окислення аміаку) і за історико-географічним принципом, ділять на три біовари: апйяіа (античний), тесНеуаНз (Східний). За фенотичними характеристиками штами основного підвиду відповідають трьом біоварам (античному, середньовічному та східному), прийнятим у зарубіжній класифікації. Однак штами збудника чуми, що циркулюють у природних осередках чуми, в. Російської Федерації та ближньому зарубіжжі залишаються не систематизованими за біоварною приналежністю.

За експресією диференційно-значущих біохімічних ознак найактивнішими є штами античного біовара. Вони ферментують гліцерин і мають денітрифікуючу активність. Штами середньовічного біовара У. реяйз не здатні редукувати нітрати, але ферментують гліцерин та арабіноз. Штами східного біовару не ферментують гліцерин, але активно редукують нітрати та утилізують арабінозу.

Генетичні причини різної експресії біохімічних ознак, що використовуються при розподілі штамів Y. pestis на біовари, залишаються на даний момент вивченими недостатньо. У літературі є обмежена кількість публікацій з цього питання. Достовірно встановлено лише те, що причиною відсутності ферментації гліцерину у штамів східного біовара є мутація в гені гліцерол-3-фосфатдегідрогенази (glpD). Показано, що в цьому гені у всіх штамів східного біовара є делеція розміром 93 п.н. . Щодо змін у генах, які детермінують інші біохімічні особливості, що використовуються при диференціації біоварів, є суперечливі дані.

В основі поділу Y. pestis на підвиди відповідно до класифікації, прийнятої в 1985 р. на Всесоюзній нараді з таксономії чумного мікроба, лежить неоднакова біохімічна активність штамів, їх відмінності у вірулентності по відношенню до лабораторних тварин і різна ландшафтно-географічна Кутирьов, Проценко, 1998; Anisimov et al., 2004]. Штами основного підвиду, як правило, високо вірулентні та мають високу епідемічну значимість. Вони не ферментують рамнозу та мелі-біозу, не чутливі до пестицину I, мають високий рівень продукції ізоцитраліази. Штами неосновних підвидів, ферментують рамнозу та мелібіозу, чутливі до пестицину I, не виявляють ізоцитрат-ліазної активності, вибірково вірулентні для лаборторних тварин, епідемічно малозначущі.

Генетичні основи різної біохімічної активності штамів, збудника чуми різних підвидів практично не вивчені. За кордоном це питання мало вивчене у зв'язку з відсутністю в зарубіжних колекціях штамів неосновних підвидів, які поширені, в основному, у природних осередках Російської Федерації та ближнього зарубіжжя. У вітчизняній літературі є лише поодинокі роботи з визначення відмінностей у структурі генів, У. резІя основного та неосновних підвидів; кодують редукцію нітратів та ферментацію рамнози [Єрошенко та ін., 2008; Куклева та ін., 2008, 2009]. Штами збудника чуми основного та неосновних підвидів, що циркулюють у Росії та ближньому зарубіжжі, залишаються не вивченими за структурою генів, що беруть участь у редукції нітратів, ферментації гліцерину, арабінози, мелібіози, ізоцитрат-ліази та інших важливих для класифікації ознак. Не встановлено причину гетерогенності штамів чумного мікроба за поживними потребами. Штами з різних природних осередків чуми мають різні поживні потреби, які визначаються порушеннями генів проміжного метаболізму, що може бути використане в генетичній схемі диференціації штамів ¥. реяйз з різних природних осередків чуми.

Виявлення змін у структурі генів, що лежать в основі різної експресії мікробіологічних та біохімічних ознак, послужить надійною основою для створення генетичної схеми класифікації штамів збудника чуми, а також для визначення основних напрямків внутрішньовидової еволюції У. Рехня.

Мета роботи. Визначення генетичних основ різної експресії біохімічних ознак, що використовуються для поділу штамів збудника чуми на підвиди та біовари.

Завдання дослідження:

1. Охарактеризувати використані в роботі штами Г. резІз, виділені в природних осередках чуми в Російській Федерації та ближнього зарубіжжя, за біохімічними властивостями (редукція нітратів, продукція ізо-цитрат-ліази, ферментація арабінози та мелібіози) і лежачим в основі біовари. Встановити належність штамів, що циркулюють на території Росії та суміжних країн, до певних біоварів.

2. Вивчити структурно-функціональну організацію генів, що кодують диференціальні ознаки, що використовуються при розподілі ^ на біовари, - редукцію нітратів і ферментацію арабінози.

3. Виявити зміни в генах У. реБйБ, що детермінують ферментацію мелібіози та продукцію ізоцитрат-ліази, що лежать в основі диференціації основного та неосновного підвидів збудника чуми.

4. Визначити поживні потреби штамів У. реяНз кавказького підвиду та встановити генетичні основи їх ауксотрофності.

5. Оцінити перспективність використання одержаних результатів для створення генетичної схеми внутрішньовидової класифікації штамів У. реяш та встановлення основних напрямів внутрішньовидової еволюції цього збудника.

Наукова новизна роботи. На підставі даних комплексного мікробіологічного, біохімічного та генетичного аналізу встановлено, що штами збудника чуми, що циркулюють у природних осередках Російської Федерації та ближнього зарубіжжя, відносяться до античного та середньовічного біоварів.

Вперше показано, що причиною відсутності нітратредукуючої активності в частині штамів основного підвиду, що циркулюють на території Російської Федерації та ближнього зарубіжжя, є наявність заміни одиничного нуклеотиду Про на Т у позиції 613 гена периплазматичної ніт-ратредуктази - пар А, що доводить біовару. Відсутність експресії цієї ознаки у штамів алтайського і гісарського підвидів викликано вставкою тімінового нуклеотиду (+Т) в 302 позиції іншого гена - гена яка призводить до зсуву рамки зчитування і порушення структури транспортного білка, що кодується -8 ей А, також бере участь у відновленні нітратів.

Вперше встановлено, що відсутність ферментації арабінози у штамів У. резІя алтайського і гісарського підвидів пов'язана з наявністю мутації в регуляторному гені, арабінозного оперону - агаС, який містить інсер-цію гуанінового нуклеотиду (+в) в позиції 773 від початку гена, зсуву рамки зчитування та порушення структури регуляторного білка АгаС, необхідного для ініціації транскрипції генів арабінозного оперону.

Вперше встановлено генетичну основу різної продукції ізоцитрат-ліази у штамів збудника чуми основного та неосновних підвидів, зв'язкову з наявністю вставки двох нуклеотидів (+СС) у регуляторному гені ШК. у позиції 269-270, яка призводить до інактивації кодованого ним білка-репресора ацетатного оперону 1с1Я і є причиною конститутивного синтезу ферменту ізоцитрат-ліази у штамів основного підвиду. Штами неосновних підвидів містять інтактний ген ЮШ і не здатні до конститутивного синтезу ізоцитраліази.

Показано, що відсутність ферментації мелібіози у штамів 7. резНз основного підвиду обумовлено впровадженням інсерційної послідовності 18255 в генте1В, що кодує фермент галактозидпермеазу. У штамів неосновних підвидів вставка 1Б255 у гені те1В відсутня.

Вперше виявлено генетичні основи ауксотрофності штамів кавказького підвиду, пов'язані з впровадженням інсерційних послідовностей 1$>100 в гени а^А і агор, вставкою 10 п.н. в ген агоО, інсерцією тімінового нуклеотиду в ген й/Яі делецією 13 п.н. у гені гкЮ.

Отримана молекулярна характеристика штамів У. реяш основного і неосновних підвидів за генами, що кодують біохімічні ознаки, що лежать в основі поділу на підвиди та біовари, створює основу для розробки генетичної схеми внутрішньовидової класифікації збудника чуми.

За результатами роботи оформлені заявки на винахід «Спосіб визначення підвидової-приналежності штамів збудника «чуми, методом секвенування» (№ 2009116913. Пріоритет від 14.05.2009. Отримано позитивне рішення про видачу патенту) типування (№2009146094. Пріоритет від 11.12.2009).

Практична значущість роботи. За результатами роботи оформлено та затверджено методичні рекомендації «Визначення підвидової приналежності штамів збудника чуми на основі секвенування генів rhaS і агаС, що контролюють ферментацію рамнози та арабінози» (затверджені директором РосНІПЧІ «Мікроб». Протокол № 6 від 16 червня штамів Yersinia pestis методом мультилокусмного сіквенс – типування (затверджені директором РосНІПЧІ «Мікроб». Протокол №1 від 23 лютого 2010 року).

У Державній колекції патогенних бактерій депоновані три штами: Y. pestis КМ 910 алтайського, КМ 596 гісарського і КМ 1861 улегейського підвидів як референс-штами цих підвидів.

Отримані в ході виконання дослідження дані генетичної організації штамів Y. pestis використовуються при читанні лекцій з предмета « Генетика збудника чуми» на курсах спеціалізації з особливо небезпечних інфекцій при РосНІПЧІ «Мікроб» та курсах підвищення кваліфікації за програмою вдосконалення лікарів за спеціальністю «бактеріологія» при РосНІПЧІ «Мікроб».

Положення, що виносяться на захист:

1. Штами збудника чуми основного підвиду, що циркулюють у природних осередках Російської Федерації та ближнього зарубіжжя, відносяться до античного та середньовічного біоварів, про що свідчать дані комплексного аналізу мікробіологічних, біохімічних та генетичних властивостей цих штамів.

2. В основі різного прояву, біохімічних ознак, що використовуються при розподілі штамів Y. pestis на підвиди та біовари, лежать різні типи мутацій у генах, що кодують ці ознаки. Відсутність здатності до редукції нітратів у штамів основного підвиду середньовічного біовара пов'язана з наявністю нонсенс-мутації (G Т) в гені парА периплазматичної нітратредуктази, а у штамів алтайського і гісарського підвидів - з інсерцією одиничного нуклеотиду S asu. Відсутність ферментації арабінози у штамів алтайського та гісарського підвидів зумовлена ​​вставкою гуанінового нуклеотиду в послідовність гена агаС.

3. Різна біохімічна активність штамів основного та неосновних підвидів збудника чуми по ряду диференціальних ознак викликана редукцією кодують їх генів у основного підвиду та їх інтактністю у неосновних підвидів. Відсутність ферментації мелібіози штамами основного підвиду обумовлена ​​впровадженням IS2S5 в ген melB галактозидпер-меази, а конститутивний синтез ізоцитрат-ліази у штамів цього підвиду - вставкою двох нуклеотидів (СС) у послідовність регуляторного гена iclR. Штами неосновних підвидів містять інтактні гени melB та iclR.

4. Причиною багатьох поживних потреб штамів Y. pestis кавказького підвиду є інактивація у них ряду генів біосинтезу амінокислот та вітамінів. Залежність штамів цього підвиду по аргініну викликана інсерцією 100 ген argA, по фенілаланіну - вставкою 10 п.н. в ген aroG, за тирозином - впровадженням IS100 в ген aroF, за тіаміном (В)) делецією 13 п.н. - в ген thiG та інсерцією одиничного нуклеотиду в thiH. На основі всього комплексу виявлених мутацій для штамів кавказького та інших підвидів, а також біоварів збудника чуми визначено характерні генотипи, які можуть бути використані при створенні генетичної схеми, внутрішньовидової класифікації Y. pestis.

Апробація роботи. Матеріали дисертації представлені та обговорені на IX Міждержавній науково-практичній конференції держав-учасниць СНД «Сучасні технології у реалізації глобальної стратегії боротьби з інфекційними хворобами на території держав – учасниць співдружності незалежних держав», Волгоград, 2008; VI Міжнародній конференції « Молекулярна діагностика та біобезпека», М., 2009; науково-практичної школи-конференції молодих вчених та фахівців Федеральної служби з нагляду у сфері захисту прав споживачів та благополуччя людини Сучасні технології забезпечення біологічної безпеки», 25 – 27 травня 2010 р.; на щорічних підсумкових конференціях РосНІПЧІ «Мікроб», Саратов 2008 – 2010 рр.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 7 друкованих праць, з них 4 у періодичних виданнях з «Переліку провідних наукових журналів, що рецензуються, рекомендованих ВАК Міністерства освіти і науки Росії.». Оформлено два патенти на винаходи. Спосіб підвидової диференціації штамів збудника чуми методом секвенування»(№ 2009116913. Пріоритет від 14.05.2009. Отримано позитивне рішення про видачу патенту) та «Спосіб підвидової диференціації штамів Yersinia pestis методом мультилокусного-сіквенс типування» (№ 2009146092.9.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація представлена ​​на 156 сторінках машинописного тексту, складається із вступу, глави огляду літератури, п'яти розділів власних досліджень, висновків та висновків. Робота ілюстрована 11 таблицями та 34 малюнками. Бібліографічний покажчик містить 203 вітчизняних та зарубіжних джерел.

Висновок дисертації на тему "Мікробіологія", Одиноков, Георгій Миколайович

1. На підставі проведеного комплексного аналізу біохімічних та генетичних властивостей природних штамів У pestis з різних природних вогнищ чуми встановлено, що штами основного підвиду, що циркулюють на території Російської Федерації та ближнього зарубіжжя, відносяться до античного та середньовічного біоварів.

2. Причиною відсутності експресії диференціальної біохімічної ознаки - редукції нітратів у штамів Y. pestis основного підвиду, виділених у природних осередках чуми в Росії та ближнього зарубіжжя, є наявність мутації - заміни одиничного нуклеотиду в гені пара периплазма-там Гіссарський підвид - інсерція одиничного нуклеотиду в гені ssuA периплазматичного транспортного білка.

3. Вперше встановлено генетичні основи різної експресії ознак ферментації мелібіози та продукції ізоцитрат-ліази у штамів основного та неосновних підвидів чумного мікроба. Показано, що відсутність здатності штамів основного підвиду ферментувати дисахарид мелі-біозу обумовлена ​​інсерцією IS2&5 у послідовність структурного гена melB, що кодує галактозидпермеазу. Встановлено, що конститутивний синтез ізоцитрат-ліази, характерний для основного підвиду чумного мікро1 ба, обумовлений вставкою двох нуклеотидів (+СС) у позиції 269 - 270 гена-репресора iclR.

4. Причиною арабінозонегативності штамів У pestis алтайського та гісарського підвидів є мутація в регуляторному гені арабінозного оперону - агаС, яка викликана вставкою одиничного гуанінового нуклеотиду в 773 позиції цього гена.

5. Вперше визначено генетичні основи ауксотрофності штамів У. pestis кавказького підвиду. Встановлено, що ауксотрофність аргініну обумовлена ​​впровадженням IS 100 в ген argA, фенілаланіну - вставкою 10 р.н. в aroG, по тирозину - інсерцією IS 100 в aro F, за вітаміном Bi - делецією 13 п.н в thiG та інсерцією тиміну в thiH.

6. Визначено характерні генотипи основного (античного, середньовічного, східного біоварів) та неосновних підвидів збудника чуми, використання яких дозволяє проводити внутрішньовидову диференціацію Y. pestis. Показано перспективність використання отриманих результатів до створення генетичної схеми внутрішньовидової класифікації штамів Y. pestis.

ВИСНОВОК

Протягом більш ніж столітньої історії вивчення збудника чуми після його відкриття у 1894 р. А. Єрсеном та С. Кітазато неодноразово пропонувалися різноманітні схеми класифікації Y. pestis, які були засновані на різному прояві мікробіологічних, біохімічних та інших фенотипічних властивостей. Запропоновані класифікації, безумовно, відповідали тому рівню знань та методичних підходів, які мали дослідники. Так було в 1928 р. A.A. Безсонової всі штами Y.pestis були розділені за здатністю ферментувати гліцерин на дві групи: гліцеринонегативні та гліцеринопозитивні. У 1938 р. А.Л. Берлін та А.К. Борзенков розділили штами збудника чуми на океанічну та континентальну раси. R. Devignat в 1951 на підставі ряду біохімічних властивостей (різної здатності до денітрифікації та ферментації гліцерину) та особливостей ландшафтно-географічного походження запропонував розподіл штамів Y. pestis на три групи, які в даний час позначають як біовари чумного мікроба: античний, середньовічний та східний. У 1985 р. на Всесоюзній нараді з таксономії чумного мікроба було прийнято єдину систематичну схему підвидових категорій для збудника чуми, засновану на фенотипічних властивостях, вірулентності по відношенню до лабораторних тварин, ареалі поширення. Штами чумного мікроба, що циркулюють на території країн СНД та Монголії, були поділені на п'ять підвидів: основний, кавказький, алтайський, гісарський, улегейський (Тимофєєва 1972; Кутирьов, Проценко, 1985).

Всі запропоновані схеми були, безумовно, корисні для дослідників і зробили свій внесок у систематизацію Y. pestis, а багато з них (розподіл на підвиди та біовари) широко використовуються і в даний час. Однак бурхливий розвиток сучасних технологій молекулярної біології, секвенування повних геномів патогенних ієрсиній дозволяє вирішувати завдання з удосконалення внутрішньовидової класифікації збудника чуми на сучасному молекулярно-генетичному рівні, заснованому на порівняльній геноміці штамів збудника чуми. Переведення існуючих диференціальних схем класифікації цього збудника на генетичний рівень підвищить їх роздільну здатність, ефективність та надійність, а також покращить якість систематизації видів Y. pestis.

Генетичні основи різної біохімічної активності штамів збудника чуми різних підвидів залишаються практично не дослідженими. Визначено лише окремі генетичні дефекти у генах, що використовуються для внутрішньовидового поділу Y. pestis. Так, показано, що у штамів основного підвиду середньовічного біовара відсутність здатності редукувати нітрати пов'язана з наявністю мутації в структурному гені пар Л пери-плазматичної нітратредуктази, необхідної для прояву цієї властивості, а нездатність штамів східного біовару (гліцериннегатині штами) обумовлена ​​делецією в гені glpD гліцерол-3-фосфатдегідрогенази. Отримано дані про те, що причиною рамнозонегативності всіх вивчених штамів основного підвиду є наявність несинонімічної заміни одиничного нуклеотиду в регуляторному гені rhaS рамнозного оперону [Куклева та ін, 2008; 2009]. Що стосується інших генів, детерминирующих значні біохімічні ознаки, є або досить суперечлива інформація , або дані просто відсутні. Практично не досліджено за генами диференціально-значущих біохімічних ознак штами Y. pestis основного та неосновних підвидів, що персистують у природних осередках Російської Федерації та ближнього зарубіжжя. Вивчення генетичної організації штамів різних підвидів, що знаходяться на різних щаблях еволюції Y. pestis, є важливим завданням, оскільки дозволить визначити ті еволюційні перетворення геному збудника, які призвели до становлення високовірулентної бактерії Y. pestis.

Для встановлення генетичних основ різної експресії біохімічних ознак, що використовуються при розподілі штамів збудника чуми на підвиди та біовари, нами були використані як традиційні мікробіологічні та біохімічні методи, так і сучасні методи молекулярної біології - полімеразна ланцюгова реакція, секвенування, а тауке методи. Були застосовані ресурси мережі Інтернет – бази даних NGBI GenBank, KEGG Metabolic Pathways, PF AM, Modeller та використані комп'ютерні програми: Mega 4.0 та PHYLIP з дистанційно-матричними методами.

Для встановлення генетичних основ різної експресії біохімічних ознак, що використовуються для розподілу штамів збудника чуми на підвиди та біовари, використовували загальний алгоритм проведення аналізу. На першому етапі вивчали експресію мікробіологічної або біохімічної ознаки, що досліджується, у природних штамів Y. pestis. Було вивчено експресію диференціально-значущих ознак (редукції нітратів, ферментації арабінози, мелібіози, продукції ізоцитрат-ліази) у великої кількості (близько ста) штамів Y. pestis з різних природних вогнищ чуми.

Одночасно за допомогою комп'ютерного аналізу штамів Y. pestis KIM (середньовічний біовар), С092 (східний біовар), Antiqua, Angola, Ne-ра1516 (античний біовар), 91001 (біовар microtus), Pestoides F (кавказький підвид) та Y. pseudotu /+, IP32953, IP31758, YPIII, повні нук-леотиди геномів яких представлені в базі даних NCBI GenBank виявляли варіабельні ділянки генів, продукти яких відповідно до баз даних KEGG Metabolic Pathways і PF AM беруть участь в експресії даної ознаки. На варіабельні ділянки генів, які, ймовірно, були причиною відсутності фенотипного прояву ознаки, конструювали праймери, за допомогою яких ампліфікували в ПЛР варіабельні фрагменти генів у різних природних штамів, збудника чуми. На основі порівняння нуклеотидних послідовностей генів у штамів, що відрізняються за експресією досліджуваної ознаки, виявляли мутації, які спричинили відсутність цієї ознаки.

З використанням цього алгоритму нами проведено вивчення структурно-функціональної організації генів, продукти яких беруть участь у прояві диференціальних ознак, що лежать в основі поділу «штамів Y. pestis на біовари, - редукції нітратів і ферментації арабінози. Виконано порівняльний комп'ютерний аналіз генів пар оперону, а також генів пагР і ssuA - регуляторного (NarP) і транспортного (SsuA) білків, що беруть участь у відновленні нітратів, у штамів, представлених у базі даних NCBI GenBank, а також у великої кількості (близько ста) природних штамів Y. pestis основного і неосновних підвидів, виділених у різних природних осередках чуми в Російській Федерації, ближньому та далекому зарубіжжі.

Встановлено, що причиною відсутності денітрифікуючої здатності частини штамів основного підвиду є наявність одиничної нуклеотидної заміни G на Т в 613 позиції гена пар А, що кодує білок - периплазматическую нітратредуктазу. Причина нездатності відновлювати нітрати штамами алтайського та гісарського підвидів інша і пов'язана з наявністю мутації в гені транспортного білка - ssuA, який цих штамів у позиції 302 містить інсерцію одиничного нуклеотиду (+Т). Отримані дані, поряд з біохімічними характеристиками штамів (здатності до редукції нітратів, ферментації арабінози та гліцерину), дозволили зробити висновок про те, що на території Російської Федерації та близького зарубіжжя циркулюють штами античного та середньовічного біоварів, у той час як штами східного біовара серед штамів із далекого зарубіжжя.

Очевидно, причиною відсутності нітратредукуючої активності у штамів біовара microtus є та ж мутація, що і у штамів алтайського і гісарського підвиду - інсерція одиничного нуклеотиду в гені ssu. Нами встановлено, що мутація у гені парА - вставка одиничного в позиції 1021 гена пар А не може бути причиною відсутності експресії ознаки у штамів microtus [як це припущено D. Zhou et al., 2004], оскільки вона виявлена ​​нами і у штамів кавказького підвиду , а також у штамів 7 pseudotuberculosis, які редукують нітрати. "

Вперше у великої кількості природних штамів, збудника чуми проведено структурно-функціональний аналіз генів арабінозного оперону, та визначено повну нуклеотидну послідовність регуляторного гена агаС, що бере участь у регуляції експресії ферментації арабінози. Встановлено, що причиною відсутності цієї ознаки у алтайського та гісарського підвидів є наявність вставки одиничного нуклеотиду в гені агаС у позиції 773 від початку гена. Штами основного, кавказького та улегейського підвидів не містять такої мутації, що корелює з їхньою здатністю ферментувати арабінозу.

Проведено дослідження структури генів, що кодують ферментацію мелібіози та продукції ізоцитрат-ліази, які використовуються при розподілі штамів Y. pestis на основний та неосновний підвид. Раніше генетична детермінованість різного прояву цих властивостей у штамів основного та неосновних підвидів не досліджувалася. Дані з цього питання у літературі відсутні.

Проведений порівняльний комп'ютерний аналіз нуклеотидної послідовності генів ферментації мелібіози (melA, melB і melR) у штамів Y. pestis і 7. pseudotuberculosis, представлених у базі даних NCBI GenBank, показав наявність в гені melB (1232 п.н.), детермінірующем вставки інсерційної послідовності IS2&5 (1322 п.н.) після 73 п.н. у штамів збудника4 чуми С092, KIM, Antiqua, Nepal516. В інших штамів 7 pestis Angola, 91001, Pestoides F та у всіх штамів 7 pseudotuberculosis виявлена ​​інтактна структура гена melB. У ПЛР аналізі за допомогою розрахованих праймерів, що фланкують область застосування IS2SJ, у великої кількості природних штамів збудника чуми отримані специфічні фрагменти гена melB. У вивчених штамів 7 pestis неосновних підвидів – кавказького, алтайського, гісарського та улегейського, у ПЛР утворювалися ампліфікати розміром 325 п.н., що відповідало інтактній структурі гена melB. На відміну від них у штамів основного підвиду фрагменти мали більший розмір 1648 п.н., що свідчило про впровадження інсерційної послідовності в цей ген і корелювало з відсутністю ферментативної активності щодо ме-лібіози. Таким чином, нами вперше встановлено генетичну причину; різної експресії диференціальної ознаки - ферментації мелі-біози у штамів збудника чуми основного та неосновних підвидів, яка пов'язана з порушенням структури гена melB у штамів основного підвиду за рахунок впровадження інсерційної послідовності IS2&5.

Для диференціації штамів Y. pestis основного підвиду від неосновних та збудника псевдотуберкульозу використовується їх здатність до конститутивного синтезу ферменту ізоцитрат-ліази. Порівняльний комп'ютерний аналіз нуклеотидних послідовностей генів ацетатного оперону (асеА, асеВ, асеК, iclR) у штамів Г. pestis і Y. pseudotuberculosis, представлених у базі даних NCBI GenBank, показав наявність в iclR (розмір гена 843 п.н.) у ставки (+СС) у позиції 269-270 від початку гена у штамів Y. pestis С092, KIM, Antiqua, Nepal516. На відміну від них у інших штамів чумного мікроба Angola, 91001, Pestoides F і у всіх псевдотуберкульозних штамів виявлена ​​інтактна структура гена iclR. Секвенування варіабельної області гена iclR, проведене нами у природних штамів Y. pestis, виявило наявність у штамів основного підвиду Y. pestis однакової мутації - інсерції двох нуклеотидів (+СС) в позиції 269 - 270., на відміну від неосновних підвидів структура цього гена Виявлена ​​мутація призводить до інактивації гена та порушення структури (і функції) білка-репресора ацетатного оперону IclR, пов'язаного із втратою з С-термінального кінця домену (148 - 271 а.о.), який пов'язує молекулу індуктора. Це призводить до конститутивної експресії генів ацетатного оперону та корелює з високою активністю у штамів основного підвиду Y. pestis ферменту ізоцитрат-ліази.

Раніше висловлювалися припущення про те, що найдавнішими штамами чумного мікроба є штами кавказького підвиду [Бобров, Філіпов, 1997; Куклева та ін., 2002]. Їх вивчення становить значний інтерес, оскільки дозволяє визначити ті етапи еволюційних змін геному, які призвели до перетворення сапрофітної ентеропато-генної бактерії - псевдотуберкульозного мікроба на високовірулентний системний патоген із принципово іншим механізмом передачі збудника. Отримані нами результати вказують на те, що кавказький підвид найбільш активний за диференціальними біохімічними ознаками та містить інтактні гени (парА, ssuA, glpD, araC, melB, iclR), як і збудник псевдотуберкульозу. Це підтверджує велику близькість кавказького підвиду до попередника – Y. pseudotuberculosis у порівнянні з іншими підвидами Y. pestis.

Ми також провели мікробіологічні дослідження з вивчення поживних потреб штамів Y. pestis кавказького підвиду, оскільки в літературі були суперечливі відомості з цього питання. Встановлено, що це вивчені штами кавказького підвиду поводилися одноманітно. У них виявлено потребу у двох ароматичних амінокислотах – фенілаланіні та тирозині, а також в амінокислоті аргініні та вітаміні Bi (тіаміні). У штамів зі Східно-Кавказького високогірного вогнища чуми крім потреб в аргініні, фенілаланіні, тирозині, і вітаміні В1 виявлена ​​також залежність по лейцину, у той час як штами кавказького підвиду з Ленінаканського, Присеванського, Зангезуро-Карабах Не мали.

Для встановлення генетичних основ ауксотрофності штамів кавказького підвиду за допомогою баз даних KEGG та PFAM було проведено аналіз метаболічних шляхів та визначення ферментативних систем, що беруть участь у біосинтезі ароматичних амінокислот - фенілаланіну, тирозину, амінокислоти аргініну та вітаміну B. У генах біосинтезу аргініну (argA), фенілаланіну (aroG), тирозину (aroF), та вітаміну Bl(thiH, thiG) у штамів кавказького підвиду виявлено значні мутації. У структурному гені а^А виявлено вставку інсерційної послідовності \S100 по-* ледве 196 п.н., що є причиною ауксотрофності кавказького підвиду по аргініну. У гені аго

Таким чином, нами вперше встановлено генетичні засади ауксотрофності штамів кавказького підвиду. Отримана генетична характеристика штамів кавказького підвиду за генами диференціальних біохімічних ознак ((ггарА, вви, glpD, агаС, те1В, юШ) та за генами біосинтезу факторів росту (а^А, агоС, агор, ¿/г/С та ШН) свідчить про найбільшої давнини цього підвиду, а також тривалому періоді його еволюції, незалежної від інших підвидів У. ре, М'я.

На основі проведеного розгорнутого молекулярно-генетичного аналізу природних штамів У. резИБ з різних осередків чуми також визначено генетичні особливості штамів інших підвидів, що циркулюють на території Росії, ближнього та далекого зарубіжжя. Застосування виявлених генетичних мутацій в генах парА, агаС, glpD, теШ, ШЯ дозволяє з високою ефективністю і надійністю визначати належність штамів У. реБІЗ до основного або неосновних підвидів, а штамів основного підвиду до одного з трьох біоварів - античному, середньовічному. Виявлено характерні генотипи кожної з цих таксономічних одиниць-виду Y. pestis.

Встановлена ​​в ході виконання цієї роботи варіабельність генів пар A, ssu, araC, melB, iclR, argA, aroH, aog F, thiH і thiG, поряд з раніше виявленою варіабельністю гена glpD була використана для реконструкції філогенетичної схеми еволюції штамів підвидів, що підтвердили давність штамів кавказького, а також інших неосновних підвидів Y. pestis (рисунок 34).

Як випливає з цієї схеми, збудник чуми веде своє походження від псевдотуберкульозного мікроба і є гілкою еволюції цієї ентеропатогенної ієрсинії. Найбільш древній підвид Y. pestis філогенетично ближчий Y. pseudotuberculosis у порівнянні з іншими підвидами чумного мікроба. Іншу стародавню гілка еволюції Y pestis є улегейський, алтайський і гісарський підвиди, які генетично близькі один одному і, мабуть, відокремилися від загального стовбура еволюції єдиною групою, яка надалі розпалася на окремі підвиди. Очевидно, найдавнішим серед них є, улегейский підвид, який містить меншу кількість мутацій в генах життєзабезпечення (зокрема, він відсутня мутація в гені агаС) проти штамами алтайського і гісарського підвидів. Останні філогенетично близькі один до одного, а також штамів групи microtus, які містять такі ж мутації в генах диференціальних біохімічних ознак, що й штами алтайського та гісарського підвидів. Нами вперше висловлено припущення, що штами microtus відносяться до групи алтайсько-гісарських підвидів.

С092 (orientalis)

KIM 776 (meclievalis) (meclievalis)

NepalSlö (antiqua) subsp. ulegeica subsp. hismrica

91001 (microtus) subsp. altaica.

231, 680 subsp. caucasica

Y. pseu dotu bereu losis

Малюнок 34. Схема внутрішньовидової еволюції У. Рея

Проведені в цій роботі дослідження становлять основу для розробки молекулярної систематики збудника чуми, метою якого є створення повної таксономії внутрішньовидової Y. pestis на основі варіабельності генів диференціально-значущих мікробіологічних і біохімічних ознак чумного мікроба.

Список літератури дисертаційного дослідження кандидат біологічних наук Одиноков, Георгій Миколайович, 2010 рік

1. Акієв А.К. Про фізіологічну мінливість чумного мікроба // Проблеми особливо небезпечних інфекцій. – 1969. Вип. 6 (10). – С. 22 – 25.

2. Анісімов А.П. Фактори Yersinia pestis, що забезпечують циркуляцію та збереження збудника чуми в екосистемах природних вогнищ. Повідомлення 1// Молекул, генетика. 2002. – № 3. – С. 3 – 23.

3. Анісімов А.П. Фактори Yersinia pestis, що забезпечують циркуляцію та збереження збудника чуми в екосистемах природних вогнищ. Повідомлення 2// Молекул, генетика. 2002. – № 4. – С. 3 – 11.

4. Апарін Т.П., Голубинський Є.П. Мікробіологія чуми: Посібник. - Іркутськ / Вид в Іркут. ун – та, 1989. – 90 с.

5. Базанова Л.П., Інокентьєва Т.І. Про роль бліх - основних та другорядних переносників чуми - у циркуляції збудника в сибірських природних осередках // Мед. параз. та параз. хвороби. 2008. – № 3. – С. 54 – 60.

6. Балахонов C.B., Ценджаєв С.Н., Ердемебат A.B. Нові плазмідовари штамів збудника чуми, ізольованих у Монголії // Молекул, генетика, мікробіол. та вірусол. – 1991. – № 11. 27 – 29.

9. Бібікова В.А., Класовський В.М., Передача чуми бліхами. - М: - Медицина, 1974. 188 с.

10. Бобров А.Г., Філіпов А.А. Поширеність IS285 та IS 100 у геномах Yersinia pestis та Yersinia pseudotuberculosis II Мол. генет., мікробіол. та вірусол. 1997. – № 2. – С. 36 – 40.f

11. Ващенок B.C. Блохи переносники збудників хвороб людини та тварин. – Л.: Наука, 1988. – 160 с.

12. Величко Л.М., Кондрашкіна К.І., Єрмілов А.П. та ін. Екскременти бліх природне середовище довготривалого зберігання мікроба чуми // Проблеми особливо небезпечних інфекцій. – 1978. – Вип. (64). – С. 51 – 53.

13. Волков Ю.П., Єрошенко Г.А. Аналіз ефективності деяких методів побудови філогенетичних дерев, що використовуються при оцінці еволюційної спорідненості мікроорганізмів// Проблеми особливо небезпечних інфекцій. 2009. – Вип. 1 (99). – С. 35 – 41.

14. Гасфілд Дж. Рядки, дерева та послідовності в алгоритмах: Інформатика та обчислювальна біологія. – СПб.: Невський діалект, БХВ-Петербург, 2003. 654 с.

15. Гольдфарб Л.М., Домарадська Т.І., Джапарідзе М.М. До оцінки ізоцит-рат-ліазного тесту для диференціації збудників чуми та псевдотуберкульозу// Актуальні питання лабораторної діагностики та біохімії збудників чуми та холери. – 1984. С. 23 – 27.

16. Гольдфарб Л.М., Домарадська Т.І., Джапарідзе М.М. Ізоцитрат-ліазна активність тест для внутрішньовидової диференціації ієрсиній чуми // Сучасні аспекти профілактики зоонозних інфекцій. – 1984. – ч. 2.-С. 21 -22.

17. Домарадський І.В. Чума. М.: Медицина, 1998. – 173 с.

18. Ільїна Т.С., Романова ЮМ., Гінцбург A.JI. Біоплівка як спосіб існування бактерій у навколишньому середовищі та організмі господаря: феномен, генетичний контроль та системи регуляції їх розвитку // Генетика. – 2004. -Т. 40, № 11. – С. 1 12.

19. Класовський Л.М., Мартіневський І.Л., Степанов В.М. Про фактори зростання штамів бактерій чуми, що виділяються на Закавказькому нагір'я від польок та їх бліх // Проблеми особливо небезпечних інфекцій. 1972. – Вип. 1. – С. 186 – 188.

20. Козлов М.П. Чума. М.: Медицина, 1979. – 192 с.

21. Кокушкін A.M. Деякі особливості аліментарного зараження та прояви чуми у диких гризунів // Пробл. особливо небезпечних інфекцій. – 1994.-№5.-С. 23-31.

22. Кокушкін A.M. Соціальні та біологічні аспекти епідеміології чуми: Автореф. дис. докт. мед. наук. 1995. – 46 с.

23. Куклева Л.М. Єрошенко Г.О. Шавіна Н.Ю. та ін Порівняльний аналіз розподілу псевдогенів в. геном штамів основного та неосновних підвидів збудника чуми // Молекул.генет., мікробіол. та вірусол. 2009. – №2. – С. 32-36.

24. Куклева Л.М., Єрошенко-Г.А., Павлова А.І. та ін Характеристика штамів збудника чуми різних підвидів за ознаками нітратредукції, ферментації гліцерину та арабінози // Проблеми особливо небезпечних інфекцій. – 2007.-№ 94.-С. 50-53.

25. Куклева Л.М., Єрошенко Г.А., Шавіна Н.Ю. та ін Порівняльний аналіз розподілу псевдогенів у геномі штамів основного та неосновних підвидів збудника чуми // Молекул, генетика, мікробіол. та вірусол. – 2008. -№ 2.-С. 32-36.

26. Куклева JI.M., Кузьміченко І.А., Проценко О.А. Порівняльна характеристика біохімічних властивостей штамів різних підвидів Yersinia pestis та штамів Yersinia pseudotuberculosis II Проблеми особливо небезпечних інфекцій. - 2001.-Вип. 1.-С. 105-110.

27. Куклева JI.M., Проценко О.А., Кутирьов В.В. Сучасні уявлення про спорідненість збудників чуми та псевдотуберкульозу / Молекул, генет., мікробіол. та вірусол // 2002. №.1 - С. 3 - 7.

28. Кутирьов В.В., Єрошенко Г.А., Попов Н.В. та ін. Молекулярні механізми взаємодії збудника чуми з безхребетними тваринами // Молекул, генет. мікробіол. та вірусол. 2009. № 4. – С. 7 – 12.

29. Кутирьов В.В., Коннов Н.П., Волков Ю.П. Збудник чуми ультраструктури та локалізація в переноснику / За ред. В.В. Кутирьова. - М: Медицина. 2007. 224 с.

30. Кутирьов В.В., Попов Ю.А., Проценко О.А. Плазміди патогенності чумного мікроба// Мол. генет., мікробіол., Вірусол. 1986. - №6. - С.З -11.

31. Кутирьов В.В., Проценко О.А. Класифікація та молекулярно-генетичні дослідження Yersinia pestis II Проблеми особливо небезпечних інфекцій. 1998. – № 78. – С. 11 – 12.

32. Кутирьов В.В., Смирнова Н.І., Генодіагностика і молекулярне типування збудників чуми, холери і сибірки // Молекул, генет., мікробіол. та вірусол. – 2003 – № 1. – С. 6 14.

33. Кутирьов В.В., Смирнова Н.І. Генетичне розмаїття та еволюція геномів збудників особливо небезпечних інфекцій чуми, холери та сибірки: сьогодення та майбутнє // Біотехнологія: стан і переспективи раз-видіє.-М., 2005.-Ч. 1.-С. 17.

34. Лаборатрорна діагностика особливо небезпечних інфекційних хвороб. Практичне керівництво / За ред Г.Г.Оніщенко, В.В.Кутирьов.-М.: Медицина, Шико, 2009. 472 с.

35. Маніатіс Т., Фріч Е., Сембрук Дж. Молекулярне клонування. М: Мир, 1984.-480 з.

36. Мартіневський І.Л. Таксономія роду Yersinia II Мат. 4-ий наук. конф. за пріор. вогнище, та проф. чуми. – Алма-Ата, 1965. С. 142 – 148.

37. Мартіневський І.Л. Біологія та генетичні особливості чумного та близькоспоріднених йому мікробів. М.: Медицина, 1969. – 295 с.

38. Мартиневський І. Л., Степанов В.М., Кенжебаєв А.Я. Таксономія, мутація та генетика патогенності чумного та споріднених йому мікробів. Нукус. З-во «Каракалпакстан», 1990. – 151 с.

39. Методи загальної бактеріології за ред. Ф. Герхардта та ін. М.: Світ, 1984. -264 с.

40. Михайлова P.C. Таксономія чумного мікроба, що циркулює серед польок у Закавказькому нагір'ї // Матеріали до конф., присв. 50-річчя інституту «Мікроб». Саратов, 1968. – С. 67 – 68.

41. Визначник Бактерій Берджі за ред. Дж. Хоулта. Н. Крига, П.Сніта, Дж. Стейлі та Вільямса. - М: Мир, 1997. 9-е вид. (У 2-х томах). – 799 с.

42. Онищенко Г.Г., Кутирьов В.В., Попов Н.В. та ін. Природні осередки чуми Кавказу, Прикаспію, Середньої Азії та Сибіру / За ред. Г.Г.Оніщенко, В.В. Кутирьова. -М: Медицина, 2004. 192 с.

43. Пейсахіс Л.А., Степенов В.М. Внутрішньовидова класифікація збудника чуми за принципом географічного районування // Проблеми особливо небезпечних інфекцій. 1975. – Вип. 2. – С. 5 – 9.

44. Попов Ю.А. Конструювання та використання ДНК зондів на представниках роду Yersinia// Генетика, мікробіол. та вдосконалення методів лаб. діагностика особливо небезпечна. інф. Саратов, 1991. – С. 3-13.

45. Попов Ю.А. Структурна та функціональна організація плазмід та генно-інженерні розробки на цій моделі: Дис.докт. біол. наук. Саратов, 1991. – 248 с.

46. ​​Попов Ю.А., Горшков О.В., Савостіна Є.П. та ін., Генотипування штамів Yersinia pestis з різних природних осередків чуми // Молекул, генетика, мікробіологія та вірусологія 2000. – № 3. – С. 12-17.

47. Попов Ю.А., Проценко O.A., Анісімов П.І., Кокушкін A.M., Можаров

48. Т. Виявлення плазмід пестициногенності чумного мікроба методом електрофарезу в агарозному гелі // Профілактика особливо небезпечна. інф.- Саратов, 1980.-С. 20-25.

49. Попов Н.В., Слудський A.A. Удовіков А.І. та ін. Роль біоплівок Yersinia pestis у механізмі ензоотій чуми // Журн. мікробіол., Епідеміол. імунол. 2008. – № 4. – С.118 – 120.

50. Попов Ю.А., Фурсов В.В., Структурна організація похідних плазміди пестициногенності, мічених транспозонами Тп1 та Тп9 // Мол. біол., генет. та імунол. чуми та холери Саратов, 1983. – С. 34 – 39.

51. Попов Ю.А., Яшечкін Ю.І., Дроздов І.Г. Молекулярно-генетичний аналіз структури ДНК плазмід pFra штамів збудника чуми різних біоварів // Генетика. 1998. – Т. 34. – С. 198 – 205.

52. Проценко О.А., Анісімов П.І., Можаров О.Т. та ін. Виявлення та характеристика плазмід чумного мікроба, що детермінують синтез пестицину1, антигену фракція I та екзотоксину «мишачого» токсину // Генетика. 1983. -Т. 19 №7.-С. 1081–1090.

53. Ратнер В.А. Молекулярна генетика: принципи та механізми. Новосибірськ: Наука, 1983. – 256 с.

54. Розанова Г.М., Сердюкова Т.В., Шехікян М.Т. та ін. Збудник чуми з вогнищ польового типу на Кавказі Науч.-дослідж. протичумний ін-т Кавказу та Закавказзя. Ставрополь, 1987. 17 с.

55. Савостіна Є.П., Попов Ю.А., Геномний поліморфізм штамів основного підвиду збудника чуми // Молекул, генетика, мікробіологія та вірусологія 2009. – № 4. – С. 23 – 26.

56. Смирнов Г.Б. Механізми придбання та втрати генетичної інформації бактеріальними геномами // Успіхи сучасної біології. 2008. – Т. 128. – № 1.-С. 52-76.

57. Смирнов І.В. Збудник ієрсиніозу та близькі до нього мікроорганізми // Клин, мікробіол. антимікроб, хіміотер. – 2004. – Т. 6, № 1. – С. 10 -21.

58. Смирнова Н.І., Кутирьов В.В., Порівняльний аналіз молекуярно-генетичних особливостей геномів та їх еволюційних перетворень у збудників холери, чуми та сибірки // Молекул, генет., мікробіол. та вірусол. 2006. – № 2. – С. 9 – 19.

59. Стибаєва Г.С., Атшабар Б.Б. Молекулярно-генетичні особливості збудника чуми (огляд літератури) // Карантинні та зоонозні інфекції в Казахстані. 2003. – № 1 (7). – С. 52 – 67.

60. Сулейменов Б.М. Механізм ензоотії чуми. Алмати, 2004. – 236 с.

61. Султанов Г.В., Козлов М.П. Чума. Мікробіологія, патогенез, діагностика. Том 1. Махачкала: З-во Акад. сіль. наук, 1995. 223 с.

62. Тимофєєва Л.А. Про таксономію чумного мікроба // Проблеми особливо небезпечних інфекцій. 1972. – Вип. 1 (23). - С. 15 - 22.

63. Тимофєєва Л.А., Апарін Т.П., Трофименко Н.З. Потреби в амінокислотах штамів чумного мікроба, виділених у осередках Сибіру // Докл. Іркутськ, протичумного ін-ту. Іркутськ, 1971. - Вип. 9. – С. 43 – 44.

64. Тимофєєва Л.А., Жам'ян Сурен, Сотнікова А.М. та ін Біологічні властивості штамів чумного мікроба, виділених у Монголії в 1969 – 1971 рр. // Проблеми особливо небезпечних інфекцій. 1974. - №3 (37). – С. 37 – 42.

65. Тимофєєва JI. А., Логачов А. І. Yersinia pestis ulegeica – новий підвид чумного мікроба, виділений у МНР. У кн.: Епідеміологія та профілактика особливо небезпечних інфекцій у МНР та СРСР. - Улан-Батор.: Би.і., 1975. - С. 63 -64.

66. Туманський В.М. Мінливість чумного мікроба в природних умовах вогнищевості чуми // Кн.: Природ, вогнищ та епідеміол. особливо небезпечних інф. – Саратов, 1959. С. 189 – 199.

67. Філіпов A.A., Кутирьов В.В., Відяєва H.A. та ін Клонування локусу плазміди кальцій залежності Yersinia pestis (Lehmann, Neumann), що кодує синтез білка зовнішньої мембрани (БВМ2) // Генетика. 1991. - Т. 27 №4.-С. 598-606.

68. Філіппов A.A., Солодовніков Н.С., Куклева Л.М. та ін Вивчення плаз-мідного складу штамів збудника чуми з різних природних вогнищ // ЖМЕІ. 1992. – № 3. – С. 10 – 13.

69. Ціньова Г.Я., Солодовнікова Н.Ю., Воскресенська Є.А. Молекулярні аспекти вірулентності єрсиній // Клин, мікробіол. антимікроб, хіміотер. 2002. – Т. 4, № 3. – С. 248 – 266.

71. Яшечкін Ю.І., Кирилина О.А., Попов Ю.А. та ін Фізична картування 68 мд плазміди Y pestis 231 // Проблеми особливо небезпечних інфекцій. -1999. -№ 1 с. 26-28.

72. Achtman М., Morelli G., Zhu Р. та ін. Microevolution and históy of plague bacillus, Yersinia pestis II Proc. Natl". Acad. Sei. USA. 2004. - 101. - P. 17837-17842.

73. AchtmanM., Zurth K., Morelli G. та ін. Yersinia pestis, пов'язаний з plague, є останнім часом emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis II PNAS. 1999. - V. 96; N24. -P. 14043-14048.

74. Anisimov A.P.*, Lindler L.E., Pier G.B. Intraspecific Diversity of Yersinia pestis II Clin. Microbiol. 2004. - V. 17 (2). – P. 434 – 464.

75. Anisimov P.I., Popov Iu.A., Kokushkin A.M. Functional phenotypic variability in plague pathogen and plague enzootics // Med. Parazitol. (Моск). 2001. – N2.-P. 35-40.

76. Bai G., Smith E., Golubov A., Pata J. et al. Диференціальна gene regulation в Yersinia pestis versus Yersinia pseudotuberculosis: ефекти hypoxia і potential role of plasmid regulator // Adv. Exp. Med. Biol. 2007. – V. 603. – P. 131 – 144.

77. Baxevanis A.D., Francis-Ouellette B.F./Bioinformatics. Практична робота до аналізу genes and proteins / John-Willey N.Y., 2001. 470 p.

78. Bearden SW, Sexton C, Pare J. et al. Віднайдені enzootic (pestoides) isolates of Yersinia pestis express active aspartase // Microbiology. 2009 – V.155. -P. 198-209.

79. Beale J., Lee S.Y., Iwata S., Beis K. Structure of aliphatic sulfonate-binding protein SsuA від Escherichia coli II Acta Cryst. 2010. – V. 66. – P. 391 –396.

80. Ben-Gurion R., Hertman J., Bacteriocin-like material linear plasmid prophage of Yersinia enterocolitica with covalently closed ends // Moll. Microbiol. – 1958-V. 48.-P. 989-1003.

81. Bercovier H. Intra- і interspecies відносної Yersinia pestis згідно з DNA hybridization та її відношення до Yersinia pseudotuberculosis II Curr. Microbiol. 1980. – Nu 4. – P. 225 – 229.

82. Bobrov A.G., Kirillina O.A., Forman S. et al. Введення в Yersinia pestis biofilm development: топології і co-interaction hms inner membrane proteins involved in exopolisaccharide production // Environ.microbiol. – 2008. V. 10, N 6.-P. 1419–1432.

83. Bobrov A.G., Perry R.D. Yersinia pestis lacZ expresses beta-galactosidase with low enzymatic activity // FEMS Microbiol. Lett. 2006. – V. 255, N 1. – P. 43 -51.

84. Brubaker R.R. Інтерконверсія purine mononucleotides в Pasteurella pestis II Infect. Immun. 1970. – V. 1. – P. 446 – 454.

85. Brubaker R.R. Генеза Єрсинія: біохімічна і генетична віруленія // Сучасні топики в мікробіології, і імунологія. 1972. -N 57. - P. 293 - 299.

86. Brubaker R.R. Попередня емерація plague: процес felonious evolution // Microbial ecology. 2004. – V. 47. – P. 293 – 299.

87. Burrows T.W. Virulence of Pasteurella pestis and immunity to plague // Er-geb Mikrobiol Immunitatsforsch Exp Ther. 1963 – V. 37. – P. 59-113.

88. Buchrieser C., Prentice M., Carniel E. 102-кілоbase unstable region Yersinia pestis складається з високої pathogenicity island linked to pigmentation segment which undergoes internal rearrangement // J. Bacterid. – 1998. – V. 180. – P. 2321-2329.

89. Cao Y., Huang H., Meng K. та ін. Cloning and functional expression of a-galactosidase from Yersinia pestis biovar Microtus str. 91001 // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2008. -V. 72, N 8. – P. 2203 – 2205.

90. Chain PS, Carniel E., Larimer F.W. та ін. Завдання в розвиток Yersinia pestis через все genome comparison with Yersinia pseudotuberculosis! I Proc. Natl. Acad. Sei. США. 2004. – V. 191, N38.-P. 13826-13831.

91. Chain PS, Hu PS, Malfatti SA et al. Complete genom sequence of Yersinia pestis strain Antiqua and Nepal516: evidence gene reduction in emerging pathogen // J. Bacterid. 2006. – V. 188, N 12. – P. 4453 – 4463.

92. Chuang Peng / Distance засновані методи в phylogtetic tree construction, p. 1-11,2007.

93. Cobbs C.G., Chansolme D.H. Plague. // Clin. Dermatol. 2004. - V. 22 (3). -P. 303-312f

94. Cornells G.R., Boland A., Boyd A.P. та ін. The virulence plasmid of Yersinia, an antihost genome // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. – V. 62, №4. -P. 1315–1352.

95. Cowan C. та ін., Invasion epithelial cells by Yersinia pestis: evidence for Y. pestis-specific invasion // Infect. Immun. 2000. - V. 68 (8). – P. 4523 – 4530.

96. Dale C., Wang B. та ін. Plague// Proc. Natl. Acad. Sei. США. 2002. -Vol.99, № 19.-P. 12397-12402.

97. Darby C., Ananth S.L., Tan L., Hinnebusch B.J. Identification of gmhA Yersinia pestis gene required for flea blockage using a Caenorhabditis elegans biofilm// Infect.Immun.- 2005. V.73, N11. – P. 7236 – 7242.

98. Deng W., Burland V., Plunkett G. та ін. Genome sequence of Yersinia pestis KIM // J. Bacteriol. 2002 – V. 184 – P. 4601 – 4611.

99. Dennis D.T., Chow C.C. Plague// J. Pediatr. Infect. Dis. 2004. - V. 23 (1). -P. 69-71.

100. DeSalle R., Giribet G., Wheeler W. / Techniques in molecular systematics and evolution/ Birkhauser, 2002. 420 p.

101. Devignat R. Variétés de l'espece Pasteurella pestis // Bull. WHO. 1951. - V. 4.-P. 247-263.

102. Epinger M., Guo Z., Sebastian T., Song Y., Lindl er L.E., Yang R., Ravel J. Draft genome sequences of Yersinia pestis isolates from natural foci of endemic plague in Cine // J. Bacteril. 2009. – V. 191. – P. 7628 – 7629.

103. Epinger M., Rosovitz MJ, Fricke W.F. та ін. Здійснити генети послідовності Yersinia pseudotuberculosis IP31758, causative agent of Far East Scarlet-Like Fever // Plos Genetics 2007. - V. 3 - P. 1508 - 1522.

104. Eppinger M., Worsham P.L., Nikolich M.P. та ін. Genome sequence of deep-rooted Yersinia pestis strain Angola reveals нових insights в evolutionand pangenome of plague bacterium // J. Bacteriol. 2010. – V. 192, N 6. – P.i1685-1699.

105. Felek S., Tsang T.M., Krukonis E.S. Три Yersinia pestis adhesins можливі Yop delivery to eukaryotic cells and contribute to plague virulence // Infect. Immun. V. 77 (2). – P. 825 – 836.

106. Felsenstein J., PHYLIP-Phylogeny Inference Package (version 3.2). Cladis-tics, 1989, vol. 5, pp. 164-166, http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html.

107. Fetherston J.D., Perry R.D. Пігментація довкілля Yersinia pestis KIM6+ є внесеною в усвідомлення sequence і включає структурні genes для pesticin sensitivity і HMWP2 // Mol. Microbiol. 1994. – V. 13, №4. – P. 697 – 708.

108. Forman S., Wulff C.R., Myers-Morales T. et al. yadBC of Yersinia pestis, як нова virulence determinant для bubonic plague // Infect Immun. - 2008. V. 76 (2). -P. 578-587.

109. Garcia E., Worsham P., Bearden S. та ін. Pestoides F, як типовий Yersinia pestis strain від основи Совєтської Союзу // Adv Exp Med Biol. 2007. – V. 603. –P. 17-22.

110. Gascuel O. / Mathematics of evolution and phylogeny. / Clarendon press. Оксфорд. 2004.-33 p.

111. Гінтсбург А.Л., Шовадаева Г.А., Шубін Ф.Н. та ін. Integration with the chromosome-an alternative state of calcium-dependency plasmids in Yersinia // Mol. Gen. Мікробіол. Virusol. 1989. -N 5. -P. 7 – 11.

112. Guiyoule A., Gerbaud G., Buchriester C. та ін. Transferable plasmid-mediated resistance до streptomycin в клінічним ізоляціях Іерсінії Песті II Емерг. Infect. Dis. 2001. – Vol. 7, № 1. – P. 43 – 48.

113. Guo Y., Zhang L., Xia L. та ін. Biochemical characters of Yersinia pestis isolated from Yulong County Yunnan Province in China // Endem. Dis. Bull. -2008.-V. 23.-P. 12-14.

114. Hall-Stoodley L., Costerton J. W., Stoodley P. Bacterial biofilms: від природного середовища до руйнівних умов. Nat. Rev. Microbiol. 2004, N2. - P 95-108.

115. Hare J.M., McDonough K.A. High-frequency RecA-dependent and -independent mechanisms of Congo red binding mutations in Yersinia pestis. H J. Bacteriol. 1999. -V. 181(16). – P. 4896-4904.

116. Hillier S.L., Charnetzky W.T. Швидкий diagnostic test, що використовує ісоціратну лія активність для виявлення Yersinia pestis II J.Clin.Microbiol. – 1981. V.13, N4. -P. 661-665.

117. Hinnebusch B.J. Evolution of flea-borne transmission в Yersinia pestis II Curr. Issues Mol. Biol. 2005. – V. 7, N2. – P. 197 – 212.

118. Hinnebusch BJ., Fisher E.R., Schwan T.G. Визначення ролі йерсінії pestis plasminogen activator й інших plasmid кодованих factors в temperate dependent blockage of flea // Infect. Immun. 1998. – V. 178. – P. 1406 –1415.

119. Hinnebusch BJ, Perry R.D., Schwan T.G. Роль Йерсінії pestis hemin storage (hms) locus in the transmission of plague by fleas// Science. 1996. - V 273, N5273-P. 367-370.

120. Hinnebusch BJ, Rudolf A.E., Cherepanov P.et al. Відомості про Йерсінію murine toxin в survival of Йерсінія pestis в midgut of flea vector // Science. – 2002.-V. 296.-P. 733-735.

121. Hoiczyk E., Roggenkamp A., Reichenbecher M. та ін. Структура і sequence analysis of Yersinia YadA and Moraxella UspAs reveal a novel class of adhesins // J. EMBO 2000. - V. 19(22). – P. 5989 – 5999.

122. Iriarte M., Cornelis G.R. Molecular determinants of Yersinia pathogenesis // Microbiologia. 1996. -V. 12(2). - P. 267-280.

123. Jackson S., Burrows T.W. virulence-enhancing effect of iron on non-pigmented mutants of virulent strains of Pasteurella pestis // Br. J. Exp. Pathol. – 1956. -Y. 37. - P. 577-583.

124. Joshua G.W.P., Karlyshev A.V., Smith M.P. та ін. A Caenorhabditis elegans модель Yersinia infection: biofilm формування на biotic surfaces // Microbiology. 2003. – V. 149. – P. 3221 – 3229.

125. Kienle Z., Emody L., Svanborg C., O"Toole P.W. Adhesive properties conferred by the plasminogen activator of Yersinia pestis.

126. Kitching I.J., Forey P.L., Humphries C.J., Williams D.M. / Cladistics. Theory і практика parsimony analysis. - Oxford science publications, 1998. - 223 p.

127. Кутирев В.В., Бульгакова Е.Г., Идяева Н.А. та ін. Comparative characteristics of different bacterial groups of the genus Yersinia // Natural Infect. Dis.: Abst. of Scient. Conf. 6 грудня. Ulanbaatar, 2001. – P. 39 – 40.

128. Кутирев V.V., Filippov A.A., Oparina O.S. та ін. Analysis of Yersinia pestis chromosomal determinants Pgm+ and Psts associated with virulence // Microb. Pa-tog. 1992.-V. 12. - P. 177-186.

129. Кутирев V.Y., Vidyaeva N.A., Bobrov A.G. та ін. Звірячі токсинні гени для косметичних фосфоліпасів D // Bacterial protein toxins. Jena-Stuttgart. – 1997.-P. 59-60.

130. Lahteenmaki K., Virkola R., Saren A. та ін. Expression plasminogen activator pla of Yersinia pestis поліпшення бактерійного адаптації до mammalian extracellular matrix // Infect Immun. 1998. - V. 66 (12). – P. 5755 – 5762.

131. Lathem W.W., Price P.A., Miller V.L., Goldman W.E. A plasminogen-activating protease specifically controls the development of primary pneumonic plague // Science. 2007. – V. 315 (5811). – P. 509 – 513.

132. Lazarus A.A., Decker C.F. Plague // Respir Care Clin. N Am. 2004. -V. 10 (1).-P. 83-98.

133. Li Y., Hauck Y., Platonov M.E. et al., Genotyping and analysis of Yersinia pestis by ML VA: усвідомлює світ світової експедиції Центральної Азії plague foci // PLOS ONE. 2009. -V. 4 (6)., e6000.j

134. Liang Y., Hou X., Wang Y. та ін. Genome rearrangements of completely sequenced strains of Yersinia pestis II J. Clin. Microbiol. – 2010. – V. 48 (5). – P. 1619-1623.

135. Lillard JW, Fetherston JD, Pedersen L. et al. Sequence and genetic analysis of hemin storage (hms) system of Yersinia pestis II Gene. – 1997. V. 193. – P. 13-21.

136. Lindler LE. Типові методи для плавання pathogen, Yersinia pestis II J. AOAC Int. 2009. – V. 92(4). – P. 1174 – 1183.

137. Lindler L.E. Yersinia pestis - specific plasmids pFra and pPla // Yersinia molecular and cellular biology / Ed.: E. Carniel, B.J. Yinnebusch. Horison Bio-sciense, 2004. – Chapt.

138. Matsumoto H., Young G.M. Переміщені ефекти Yersinia // Curr. Opin. Microbiol. 2009. – V. 12(1). – P. 94 – 100.

139. McDonough K.A., Barnes A.M., Quan T.J. та ін. Mutation в pla gene Yersinia pestis alters the course of plague bacillus-flea (Siphonaptera: Cerato-phyllidae) interaction I I J.Med. Enthomil. 1993. – V. 30. – V. 772 – 780.

140. Mollaret H., Mollaret C. Melibiose fermentation у гені Yersina і його важливість в diagnosis of varieties of Y. pestis II Bull Soc Pathol Exot Filiales. 1965.-V. 58 (2).-P. 154-156.

141. Mount D. W./Bioinformatics. Sequence and genome analysis. Gold Spring Harbor laboratory press, 2003. – 50 p.

142. Наумов А.В., Куз"Михенко І.А., Taranenko Т.М. та інші. Biochemical aspects of pathogenity of the causative agent of plague // Med. Parazitol. (Mosk). 1995. - N 4 - P. 17-22.

143. Navid A., Almaas E. Genome-scale reconstruction of metabolic network в Yersinia pestis, strain 91001 // Mol. Biosyst. 2009. – V. 5(4). - P. 368-375.

144. Odaert M., Berche P., Simonet M. Molecular typing of Yersinia pseudotuberculosis за допомогою IS200-like element // J. Clin. Microbiol. 1996. – V. 34(9). -P. 2231-2235.

145. Paerregaard A., Espersen F., Skurnik M. Довідка про Йерсінію в меблевий proteín YadA в поєднанні з rabbit intestinal tissue and rabbit intestinal brush border membrane vesicles // APMIS. 1991. - V. 99 (3). – P. 226 – 232.

146. Paiva Nunes M., Suassuna I., Rocco Suassuna I. Biochemical characteristics of Yersinia pestis samples isolated in Brazil // Rev. Latinoam. Microbiol. 1977. -V. 19 (4).-P. 189-197.

147. Pan NJ, Brady MJ, Leong JM, Goguen JD. Targeting type III secretion в Yersinia pestis II Antimicrob. Agents Chemother. 2009. – V. 53(2). - P. 385-392.

148. Panina E.M., Vitreschak A.G., Mironov A.A., Gelfand M.S. Regulation of aromatic Amino acid byosynthesis в Gamma-proteobacteria // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2001. – V. 3, N 4. – P. 529 – 543.

149. Parhill J., Wren B: W., Thomson N.R. та ін. Genome sequence of Yersinia pestis, causative agent of plague // Nature. 2001. – V. 413. – P. 523 – 527.

150. Patel CN, Wortham BW, Lines JL. та ін. Поліаміни є важливими для формування plague biofilm// J.Bacteriol. 2006. -V. 188, N 7. – P. 2355 – 2363.

151. Pendrak M.L., Perry R.D. Характеристика hemin-storage locus of Yersinia pestis I I Biol. Metals 1991. – V. 4. – P. 41 – 47.

152. Pendrak M.L., Perry R.D. Proteins essential for expression of Hms+ phe-notype Yersinia pestis II Mol. Microbiol. 1993. – V.8. – P. 857 – 864.

153. Perry R.D., Pendrak M., Schuetze P. Identification and cloning of hemin storage locus involved in the pigmentation phenotype of Yersinia pestis II J. Bacte-riol. 1990. – V. 172. – P. 5929 – 5937.

154. Perry R.D., Balbo P.B., Jones H.A. та ін. Yersiniabactin від Yersinia pestis". biochemical characterization of siderophore and its role in iron transport and regulation // Microbiology. 1999. - V. 145, Part. 5. - P. 1181 - 1190.

155. Perry R.D., Fetherston J.D. Yersinia pestis етіологічний agent of plague // Clin. Mcrobiol. Rev. 1997. – V. 10. – P. 35.

156. Perry R.D., Lucier T.S., Sikkema D.J. et al., Storage reservoirs of hemin and inorganic iron in Yersinia pestis II Infect. Immun. – 1993. V. 61. – P. 32 – 39.

157. Perry R.D., Straley S.C., Fetherston J.D. та ін. DNA sequencing and analysis of low-Ca2+-response plasmid pCDl of Yersinia pestis KIM5 // Infect. Immun. 1998. – V. 6, N 10. – P. 4611 – 4623.

158. Perry R.D. A plague of fleas: survival and transmission of Yersinia pestis II ASM News. 2003. – V.69, N 7. – P. 385 – 389.

159. Plague. Fact sheets N267. World Health Organization, Available at: http://www.who.int/mediacentre/factssheets/fs267/en/index.htm.Accessed April 18, 2006.

160. Portnoy D.A., Moseley S.L., Falkow S. Characterization of plasmids and plasmid-associated determinants of Yersinia enterocolitica pathogenesis // Infect. Immun. 1981. – V. 31. – P. 775 – 782.

161. Pouillot F., Fayolle C., Camiel E. Характеристики chromosomal regions conserved in Yersinia pseudotuberculosis and lost by Yersinia pestis I I Infect. Immun. 2008. – V. 76(10). – P. 4592 – 4599.

162. Prasad Maharjan R., Yu P.L., Seeto S., Ferenci T. Роль isocitrate lyase і gluoxylate cycle в Escherichia coli зростає під glucose limitation // Res. Microbiol. 2005. - V. 156 (2). – P. 178 – 183.

163. Prentice MB, Rahalison L. Plague // Lancet. 2007. – V. 369, N 9568. – P. 1196-1207.

164. Price S.B., Cowan C., Perry R.D., Straley S.C. Єрсиніапестіс В антиген є регулятором proteínу, необхідним для Ca2(+)-dependent зростає і максимальне визнання низьких-Ca2+ реагування virulence genes // J. Bacterid. 1991. - V. 173 (8). – P. 2649 – 2657.

165. Rakin A., Boolgakowa E., Heesemann J. Structural і функціональна організація з Yersinia pestis bacteriocin pesticin gene cluster // J. Microbiol. 1996. -V. 142.-P. 3415-3424.

166. Richardson DJ, Berks B.C., Russell D.A. та ін. Functional, biochemical and genetic diversity prokaryotic nitrate reductases // CMLS. 2001. – V. 58. – P. 165-178.

167. Sneath P.H., Socal R.R. Numerical taxonomy II Nature. 1962. – N 193. – P. 855 – 860.

168. Quan T., Van der Linden J., Tsuchiya K. Evaluation of gualitative isocitrate lyase assay for rapid presumptive identification of Yersinia pestis II J. Clin. Microbiol. 1982.-V. 15, N16.-P. 1178-1179.

169. Sanger F., Nicklen L., Coulson A. DNA sequencing with chain-terminatinginhibitors // Proc. Natl. Acad. SCI. США. 1977. – Vol. 74. - P. 5463-5467.

170. Savostina E.P., Popov Iu.A., Каштанова Т.Н. та ін. Genomic polymorphism of main subspecies of plague agent strains // Mol. Gen. Мікробіол. Virusol. -2009-N4. P. 23-27.

171. Sebbane F., Jarrett C.O., Gardner D. et al. Відомості про Йерсінію pestis plasminogen activator в incidence of distinct septicemic and bubonic forms of fleaiborne plague // Proc.Natl. AcadlSci.USA. 2006. – V.103, N 14 – P.5526 – 5530.

172. Sebbane F., Jarrett G.O., Linkenhoker JR, Hinnebusch BJ. Визначення ролі повноцінної ісоціативної сили діяльності в Yersinia pestis infektion of flea vector and"mammalian host // Infect, and Immun. - 2004. V. 72, N 12. - P. 7334-7337.

173. Semple C., Steel M. / Phylogenetics. Oxford university press, 2003. – 256 P

174. Simonet M., Riot B., Fortineau N., Berche P. Invasin production Yersinia pestis is abolished insertion of IS200-like element within in in gene // Infect Immun. 1996. – V. 64(1). – P. 375 – 379.

175. Skrzypek E., Straley S.C. Різні ефекти відхилень в lcrV на межі V antigen, регулювання низько-Ca2+ відповіді, і виразка Yersinia pestis II J. Bacteriol. 1995. - V. 177 (9). – P. 2530 – 2542.

176. Song Y. Tong Z. Wang J. et al. 2004. – V. 11 (3). -P. 179-197.

177. Stenseth N.C., Atshabar B.B., Begon M. та ін. Plague: past, present, and future // PLoS Med. 2008. - V. 5 (1)., E3.

178. Straley et al., Environmental modulation of gene expression and pathogenesis in Yersinia // Trends Microbiol. 1995. - V. 3 (8). – P. 310 – 317.

179. Sun Y.C., Hinnebusch BJ, Darby C. Experimental evidence for negative selection in the evolution of Yersinia pestis pseudogene // Proc. Natl. Acad. Sei. США. 2008. V. 105, N 2. - P. 8097 - 8101.tyf

180. Surgalla M. J., Beesley E. D. Congo Red-Agar Plating Media для виявлення pigmentation в Pasteurella pestis // Appl. Microbiol. - 1969. V. 18 (5). - P. 834-837.

181. Tahir Y., Skurnik M. YadA, multifaceted Yersinia adhesin // Int. J. Med. Microbiol. 2001. - V. 291 (3). – P. 209 – 218.

182. Takahashi H., Watanabe H. Plague // Nippon Rinsho. 2007. – V. 65. – P. 54-59.

183. Tiball R.W., Hill J., Lawton DJ, Brown K.A. Yersinia pestis and plague I I Biochem. Soc. Trans. 2003. – V. 31. – P. 104 – 107.

184. Weerasingle JP, Dong T., Schertzberg M.R. та ін. Стационари фаза expression of arginine biosynthetic operon argCBH в Escherichia coli II BMC Microbiology. 2006. – V. 6. – P. 14 – 26.

185. Williamson ED. Plague. // Vaccine. 2009. – V. 4. – P. 56 – 60.

186. Wren B.W. Microbial genome analysis: insights в virulence. Host adaptation and evolution// Nature Rev.Genet. 2000. – V. 1. – P. 30 – 39.

187. Wren B.W. Yersinia є моделлю genus для вивчення швидкого розвитку bacterial pathogen//Nature reviews. Microbiology. 2003.-V.l. - P.55-64.

188. Worsham P.L., Roy C. Pestoides F, Yersinia pestis strain lacking plasminogen activator, є віруючий по аероsol route // Adv. Exp. Med. Biol. 2003. – V. 529. –P. 129-131.

189. Xiong Jin/Essential bioinformatics. Cambridge univ. press. 2006. 361 p.

190. Zhou D., Han Y., Song Y. та ін. Comparative і еволюційні genomics Yersinia pestis II Microbes Infect. 2004. – V. 6(13). – P. 1226 – 1234.

191. Zhou D., Tong Z., Song Y. та ін. Genetics metabolic variations між Yersinia pestis biovars і proposal of new biovar, microtus // J. Bacteriol. -2004. V. 186. – P. 5147 – 5152.

Зверніть увагу, наведені вище наукові тексти розміщені для ознайомлення та отримані за допомогою розпізнавання оригінальних текстів дисертацій (OCR). У зв'язку з чим у них можуть бути помилки, пов'язані з недосконалістю алгоритмів розпізнавання.
У PDF файлах дисертацій та авторефератів, які ми доставляємо, таких помилок немає.

Введення в роботу

Актуальність проблеми.Чума - зоонозна природно-осередкова особливо небезпечна карантина бактеріальна інфекційна хвороба з трансмісивним механізмом передачі збудника [Черкаський, 1996]. Чума становить реальну загрозу для населення через існування численних природних осередків чуми, частина з яких розташована в Російській Федерації та ближньому зарубіжжі [Оншценко зі співавт., 2004]. Висока ймовірність занесення збудника чуми на територію Росії із сусідніх, неблагополучних через цю хворобу країн, а також внаслідок біотерористичних актів. За даними ВООЗ щорічно у світі реєструється понад 2000 випадків захворювання на чуму, багато з яких закінчуються летальним кінцем. Великий спалах легеневої чуми в 2009 р. стався в Хайнань-Тибетському автономному окрузі Китаю, в якому також було зареєстровано низку смертельних випадків. Всі ці факти вимагають розробки нових, заснованих на сучасних технологіях високоефективних методів діагностики збудника чуми, засобів профілактики і лікування особливо небезпечної хвороби, що викликається ним.

Класифікації, що використовуються до теперішнього часу Yersinia pestisвраховували лише морфологічні, культуральні, біохімічні та інші фенотипічні ознаки [Безсонова, 1928; Борзенков, 1938; Туманський, 1957; Тимофєєва, 1968; Кутирьов, Проценко, 1998; Devignat, 1951] і були позбавлені недоліків, що з мінливістю цих властивостей. Однак досягнуті останнім часом успіхи в фундаментальній генетиці та молекулярній мікробіології дозволяють перевести розв'язання задач із систематизації збудника чуми на якісно новий рівень, заснований на використанні його молекулярно-генетичних особливостей.

Відповідно до прийнятої в даний час вітчизняної класифікації штами збудника чуми ділять на основний та 4 неосновних (кавказький, алтайський, гісарський та улегейський) підвиду [Тимофєєва, 1985; Кутирьов, Проценко, 1998]. Відповідно до поширеної зарубіжної класифікації штами Y. pestisна підставі відмінностей по ряду біохімічних властивостей (здатність до ферментації гліцерину, редукції нітратів, окислення аміаку) та за історико-географічним принципом ділять на три біовари: antiqua (античний), medievalis (середньовічний) та orientalis (східний). За фенотиповими характеристиками штами основного підвиду відповідають трьом біоварам (античному, середньовічному та східному), прийнятим у зарубіжній класифікації. Однак штами Y. pes-

4 tis,циркулюючі в природних вогнищах чуми в РФ і ближньому зарубіжжі, залишаються не систематизованими за їх приналежністю до певних біоварів.

За експресією диференціально-значущих біохімічних ознак найбільш активними є штами античного біовара. Вони ферментують гліцерин мають денітрифікуючу активність. Штами середньовічного біовара ". pestisне здатні редукувати нітрати, але ферментують гліцерин та арабіноз; Штами східного біовару не ферментують гліцерин, але активно редукують нітрати і утилізують арабінозу.

Штами основного підвиду, що циркулюють на території РФ і ближнього зарубіжжя, як правило, високо вірулентні і мають високу епідемічну зн: чимість. Вони не ферментують рамнозу та мелібіозу, не чутливі до ПЕСТИЦІЇ І, мають високий рівень продукції ізоцитраліази. Штами неосновних підвидів ферментують рамнозу і мелібіозу, чутливі до пестицину I, не виявляючи ізоцитрат-ліазної активності, вибірково вірулентні для лаборторних живих, епідемічно малозначущі.

Генетичні причини різної експресії біохімічних ознак і користуються при розподілі штамів Y. pestisна біовари та підвиди, залишаються до теперішнього моменту вивченими недостатньо. Достовірно встановлено лише те, що причиною відсутності ферментації гліцерину у штамів східного біовару є мутація в гені гліцерол-3-фосфатдегідрогенази (glpD).Показано, що в цьому геї у всіх штамів східного біовару є делеція розміром 93 п.н. . У літературі є лише поодинокі роботи з визначення відмінностей у структурі генів Y. pestisосновного та неосновних підвидів, що ю дують редукцію нітратів і ферментацію рамнози [Куклева з співавт., 200 2009; Anisimov et al., 2004; Zhou та ін., 2004].

Залишаються не встановленими причини гетерогенності штамів чумного світу за поживними потребами. Штами з різних природних вогнищ чум відрізняються за поживними потребами, що визначаються порушеннями генів пр проміжного метаболізму, що може бути використане в генетичній схемі дії ференціації штамів Y. pestisз різних природних осередків чуми.

Виявлення змін у структурі генів, що лежать в основі різної екпресії мікробіологічних та біохімічних ознак, послужить надійною про нову для створення генетичної схеми класифікації штамів збудника чум а також для визначення основних напрямів внутрішньовидової еволюції. Y. pestis.

5 Мета роботи.Визначення генетичних основ різної експресії біохімічних ознак, що використовуються для поділу штамів збудника чуми на підвиди та біовари.

Завдання дослідження:

Охарактеризувати використані в роботі штами Y. pestis,виділені в природних вогнищах чуми в РФ та ближнього зарубіжжя, за біохімічними властивостями (редукція нітратів, продукція ізоцитрат-ліази, ферментація арабінози та мелібіози), що лежить в основі поділу на підвиди та біовари. Встановити належність штамів, що циркулюють на території Росії та суміжних країн, до певних біоварів.

Вивчити структурно-функціональну організацію генів, що кодують диференціальні ознаки, що використовуються при розподілі на біовари, – редукцію нітратів та ферментацію арабінози.

Виявити зміни у генах Y. pestis,детермінують ферментацію мелібіози та продукцію ізоцитрат-ліази, що лежать в основі диференціації основного та неосновного підвидів збудника чуми.

Визначити поживні потреби штамів Y. pestisкавказького підвиду та встановити генетичні основи їх ауксотрофності.

Оцінити перспективність використання одержаних результатів для створення генетичної схеми внутрішньовидової класифікації штамів Y. pestisта встановлення основних напрямів внутрішньовидової еволюції цього збудника.

Наукова новизна роботи.На підставі даних комплексного мікробіологічного, біохімічного та генетичного аналізу встановлено, що штами збудника чуми, що циркулюють у природних осередках РФ та ближнього зарубіжжя, відносяться до античного та середньовічного біоварів.

Вперше показано, що причиною відсутності нітратредукуючої активності в частині штамів основного підвиду, що циркулюють на території РФ та ближнього зарубіжжя, є наявність заміни одиничного нуклеотиду G -»Т у позиції 613 гена периплазматичної нітратредуктази - пара,що доводить належність цих штамів до середньовічного біовару. Відсутність експресії цієї ознаки у штамів алтайського та гісарського підвидів викликана вставкою тимшювого нуклеотиду (+Т) у 302 позиції іншого гена - ssuA,яка призводить до зсуву рамки зчитування та порушення структури кодованого транспортного білка - SsuA, що також бере участь у відновленні нітратів.

Вперше встановлено, що відсутність ферментації арабінози у штамів pestisалтайського та гісарського підвидів пов'язано з наявністю мутації в регулято( ному гені арабінозного оперону - агаС,який містить інсерцію гуанінового нуклеотиду (+G) у позиції 773 від початку гена, що призводить до зсуву рамки счітування і порушення структури регуляторного білка АгаС, необхідного для ініції транскрипції генів арабінозного оперону.

Вперше встановлено генетичну основу різної продукції ізоцитру - ліази у штамів збудника чуми основного та неосновних підвидів, пов'язану з наявністю вставки двох нуклеотидів (+СС) у регуляторному гені. iclRу позиції 26! 270, яка призводить до інактивації кодованого ним білка-репресора ацетатного оперону IclR та є причиною конститутивного синтезу ферменту ізоцитру ліази у штамів основного підвиду. Штами неосновних підвидів містять ш тактний ген iclRта не здатні до конститутивного синтезу ізоцитрат-ліази.

Показано, що відсутність ферментації мелібіозів у штамів Y. pestisосновного підвиду обумовлено впровадженням інсерційної послідовності IS285ген melB,кодуючий фермент галактозидпермеазу У штамів неосновних підвідів вставка IS2&5 в гені melBВідсутнє.

Вперше виявлено генетичні основи ауксотрофності штамів кавказького підвиду, які пов'язані. звпровадженням інсерційних послідовностей IS100гени argAі aroF,вставкою 10 п.н. у ген aroG,інсерцією тімінового нуклеотиду ген thiHv.делецією 13 п.н. у гені thiG.

Отримана молекулярна характеристика штамів Y. pestisосновного і неонових підвидів за генами, що кодують біохімічні ознаки, що лежать в основі поділу на підвиди і біовари, створює основу для розробки генетичної системи внутрішньовидової класифікації збудника чуми.

За результатами роботи оформлені заявки на винахід «Спосіб визначення підвидової належності штамів збудника чуми методом секвенування» (№2009116913. Пріоритет від 14.05.2009. Отримано рішення про видачу патенту та «Спосіб підвидової диференціації Yersinia pestisметодом мультил кусного сіквенс - типування (№2009146094. Пріоритет від 11.12.2009).

Практична значущість роботи.За результатами роботи оформлені та упевнені методичні рекомендації «Визначення підвидової належності штамів збудника чуми на основі секвенування генів rhaSі агаС,контролюючих ферментацію рамнози та арабінози» (затверджені директором РосНДПЛ «Мікроб». Протокол № 6 від 16 червня 2009) і «Визначення підвидової приналежності;

7 ності штамів Yersinia pestisметодом мультилокусмного сіквенсу – типування (затверджено директором РосНІПЧІ «Мікроб». Протокол № 1 від 23 лютого 2010 року).

У Державній колекції патогенних бактерій депоновано три штами: Y. pestisКМ 910 алтайського, КМ 596 гісарського та КМ 1861 улегейського підвидів як референс-штамів цих підвидів.

Отримані в ході виконання дослідження дані щодо генетичної організації штамів Y. pestisвикористовуються під час читання лекцій з предмету «Генетика збудника чуми» на курсах спеціалізації та підвищення кваліфікації при РосНІПЧІ «Мікроб».

Положення, що виносяться на захист:

Штами збудника чуми основного підвиду, що циркулюють у природних осередках РФ та ближнього зарубіжжя, відносяться до античного та середньовічного біоварів, про що свідчать дані комплексного аналізу мікробіологічних, біохімічних та генетичних властивостей цих штамів.

В основі різного прояву біохімічних ознак, що використовуються при розподілі штамів Y. pestisна підвиди та біовари, лежать різні типи мутацій у генах, що кодують ці ознаки. Відсутність здатності до редукції нітратів у штамів основного підвиду середньовічного біовара пов'язана з наявністю нонсенс-мутації (G – Т) у гені парапериплазматичної нітратредуктази, а у штамів алтайського та гісарського підвидів – з інсерцією одиничного нуклеотиду в ген ssuAтранспортного периплазматичного білка SSUA.Відсутність ферментації арабінози у штамів алтайського та гісарського підвидів обумовлена ​​вставкою гуанінового нуклеотиду в послідовність гена агаС.

Різна біохімічна активність штамів основного і неосновних підвидів збудника чуми по ряду диференціальних ознак викликана редукцією генів, що кодують, у основного підвиду та їх інтактністю у неосновних підвидів. Відсутність ферментації мелібіози штамами основного підвиду обумовлена ​​впровадженням у ген melBгалактозидпермеази, а конститутивний синтез ізоцитрат-ліази у штамів цього підвиду - вставкою двох нуклеотидів (СС) у послідовність регуляторного гена iclR.Штами неосновних підвидів містять інтактні гени melBі iclR.

Причиною багатьох поживних потреб штамів Y. pestisКавказького підвиду є інактивація в них ряду генів біосинтезу амінокислот та вітамінів. Залежність штамів цього підвиду аргініну викликана інсерцією IS70O в ген argA,по фенілаланіну - вставкою 10 п.н. у ген aroG,по тирозину - використанням IS100у ген aroF,по тіаміну (ВО делецією 13 п.н. - ген thiGта інсерцією одинич-

8 ного нуклеотиду в МН.На основі всього комплексу виявлених мутацій для штаїмів кавказького та інших підвидів, а також біоварів збудника чуми визначено характерні генотипи, які можуть бути використані при створенні генетичної схеми внутрішньовидової класифікації Y. pestis.

Апробація роботи.Матеріали дисертації представлені та обговорені на IX Міждержавній науково-практичній конференції держав-учасниць СНД «Сучасні технології в реалізації глобальної стратегії боротьби з інфекційними хворобами на території держав - учасниць співдружності незалежних держав», Волгоград, 2008; VI Міжнародній конференції «Молекулярна діагностика та біобезпека», М., 2009; науково-практичній школі конференції молодих вчених та фахівців Федеральної служби з нагляду у сфері захисту прав споживачів та благополуччя людини «Сучасні технології забезпечення біологічної безпеки», 25 - 27 травня 2010 р.; на щорічні підсумкових конференціях РосНІПЧІ «Мікроб», Саратов 2008 – 2010 рр.