Молекули із пластиліну. Покроковий урок ліплення

Вкрай малі розміри ДНКне дозволяють побачити її. Ось чому для деяких вона постає суто абстрактним поняттям, а не дійсно існуючою молекулою. Найкращому розумінню ДНКможе допомогти власноручне складання її фізичної моделі.

Дитячі конструктори чудово підходять для збирання моделей молекул, включаючи ДНК.Один із авторів цієї книги (Артур Віггінз) скористався набором конструктора K"NEX для складання моделі ДНК, яку на рис. 1.4 тримають у руках діти, які допомагали йому в цій справі.

Ця модель зібрана на основі набору K"NEX 32 Model Building Set в коробці Blue Value Tub (34006), яку можна придбати за 30 або 40 доларів (див. www.knex.com).

Рис. 1.4. Модель ДНК, яку тримають у руках Рей, Мелісса та Тім Ноу (онуки А. У. Віггінза)

Посібник зі збирання молекули ДНК можна подивитися на вузлі Всесвітнього Павутиння http://c3.biomath.mssm.edu/knex/dna.models.knex.html

Після завершення роботи ви отримаєте частину молекули ДНК, що містить 48 пар основ. У довжину вона становитиме близько 1 м.

Модель, що вийшла, трохи відрізняється від справжньої ДНК. У моделі кожен синій стрижень знаходиться під кутом 20° до попереднього стрижня, тоді як водневі зв'язки у цій ДНК паралельні в межах 6°. Однак модель показує окремі повороти спіралі, велику та маленьку борозенки та парні основи А-Т та Ц-Г Вотсона-Кріка.

При складанні даної моделі ви зможете побачити дію lac-оперону з розщеплення двох ниток ДНК в ході реплікації та роботу рестрикційних ферментів, що розрізають ДНК у певних місцях завдяки «підганянню» цих ферментів до молекул.

Кодони

Майже всі форми життя Землі використовують і той ж генетичний код, ключем до якого служать кодони. Якщо нуклеотидні підстави в ДНК подати у вигляді букв генетичного коду, то кодони будуть словами, а ген - послідовністю кодонів, що утворюють речення. Згідно з основним посилом (центральна догма) [занесеного] в ген виразу (експресії гена), повідомлення від ДНК записується на мРНК (матричну РНК), яке потім переноситься на білки.

Для з'ясування роботи кодонів розглянемо докладно.

♦ Послідовність нуклеотидних основ, що містяться в ДНК, задається чергуванням аденіну, тиміну, цитозину і гуаніну, які зазвичай позначаються буквами А, Т, Ц і Г.

♦ мРНК переписує нуклеотидні основи ДНК у тому самому порядку на рибосому, лише замінивши тиміну урацил. У рибосомі відбувається складання білків нанизуванням одна на одну амінокислот (див.: Список ідей, 5. Амінокислоти). Порядок проходження амінокислот у білку визначає тРНК (транспортна РНК), що передає вихідний порядок проходження нуклеотидних основ у ДНК.

Але яким чином чотири нуклеотидні підстави визначають, яку з 20 амінокислот необхідно брати при побудові білка?

♦ Якби кожна нуклеотидна основа задавала одну амінокислоту, можна було б зібрати лише чотири амінокислоти.

♦ Якби дві нуклеотидні основи спільно задавали одну амінокислоту, виходило б 4 2 = 16 амінокислот.

♦ Якби три нуклеотидні основи спільно задавали одну амінокислоту, можна було б отримати 4 3 = 64 амінокислоти, а цього більш ніж достатньо. Таким чином, кодон повинен являти собою триплет - три підстави, що йдуть разом.

Трійкова природа кодону знайшла досвідчене підтвердження в 1961 завдяки роботі Френсіса Крику.

З'ясуванням питання, які триплети нуклеотидних підстав визначають амінокислоти, зайнявся в 1961 році американський біохімік Маршалл Ніренберг, який встановив, що УУ кодує амінокислоту фенілаланін.

Наступні досліди Ніренберга та інших вчених до 1966 допомогли встановити повну відповідність між кодонами і амінокислотами.

У таблицях наводяться трилітерні кодони і відповідні їм амінокислоти, що приєднуються до РНК білкової молекули, а також нуклеотидні основи РНК (У, Ц, А і Г), а не ДНК (Т, Ц, А і Г). Ініціюючий [АУГ або ГУГ] та термінуючий [скор. терм; це УАА (охра-кодон), УАГ (бурштин-кодон) та УГА (опал-кодон)] [трансляцію]кодони вказують на початок та завершення транскрипції РНК.

Зауважимо, що більшість амінокислот задається не одним кодоном. Така надмірність нерідко означає, що та сама амінокислота задається незалежно від цього, яке азотисте основа перебуває третьому місці у кодоні. Оскільки саме третє положення часто неправильно зчитується, подібна надмірність зводить до мінімуму наслідки помилок у зчитуванні.

Сьогодні ми проведемо урок не лише ліплення, а й хімії, і зліпимо моделі молекул із пластиліну. Пластилінові кульки можна уявити, як атоми, а показати структурні зв'язки допоможуть звичайні сірники чи зубочистки. Таким методом можуть користуватися вчителі при поясненні нового матеріалу з хімії, батьки – під час перевірки та вивчення домашнього завдання і діти, які цікавляться предметом. Більш легкого та доступного способу створити наочний матеріал для уявної візуалізації мікрооб'єктів, мабуть, не знайти.

Тут представлені представники світу органічної та неорганічної хімії як приклад. За аналогією з ними можуть бути виконані й інші структури, головне - розбиратися в цьому різноманітті.

Матеріали для роботи:

• пластилін двох або більше кольорів;
• структурні формули молекул із підручника (за потреби);
• сірники або зубочистки.

1. Підготуйте пластилін для ліплення кулястих атомів, з яких будуть складатися молекули, а також сірники – для подання зв'язків між ними. Звичайно, краще показувати атоми різного сорту іншим кольором, щоб було зрозуміліше уявити конкретний об'єкт мікросвіту.

2. Щоб зробити кульки, відщипніть необхідну кількість порцій пластиліну, розімніть у руках і скачайте фігурки в долонях. Для ліплення органічних молекул вуглеводнів можна використовувати червоні кульки більшого розміру – це буде вуглець і сині меншого – водень.

3. Щоб зліпити молекулу метану, вставте в червону кульку чотири сірники так, щоб вони були спрямовані до вершин тетраедра.

4. Надягніть на вільні кінці сірників сині кульки. Молекула газу готова.

5. Підготуйте дві однакові молекули, щоб пояснити дитині, як можна отримати молекулу наступного представника вуглеводнів – етану.

6. З'єднайте дві моделі, прибравши один сірник і дві сині кульки. Етан готовий.

7. Далі продовжіть захоплююче заняття та поясніть, як відбувається утворення кратного зв'язку. Заберіть дві сині кульки, а зв'язок між вуглецями зробіть подвійний. Подібним чином можна зліпити всі необхідні заняття молекули вуглеводнів.

8. Такий самий спосіб підійде і для ліплення молекул неорганічного світу. Здійснити задумане допоможуть ті самі пластилінові кульки.

9. Візьміть центральний атом вуглецю – червону кульку. Вставте в нього по два сірники, задаючи лінійну форму молекули, на вільні кінці сірників прикріпіть дві сині кульки, які в даному випадку уособлюють атоми кисню. Таким чином, ми маємо молекулу вуглекислого газу лінійної будови.

10. Вода - це полярна рідина, а її молекули є кутовими утвореннями. Вони складаються з одного атома кисню та двох атомів водню. Кутова будова задає неподілена пара електронів на центральному атомі. Її також можна зобразити у вигляді двох зелених крапок.

Ось такі цікаві творчі уроки обов'язково потрібно практикувати з дітьми. Учні будь-якого віку зацікавляться хімією, краще розумітимуть предмет, якщо в процесі вивчення їм надати наочний посібник, виконаний своїми руками.

Ви хочете зробити свою власну модель ДНК – основного структурного елемента життя? Тоді випустіть на волю свого внутрішнього творця і створіть модель ДНК із полімерної глини або дроту з намистинками, щоб у вас вийшла модель, яка обов'язково займе перше місце на будь-якій науковій виставці.

Метод 1 із 2: Створення моделі з глини

Придбайте матеріали та інструменти.Щоб зробити модель ДНК з глини, для початку знадобиться купити будь-яку вподобану вам глину. Ви зможете зробити модель, якщо у вас буде полімерна глина мінімум шести кольорів, а також інструменти, якими ви формуватимете глину (наприклад, пластиковий ніж або качалка).

• Якщо ви плануєте експонувати модель на виставці, підготуйте підставку, на яку ви зможете поставити її. Це може бути невелика дерев'яна дошка зі стрижнем, що виходить із її центру, до якого кріпитиметься нитка ДНК.
• Після того як ви закінчите формувати полімерну глину, вам потрібно буде запекти її, тому переконайтеся, що у вас є духовка в робочому стані.
• Щоб забезпечити додаткову підтримку моделі ДНК, ви можете використовувати в ній гнучкий дріт.
1. 
   

   Створіть дві довгі нитки, які будуть подвійною спіралью.Виберіть полімерну глину одного з вибраних вами кольорів і скачайте її в два шматки довжиною 30 сантиметрів і товщиною півтора сантиметри. З них будуть сформовані бічні нитки ДНК, тому необхідно забезпечити їхню міцність, щоб можна було надійно прикріплювати до ниток інші деталі.

   • Щоб додати додаткову стійкість моделі, можна обернути глину навколо двох довгих шматків гнучкого дроту.
   • Ви можете вільно змінювати розмір нитки моделі ДНК, щоб вона відповідала всім вашим вимогам. Для того, щоб створити коротшу модель, просто зменшіть розмір ниток подвійної спіралі.
2. 
   

   Додайте цукор та фосфатні групи.Нитки подвійних спіралей ДНК складаються з груп двох типів: цукру та фосфатів. Використовуйте одну з ваших кольорових полімерних глин, щоб сформувати фосфатні групи на подвійній спіралі.

   • Розкачайте глину вибраного для фосфатних груп кольору до того часу, поки вона стане плоскою. Наріжте смужки глини довжиною та шириною по півтора сантиметри.
   • Починаючи з нижньої частини довгих смужок подвійної спіралі, обертайте навколо нитки шматки фосфатної плоскої глини.
   • Переконайтеся, що вони добре втиснуті в нитку спіралі і не відпадуть.
   • Пропускайте між шматками фосфатної глиною на нитки по півтора сантиметри порожнього місця. Порожній простір у нитках подвійної спіралі є групи цукрів.
   • Продовжуйте чергувати глину цукрів та фосфатів на відстані півтора сантиметра один від одного, поки ви не заповните обидві нитки подвійної спіралі.
3. 
   

   Це - чотири азотисті основи, які складають нитку ДНК: цитозин, гуанін, аденін та тимін. Вони утворюють поперечини "сходів" між двома нитками подвійної спіралі. Виберіть по одному кольору полімерної глини для кожної з чотирьох основ.

   • Скачайте глину кожного кольору в шматки по півтора сантиметра завдовжки та півсантиметра завширшки. Використовуйте ніж, щоб відрізати краї та надати поверхні гладкості.
   • Підрахуйте кількість створених вами груп цукрів на нитки подвійної спіралі. Це кількість пар азотистих основ, яку вам потрібно буде зробити.
   • Розподіліть ваші кольори попарно на відповідні групи. Цитозин і гуанін завжди повинні бути разом (у будь-якому порядку), так само як і тимін з аденіном.
   • Якщо ви хочете дати вашим азотистим основам більшу стійкість, наріжте шматочки гнучкого дроту довжиною близько двох з половиною сантиметрів і використовуйте їх як центральні частини глиняних основ.
   • Об'єднуйте пари кольорів, защипуючи краї ваших півторасантиметрових шматочків. Як тільки кольорові шматочки будуть з'єднані посередині, акуратно скачайте в один гладкий цільний шматок глини.
4. 
   

   Прикріпіть азотисті основи до подвійної спіралі.Як тільки ви зробите всі 2,5-сантиметрові відрізки азотистих основ, ви повинні прикріпити їх до подвійної спіралі.

   • Починайте з першої групи на подвійну спіраль. Використовуйте маленькі шматочки глини розміром із горошину того ж кольору, що й група цукру.
   • Прикріпіть одну із азотистих основ до цукру з використанням невеликого шматочка глини. Защипніть шматочки глин і розгладьте краї, скачати їх пальцями.
   • Найлегше буде прикріпити всі шматочки азотистих основ на одній стороні лише однієї з ниток подвійної спіралі. Потім, коли з однієї нитки подвійної спіралі виходитимуть усі 2,5-сантиметрові основи, прикріпіть другу нитку до протилежної сторони.
   • Переконайтеся, що всі деталі міцно скріплені. Якщо ви вклали у ваші азотисті основи в дріт, то ви можете встромити кінці дроту в нитки подвійної спіралі, щоб краще закріпити їх.
5. 
   

   Вигніть подвійну спіраль.Щоб надати вашій моделі ДНК класичну спіральну форму, утримуйте подвійну спіраль за обидва кінці і поверніть їх проти годинникової стрілки.

6. 
   

   Запечіть вашу модель.Дотримуйтесь інструкцій на упаковці полімерної глини, а потім запікайте вашу модель, щоб затвердити її.

   • Якщо у вас є папір, запікайте модель на ній, щоб модель не прилипла до листа.
   • Завжди давайте моделі охолонути, перш ніж витягувати її, інакше можна обпектися.
7. 
   

   Як тільки модель запечеться та охолоне, продемонструйте плоди своєї праці! Повісьте її на стелю за допомогою волосіні, або прикріпіть її до дерев'яної підставки.

Метод 2 з 2: Створення моделі з дроту та намистин

1. 
   

   Зберіть матеріали.Для цього проекту вам знадобиться кілька метрів гнучкого дроту, кусачки та бусинки на ваш вибір.

   • Якщо ви хочете підвищити рівень якості своєї моделі, то для міцного приєднання деталей один до одного можна використовувати паяльник.
   • Ви можете використовувати будь-які намистинки, проте скляні намистини нададуть моделі красивішого вигляду. Якщо хочете, ви можете додати бісер як роздільник між великими бусинами.
   • Щоб відповідати бажаному розміру моделі, вам необхідні бусинки в достатній кількості мінімум шести кольорів.
   • Якщо ви збираєтеся виставити вашу модель на огляд, зробіть підставку з дерева, до якої можна буде прикріпити вашу модель.
2. 
   

   Зробіть подвійну спіраль.Вона являє собою дві довгі бічні нитки, які утримують всю молекулу ДНК і надають їй форму драбинки. Відріжте два шматки дроту рівної довжини. Ці шматки послужать остовом моделі ДНК, тому їх довжину вибирайте в залежності від довжини всієї моделі.

   • Виберіть намистини двох кольорів і прикріпіть по одному на кожний кінець дроту. Протягніть дріт крізь намист другий раз, створивши петлю на кінцевій частині дроту. Це запобіжить зісковзування бусинок.
   • Поперемінно прикріплюйте намистини двох кольорів на дріт. Два кольори представляють цукор та фосфатні групи, які утворюють довгу частину подвійної спіралі.
   • Ви можете надягати одну або багато намистин кожного кольору, проте перевірте, щоб у на дроті у вас була однакова кількість намистин кожного кольору з двох.
   • Зробіть те ж саме для другого шматка дроту для подвійної спіралі, уважно стежачи за тим, щоб кольори двох бусинок (цукор і фосфати) на двох дротяних нитках, що лежали поруч, збігалися.
   • Залишіть зверху дроту 2,5 см незаповненого простору, щоб ви змогли прикріпити "поперечини сходів" у зазори між намистинами.
3. 
   

   Додайте "поперечини сходів".Підрахуйте кількість груп цукру, які ви зробили на подвійній спіралі, а потім наріжте шматочки дроту завдовжки 2,5 сантиметра у тій самій кількості.

   • Оберніть кінці одного шматка дроту навколо нитки подвійної спіралі біля намистини цукру. Зробіть це для всіх шматків дроту, щоб у вас вийшла повна нитка подвійної спіралі з шматками дроту, що стирчать з неї.
   • Якщо ви хочете зробити більш декоративну та міцну модель ДНК, скористайтесь паяльником, щоб припаяти шматочки дроту до нитки подвійної спіралі.
4. 
   

   Зробіть азотисті основи.Виберіть чотири інші кольори і надайте кожному з них азотисту основу. Гуанін і цитозин завжди розташовуються в парі, так само як і тимін з аденіном.

   • Щоб заповнити кожен дрібний шматок дроту, вам швидше за все знадобиться багато намистин, тому прикріплюючи намистинки до дроту, вибирайте їх рівні кількості, що відносяться до кожної азотистої основи.
   • Переконайтеся, що ви дотримуєтеся угруповання пар бусинок. Завжди нанизуйте цитозин і гуанін разом, як і тимін з аденіном. Однак ви можете розміщувати їх у будь-якому порядку та робити одних пар більше, ніж інших.
5. 
   

   Нанизайте ваші азотисті основи.Як тільки ви розділите всі ваші намистини, розмістіть їх на дротяних відгалуженнях, які виходять із нитки подвійної спіралі. Обов'язково залиште 1,5 см на кінці дроту для прикріплення її до іншої нитки подвійної спіралі.

6. 
   

   Прикріпіть другу нитку подвійної спіралі.Додавши всі намистини азотистих основ, приготуйте та прикріпіть другу нитку подвійної спіралі. Зорієнтуйте бічну сторону, щоб вона відображала першу азотисту основу, і прикріпіть шматочки дроту.

   • Ви можете обернути шматочки дроту навколо подвійної спіралі за допомогою тонкогубців. Прикріпіть ці дрібні шматочки дроту в тому самому місці, де ви зробили це для протилежної нитки подвійної спіралі.
   • Якщо можете, скористайтеся паяльником, щоб спаяти між собою останні шматочки дроту, при цьому модель вийде більш гладкою на вигляд.
7. 
   

   Надрукуйте кінці моделі.Щоб намистинки не випадали з моделі, закрутіть дріт на кожному кінці ниток подвійної спіралі в петлю. Ви також можете запаяти дріт у формі вузлів, щоб запобігти розсипу намистин.

8. 
   

   Вигніть подвійну спіраль.Щоб створити класичну спіральну форму нитки ДНК, візьміть її за кінці та акуратно поверніть проти годинникової стрілки.

9. 
   

   Виставте вашу модель на огляд.Як тільки ви додасте всі останні штрихи, ваша модель завершена! Повісьте її на підвісному пристрої або на стелі, або прикріпіть її до дерев'яної підставки, використовуючи трохи дроту або клею. Покажіть усім справу ваших рук!

• Якщо для створення моделі ДНК ви використовуєте духовку або паяльник, будьте обережні, щоб не обпектися.
• Обидва ці методи надто складні для дітей, тому, якщо ви робите модель для шкільного проекту, переконайтеся, що ваші помічники досягли достатнього віку, щоб не нашкодити собі під час роботи з матеріалами.

Що несе нашу генетичну інформацію) можна створювати всякі хитрі, плоскі та тривимірні штуки нанометрового розміру. Та сама нанотехнологія, як вона є. У цьому огляді я хочу розповісти про розвиток ДНК-орігамі: двомірні смайлики з ДНК, тривимірні фігури, кристали із ДНК із запрограмованою структурою, ДНК-«коробочки» з кришкою, здатні нести молекули потрібних речовин і випускати їх після сигналу про відкриття кришки, та , нарешті, динамічні структури типу ДНК-кроку (walker), що гуляє по підкладці (творці гордо кажуть, що це вже наноробот!). Хто хоче дізнатися більше про те, навіщо все це потрібно, почитати про технології виготовлення красивих нанометрових штук із ДНК або просто подивитися гарні картинки, ласкаво просимо під кат.

Так виглядає ДНК-наноробот

Трохи теорії

У 1953 році Вотсон і Крик опублікували свою модель структури ДНК, яка виявилася абсолютно вірною. ДНК (дезоксирибонуклеїнова кислота) – це цікаво влаштований лінійний полімер. Одна нитка ДНК складається з монотонно повторюваного цукрово-фосфатного кістяка (він асиметричний і має напрямок, розрізняють 5" і 3" кінець ланцюга), проте до кожного цукру (дезоксирибозе у разі ДНК) прикріплений один із чотирьох нуклеотидів (синонім слова нуклеотид - «основа ») - аденін, або тимін, або цитозин, або гуанін. Зазвичай їх позначають однією літерою - А, Т, Ц, Г. Таким чином, у ДНК є лише 4 типи мономерів, на відміну від 20 амінокислот у складі білка, що робить структуру ДНК набагато простішою. Далі стає ще веселіше – є так зване «Уотсон-Криківське спарювання основ»: аденін може специфічно зв'язуватися з тиміном, а гуанін – з цитозином, утворюючи пари А-Т та Г-Ц (і ще Т-А та Ц-Г, зрозуміло ), Інші взаємодії між нуклеотидами у спрощеному випадку можна вважати неможливими (вони можливі як виняток за деяких рідкісних умов, але для нас це не важливо). Уотсон-Криківське парування основ ще називається комплементарністю.

Два ланцюги ДНК, послідовність основ яких комплементарна, негайно «злипаються» у подвійну спіраль. Виникає питання: а що, якщо на одному ланцюгу ДНК знаходяться дві комплементарні області? Відповідь: ланцюг ДНК може зігнутися і комплементарні області зможуть утворити подвійну спіраль, а разом із місцем вигину ця структура називатиметься «шпилькою» (DNA hairpin):

На чому ж ґрунтується «злипання» двох комплементарних ланцюгів ДНК (або, аналогічно, двох комплементарних ділянок одного ланцюга)? Ця взаємодія тримається на водневих зв'язках. Пара А-Т з'єднується двома водневими зв'язками, пара Г-Ц - трьома, тому ця пара більш енергетично стійка. Про водневі зв'язки треба розуміти наступне: енергія одного водневого зв'язку (5 ккал/моль) не набагато перевищує енергію теплового руху, а отже, окремо взятий водневий зв'язок може бути з високою ймовірністю тепловим рухом зруйнована. Проте, що більше водневих зв'язків, то стійкішою стає система. Це означає, що короткі ділянки комплементарних підстав ДНК що неспроможні утворити стійку подвійну спіраль, вона легко «плавитися», проте довші комплементарні ділянки вже зможуть утворити стабільні структури. Стабільність дволанцюжкової структури виражається одним параметром – температурою плавлення (Тм, melting temperature). За визначенням, температура плавлення - це температура, при якій у рівновазі 50% молекул ДНК з даною довжиною та послідовністю нуклеотидів знаходяться у дволанцюжковому стані, а інші 50% - у розплавленому одноланцюжковому стані. Очевидно, що температура плавлення безпосередньо залежить від довжини комплементарної області (чим довша - тим вище температура плавлення) і від нуклеотидного складу (оскільки в парі Г-Ц три водневі зв'язки, а в парі А-Т - два, то чим більше пар Г -Ц, Тим вище температура плавлення). Температура плавлення для даної послідовності ДНК легко вважається за емпірично виведеною формулою.

Від теорії до практики

Двовимірні структури з ДНК

Як із хімічно синтезованих ДНК зібрати потрібну нам структуру? Тут на допомогу приходить процес плавлення. Ми беремо пробірку з водяним розчином, кидаємо в неї всі фрагменти ДНК і нагріваємо до 94-98С, температури, яка гарантовано плавить всю ДНК (переводить її в одноланцюжкову форму). Далі ми просто дуже повільно (протягом багатьох годин, у деяких роботах - протягом декількох днів) охолоджуємо пробірку до кімнатної температури (ця процедура називається відпал, annealing). При цьому повільне охолодження, коли температура виявляється досить низькою, поступово утворюються потрібні нам дволанцюжкові структури. В оригінальній роботі у кожному експерименті приблизно 70% молекул успішно збиралися у потрібну структуру, решта мали дефекти.

Далі після того, як структура розрахована, непогано б довести, що вона збирається саме так, як нам треба. Для цього найчастіше використовують атомно-силову мікроскопію, яка чудово показує загальну форму молекул, але іноді використовують і cryo-EM (електронну мікроскопію). Автор зробив безліч веселих форм із ДНК, на картинках представлені розрахункові структури та результат експериментального визначення структур за допомогою атомно-силової мікроскопії. Насолоджуйтесь!

Тривимірні структури з ДНК

Октаедр був зроблений з одноланцюгової молекули ДНК довжиною приблизно 1700 нуклеотидів, що має комплементарні області і до того ж скріпленою п'ятьма 40-нуклеотидними ДНК-адаптерами, в результаті отримано октаедр з діаметром 22 нанометра.
На малюнку зверніть увагу на колірне кодування на двовимірній розгортці октаедра. Чи бачите області, позначені однаковим кольором? Вони містять як комплементарні зони (паралельні ділянки з'єднані поперечними зв'язками), так і некомплементарні (на схемі вони зображені у вигляді бульбашок), при цьому зони одного кольору, розташовані в різних частинах двовимірної розгортки, взаємодіють один з одним, утворюючи складну структуру, зображену на малюнку 1с і утворює грань тривимірного тетраедра. Насолоджуйтесь красивими картинками!

У 2009 році вчені з Бостона та Гарвардського Університету опублікували принципи побудови тривимірного ДНК-орігамі, як вони самі кажуть, на кшталт бджолиних сот. Одне з досягнень цієї роботи – люди написали для конструювання тривимірних структур ДНК (вона працює на Autodesk Maya). З цією програмою навіть нефахівець може зібрати потрібну структуру з готових блоків з використанням простенького графічного інтерфейсу, а програма розрахує необхідну послідовність (або послідовності) ДНК, що згортається в цю структуру.

PPS:у личку запитали, чому ДНК, а чи не РНК. Відповідь така: я бачу дві основні причини: (1) ДНК - хімічно більш стабільна. Всі живі організми синтезують величезну кількість РНКаз, ферментів, що знищують РНК. Якщо Ви випадково залізете голим пальцем у пробірку з РНК, від РНК нічого не залишиться – усі зжеруть РНКази. Тому з РНК працюють у спеціальних приміщеннях і тд – мороки набагато більше, ніж при роботі з ДНК. З ДНК таких проблем немає, палець у пробірку сунеш – нічого ДНК не буде. (2) Вартість хімічного синтезу РНК у рази перевищує вартість синтезу ДНК. Думаю, тому народ і розважається з ДНК – дешевше та простіше.

Теги: Додати теги

Всім привіт мене звуть Олександр Соколов, і я хочу розповісти, як зробив удома секвенатор – прилад для розшифровки ДНК. Ринкова вартість такого приладу становить близько 10 мільйонів рублів.

Короткий екскурс у генетику. Якщо раптом ви пам'ятаєте, 2003 р. було зроблено сенсаційну заяву: вчені нарешті розшифрували геном людини. Геном побудований із ДНК, а ДНК – це вихідний код організму. ДНК є подвійний ланцюжок, що складається з 4-х видів нуклеотидів, які повторюються в геномі людини близько 3 млрд. разів. Так само, як у бітах зашифровано всю інформацію на вашому комп'ютері, в нуклеотидах зашифровано інструкцію про збирання всіх білків людського тіла. Тобто знаючи, в якій послідовності розташовані нуклеотиди в ДНК, ми теоретично можемо зібрати всі необхідні білки та отримати модель людини. Так ось у стандартному розумінні вчені не розшифрували ДНК, а просто перевели хімічну послідовність у набір нулів та одиниць на комп'ютері. Що робити з цим далі – окрема розмова. Наприклад, зараз нам зрозуміла функція лише 5% всього масиву геному (це кодування білків). Чим займаються решта 95%, можна лише припускати.

2003 року вартість секвенування ДНК людини становила близько 100 млн доларів. З часом ця цифра зменшувалась і зараз вона наближається до тисячі доларів. Ви платите, вашу ДНК секвенують і віддають вам жорсткий диск із 3 ГБ інформації – вашим геномом у цифровому вигляді.

Сьогодні на ринку представлено три основні секвенатори. Найпродуктивніший Hiseq і його приймач NovaSeq забезпечує найдешевше (флуоресцентне) секвенування. Один його запуск триває кілька днів, і за цей час обробляються геноми одразу кількох людей. Однак сам запуск коштує близько десятка тисяч доларів. До речі, і сам прилад коштує близько $1 млн, а оскільки застаріває він приблизно за 3 роки, для того, щоб він окупився, він повинен приносити вам $1000 на день.

Другий прилад з'явився на ринку буквально минулого літа. Він називається Nanopore та базується на дуже цікавій технології, коли ДНК секвенується шляхом пропускання через нанопору. Найдешевший варіант Nanopore позиціонується як одноразовий домашній секвенатор і коштує $1000.

Третій прилад – PGM, напівпровідниковий секвенатор, який коштує $50 000 у себе на батьківщині та близько 10 млн рублів (з доставкою, розмитненням тощо) у Росії. Процес секвенування на ньому займає близько кількох годин.

Що ж, десять мільйонів у мене не було, а PGM захотілося. Довелося зробити самому. Спочатку коротко про те, як відбувається напівпровідникове секвенування. Весь ланцюжок ДНК ділиться на фрагменти довжиною по 300-400 нуклеотидів, які називаються рідами. Потім риди прикріплюються до дрібних сфер і багаторазово копіюються – у результаті кожному сфері «висить» цілий пучок однакових фрагментів ДНК. Копіювання необхідне посилення сигналу від кожного конкретного рида. Набір різних галузей називається бібліотекою ДНК.

Серцем PGM є одноразовий чіп - матриця, схожа на матрицю у фотокамері, тільки замість пікселів, що реагують на світло, тут pH-транзистори, що реагують на зміну кислотно-лужного балансу. Отримана бібліотека ДНК завантажується на чіп, що містить 10 млн. лунок, на дні кожної з них знаходиться рН-транзистор. У лунку вміщується лише одна сфера і, отже, риди лише одного типу (з однією певною послідовністю нуклеотидів). Далі на чіп подаються реагенти таким чином, щоб ДНК почала копіювати себе. А копіюється вона лінійно, тобто нуклеотиди прикріплюються до новоствореного ланцюжка в тому порядку, в якому вони стоять у материнському ланцюжку. Тому на чіп подається один тип нуклеотидів - і відразу фіксується зміна pH в деяких лунках (це означає, що в них відбулося приєднання даного нуклеотиду). Далі подається інший тип нуклеотидів і фіксується зміна pH в лунках і т. д. Таким чином, подаючи на чіп всі чотири типи нуклеотидів багато разів, ми можемо отримати інформацію про послідовність нуклеотидів у кожному ріді. Потім математичними способами прочитані короткі відрізки збираються на комп'ютері в єдиний ланцюжок. Щоб зібрати її більш-менш упевнено, кожен рід потрібно прочитати приблизно по 100 разів.

Рис.1. Напівпровідникове секвенування

Тепер розберемося, що складається сам прилад. Є, як ми знаємо, чіп, і навіть система подачі реагентів і материнська плата. Все секвенування ведеться саме на чіпі - решта апарата тільки передає на нього певні сигнали, подає реагенти, зчитує з нього аналогові сигнали, оцифровує їх і жене отриманий потік інформації на комп'ютер, де дані накопичуються і обробляються.

Рис. 2. Влаштування секвенатора

Чіп позиціонується як одноразовий і після використання викидається. Відповідно, там, де працює PGM, такі чіпи можна отримати безкоштовно в будь-якій кількості. Навіщо їх діставати, спитаєте ви? Справа в тому, що чіп мені вже вдалося використати багаторазово. Насправді він вічний: досить добре промивати його - і можна використовувати знову і знову. За точністю роботи він нічим не відрізнятиметься від нового. Сама моя ідея полягала в тому, щоб зробити пристрій під цей умовно безкоштовний чіп.

Отже, переді мною постало завдання реверс-інжинірингу чіпа. Зрозуміло, ніякої документації на заповітну мікросхему знайти не можна було – виробник не збирався ділитися секретами виробництва, а хотів спокійно продавати свої прилади за $50 000. Для початку я зробив найочевидніше і найпростіше: продзвонив контакти тестером. Стало зрозуміло, де розташовані цифрові та аналогові входи-виходи, живлення та інше. Деяку інформацію вдалося отримати з патентів на чіп. Але цього, зрозуміло, було замало створення повноцінного продукту. Я ще повозився з чіпом, перевіряв різні свої припущення, поекспериментував з подачею сигналів, але нікуди принципово не просунувся. Довелося поставити проект на паузу.

Рис. 3. Продзвонювання чіпа

А потім раптово на Habrahabr мені попалася стаття відомого блогера BarsMonster про те, як він робить реверс-інжиніринг чипів! Надихнувся, написав йому, написав іншим ентузіастам, відправив запит до Києва, де займалися фотографуванням чіпів. З Києва відповіли, що полірувати по шарах вони не вміють, можуть лише відзняти верхній шар, а оскільки мій чіп – багатошаровий, буде не зрозуміло, куди йдуть доріжки від контактів. Потім познайомився з одним американцем, який теж займається реверс-інжинірингом чіпів, надіслав йому свої мікросхеми, але й тут далі фотографування верхнього шару справа не пішла. Потім натрапив в інтернеті на статтю про тих, хто зміг відреверсувати чіп Sony PlayStation та ін. («Слава героям!» і ось це все, якщо хтось в курсі). Вирішив написати їм із запитаннями, знайшов їх ніки – і відразу зрозумів, що один із них мені знайомий. Нещодавно товариш звів мене зі своїм другом, який "теж займається генетикою на аматорському рівні", ми поспілкувалися з цим другом у Skype і на цьому діалог закінчили. І ось я розумію, що мій новий приятель – мегакрутий майстер реверс-інжинірингу чипів. Відразу написав йому. Проте з'ясувалося, що хоч допомогти він і готовий, він не має мікроскопа. Знову глухий кут.

А за кілька місяців потрібний мікроскоп знайшовся в сусідній лабораторії! Щоправда, вбудована камера була жахливою, я фотографував на мобільний телефон через окуляр і отримував знімки ось такої якості:

Рис. 4. Чіп під мікроскопом

Потім на останній Новий рік чудовий мікроскоп за 130 тис. з'явився у мене на роботі (я – фахівець із квантової криптографії). Мрії збуваються. Зрештою, я зміг нормально сфотографувати чіп зверху.

Рис. 5. Мій робочий мікроскоп

А потім… Потім мені таки довелося самому освоїти техніку полірування. Проблема полірування полягає в тому, щоб знімати шари металу товщиною близько 1 мікрона – при цьому ширина чіпа становить 1 сантиметр. Для порівняння скажу, що це приблизно те, що допустити на 1 км похибка не більше 10 см. Я дуже старався. Результати моїх праць представлені на наступному фото:

Рис. 6. Реверс-інжиніринг під оптичним мікроскопом

Досить добре видно нижній кремнієвий шар, верхній шар з транзисторами, перший, другий, третій та четвертий шари металу.

Чіп складається з зон (типу зсувних регістрів), що повторюються, і за такими картинками було дуже зручно його аналізувати: відразу ставало ясно, що відбувається на різних шарах. Я «відреверсив» найбільш «нафаршировані» ділянки з великою кількістю логіки, які багато разів повторювалися. Але найскладнішим виявилося відстежити траси, що йдуть по всьому чіпу, зрозуміти, який зовнішній контакт до чого належить. З новорічних свят до кінця лютого, я, озброївшись новим чудовим мікроскопом, корпів над цим завданням – сидів на роботі до десятої ночі, «реверсив», думав. І тут сталося нове диво: товариш зміг організувати безкоштовну фотозйомку чіпа шарами на електронному мікроскопі в МИРЕА. «Фотосесія» крихти в 1 кв. см була 50 ГБ чорно-білих фотографій.

Тепер усі ці окремі фотографії потрібно було якимось чином об'єднати в одне ціле зображення. Чи не того ж дня я написав на «пітоні» програму, яка генерувала HTML-файл – при його відкритті в браузері я отримував необхідне. (До речі, найстаріша 10-а Opera впоралася з цим найкраще, рекомендую!) Потім на JavaScript написав ще одну програму, що дозволяє порівнювати шари, плавно переходити між ними, вирівнювати їх, підбирати масштаб і т. д. Нарешті, в моїх руках були всі інструменти на вирішення основних завдань. Я відстежив траси, що пронизують чіп, і відновив всю його структуру до останнього транзистора.

Ще одна фотографія зрізу чіпа, зроблена під рентгеном (у МИРЕА):

Рис. 7. Зйомка під електронним мікроскопом

Добре видно лунки, куди потрапляють сфери з рідами. Нижче розташовуються три шари металу, а ще нижче – шар із транзисторами.

Наступним етапом боротьби світле майбутнє стало створення під чіп материнської плати. Спроектував її та відправив замовлення на виробництво. А поки що суд та справа використав для роботи з чіпом плату «Марсохід-2» з FPGA. (FPGA – це, грубо кажучи, масив із 10 000 універсальних логічних елементів; програмуючи FPGA, ми можемо отримувати будь-яку логічну схему, що легко обробляє гігабітні потоки інформації.) Прошивку для FPGA я написав сам, а крім того, для динамічного керування системою написав софт , який визначає всю конфігурацію для FPGA. Потім знову утворилася піврічна перерва (їздила у відрядження на Байкал, готувала в лабораторії установку, яку демонстрували Путіну). Але зрештою зірки зійшлися: у мене з'явився час, приїхали готові плати – і я зібрав свою систему.

Рис. 8. Створення «заліза»

Подав усі необхідні сигнали і – о, диво! – побачив на осцилографі сигнал із чіпа. (Осцилограф я купив колись за 6 000 рублів на eBay, ще 1 000 коштувала прошивка до нього.) На картинці добре видно плями – крапельки якогось реагенту.

Рис. 9. Сигнал із чіпа на осцилографі

Тепер мені потрібно було придумати, як оцифрувати цю картинку та передати її на комп'ютер. Я зібрав таку установку:

Рис.10. Схема приладу

Рис. 11. Готове встановлення

Є комп'ютер, який подає дані керування на плату з FPGA. Плата генерує цифрові сигнали та відправляє їх на чіп. Сигнал із чіпа йде на підсилювач, далі – на АЦП на платі, оцифровується та передається через COM-порт на комп'ютер. Взагалі, пропускна спроможність COM-порту невелика: 15 кілобіт в секунду (т. до. в одному чіпі знаходиться від 1 млн до 10 млн пікселів, а максимальна швидкість передачі - 115200 бод). Проте картинка на комп'ютер зрештою потрапляє.

Рис. 12. Оброблений сигнал на комп'ютері.

На фото вище видно, що коли на використаний б/у-шний чіп подається бібліотека ДНК, чіп заповнюється нерівномірно: по краях - меншою мірою. Різні кольори обумовлені різною напругою pH-транзисторах. Тобто ми можемо чітко розрізнити ті лунки, куди потрапили сфери з рідами – це допоможе нам контролювати промивання чіпа.

Відповідно, наступним завданням стало промивання чіпа. Потрібно було домогтися, щоб він став як новий. На щастя, у мене був зовсім новий чіп як референсний зразок. На іл. А видно, що в активній області такий чіп практично одного кольору (вертикальні смуги, що повторюються - це просто шуми, наведення).

Рис. 13. Промивання чіпа

На рис. 13 B невдало промитий чіп – він різнокольоровий. На рис.13 D – використаний, але добре промитий чіп. Видно, що градієнт з обох боків зник. Проте варто було б довести, що він дійсно чистий і може використовуватися повторно.

Оскільки бібліотеки ДНК прикріплюються до танталового покриття чіпа в кислому середовищі і відкріплюються – у лужному (тобто за високого pH), то чіп промивається за допомогою спеціальних напівавтоматичних піпеток розчинами з різними pH. На сьогоднішній день мені вдалося досягти практично повного очищення чіпа.

У мене цікавилися, чому, коли я повністю розібрався в структурі чіпа, я не став замовляти його виготовлення, а вважав за краще, як і раніше, шукати і діставати уживані, возитися з їх промиванням і т. п. Та тому, що розробка мікросхеми коштує величезних грошей, мільйони доларів, і солідна частина цієї суми йде на фізичне налагодження отриманого продукту: припасування, налаштування всіх параметрів транзисторів і т. д. Тобто просто скопіювати логічну схему - недостатньо. Тому я беру умовно безкоштовну, вже готову – спроектовану, виготовлену, налагоджену – мікросхему і таким чином заощаджую значні кошти, серйозно здешевлюю проект.

Наступним моїм завданням було зібрати більш розвинений прилад, який дозволяв би швидше передавати інформацію на комп'ютер і при цьому не складався б з величезної кількості окремих плат.

Рис.14 Розробка наступної версії приладу

Я взяв нову плату з FPGA – на тому ж кристалі тут було 2 ARM-ядра з Linux, був Gigabit Ethernet та інші «плюшки», зате, на відміну від попереднього варіанту, не було АЦП. Пізніше спроектував ще одну плату, з високошвидкісними АЦП та всіма іншими необхідними елементами. Запустив – усе запрацювало.

Що лишилося зробити для появи фінального приладу? Усього три речі.

Перше. Потрібен гігабітний інтернет, швидка передача даних на комп'ютер. Це я реалізував буквально вчора.

Друге. Система подачі реагентів. Проектування спеціального клапана вже у процесі.

Третє. Софт для обробки інформації із чіпа. З ПЗ поки що є питання, тому запрошую до співпраці програмістів.

Фінальний прилад коштує 10 млн. рублів. Собівартість секвенування становить кілька тисяч доларів. Чіпи обходяться від 100 до 1000 доларів - залежно від кількості пікселів в них. (До речі, відновлення чіпів саме собою може стати непоганим заробітком, особливо враховуючи, що для промивання потрібно зробити лише пару кліків.) Реагенти теж купуються, але в перспективі будуть створюватися і вони.

Загалом, все це дуже цікаво, але головне – за цим майбутнє. Сьогодні біотехнології посідають у світовому науково-технічному прогресі те саме місце, що комп'ютерні технології у 80-х роках. минулого століття. При цьому секвенування – один із ключових напрямків для сучасної біології та медицини. Ну і, звісно, ​​біотехнології – це дуже прибутково.

Останнім часом на ринку з'явився напівпровідниковий секвенатор S5, і найближчим часом я планую переключитися на нього.

Радий поспілкуватися з усіма, хто захоче тим чи іншим чином взяти участь у розвитку цього проекту!
Проект був би неможливий, без теоретичної підготовки