Что относится к матричному синтезу. Матричный синтез

Синтез Следующий, и, наверное, завершающий (почему завершающей, мы увидим ниже) всю западную политическую мысль, этап связан с диалектикой Гегеля.В логике вообще, говорит Гегель, смысл слова «единичность» познается только в отношении к «некоторости» и «множественности».

Это одна из интересных проблем молекулярной биологии, где много еще таких механизмов нерасшифрованно. В живом организме постоянно происходит наряду с распадом синтез белка. Метод линейных атомов позволил установить, что в состав клеток входит большое количество разнообразных белков и скорость синтеза их различны. Белки эритроцитов обмениваются в течении 2-3 месяцев, в тоже время белки уже обмениваются очень быстро, установлено, что основные белки нервной ткани обмениваются в течение 21 дня.

Белки в клетках органов и тканей вступает во взаимодействие с различными компонентами и поэтому в клетках должен существовать механизм, который бы обеспечивал безошибочный синтез белковых веществ. Это имеет значение для метаболических процессов.

Среди заболеваний связанных с нарушениями синтеза белка можно называть «альбинизм». Что происходит:

1) Нарушение процесса образования пигмента меланина, он вырабатывается в специальных клетках меланоцитах, которые находятся в коже, в волосных луковицах, сетчатке глаза. Прекращается выработка пигмента вследствие нарушения процесса превращения фенилаланина в тирозин. При альбинизме не вырабатывается фермент – тирозиназа. Он способствует образованию в дальнейшем пигмента меланина.

Признаки: молочно белый цвет кожи, светлые волосы, светлая радужной оболочки, депигментизация сетчатки, снижение остроты зрения (люди страдают, но живут)

2) Серповидноклеточная анемия происходит вследствие замены одной аминокислоты глу на вал и гемоглобин принимает форму серпа и не может выполнять свою функцию основную – транспорт О 2

Для того чтобы процесс биосинтеза белка проходил нормально необходимо:

1) Поток материи (аминокислоты из которых будут строится белки), обязательное присутствие незаменимых аминокислот. Поток должен быть как количественным так и качественным. Если с пищей наступает недостаточное количество незаменимых аминокислот, то наблюдается белковое голодание. Это приводит к нарушению азотистого равновесия (он становится отрицательный). Это важно учитывать при составлении рационов питания;

2) Поток энергии. Установлено, что синтез сложных веществ в организме протекают с потреблением источников энергии – энергии АТФ, ГТФ и и.д.;

3) Необходима информация о том, какой белок должен синтезироваться;

4) Необходимы непосредственные участники синтеза белка – различные типы РНК, позволяющие клетке синтезировать заданный белок. РНК – переносчик потока информации от ДНК к месту синтеза белка.

Начнем с общих механизмов синтеза ДНК

1) Корнберг в 1953 году предложил энзиматическим путем в безклеточной среде с участием ДНК - полимеразы

Открытие в 1960 одновременно в 2х лабораториях США фермента РНК полимеразы, катализирующего синтез РНК из свободных нуклеотилов. Способствовало расшифрованию механизма синтеза РНК.

Наиболее изучена РНК – полимераза прокариот Е.coli с АС 487000 состоит из 5 субъединиц.

РНК – полимеразы (называются ДНК – зависимой полимеразой) было установлено, что молекуле ДНК необходимы не только для реакции полимеризации, но что она определяет последовательность рибонуклеотидов во вновь синтезируемой молекуле РНК с заменой тимизинового нуклеотида ДНК на уридиловой в РНК. В общем еще синтез РНК можно представить так:

У Е. coli предполагают, имеется единственная ДНК зависимая РНК – полимераза, которая синтезирует все типы клеточных РНК. Менее изучены РНК – полимеразы эукариотов. Из клеток животных выделены 3группы РНК – полимераз А, В, С, которые принимают участие в синтезе соответственно рРНК, мРНК и тРНК.

Матричный биосинтез состоит из 3х этапов:

1. Биосинтез ДНК – репликация (механизм удвоения ДНК), репарация (ферментативные механизмы, обнаруживают и исправляют повреждения ДНК)

2. Транскрипция – биосинтез ДНК (тРНК, рРНК, мРНК)

3. Этап биосинтеза белка – трансляция

Биохимический смысл процессов репликации заключается в том, что они протекают в несколько этапов. (рис.1)

На первом этапе - инициации - происходит образование с участием ферментов (ДНК -хеликаз, ДНК - гираз) репликационных вилок, т.е. если мы имеем 2-х цепочную ДНК, то на определенном этапе одна из цепочек откручивается и ушедшая часть достраивается в виде антипараллельной цепи (рис. 1).

При инициации к цепям ДНК последовательно присоединяются ДНК - связывающие и ДНК - раскручивающие белки, а затем комплексы ДНК - полимераз и ДНК-зависимая РНК – полимераза (праймаза).

Второй этап. Процесс репликации ДНК подвергаются од­новременно обе цепи. Рост дочерних цепей осуществляется в направлении

5’ _____3’. Первая стадия осуществляется при помощи ДНК - полимеразы 111

далее принимает участие ДНК - полимераза 11 .Синтез на одной цепи идет не прерывно, а на другой фрагментарно (фрагменты Оказаки). Вторая стадия завершается отделением праймеров, объединением отдельных фрагментов ДНК при помощи ДНК - лигаз и формированием дочерней цепи ДНК.

Третий этап - терминация синтеза ДНК, наступает в результате обрыва цепи за счет исчерпывания ДНК матрицы. Точность репликации велика. Если будет ошибка, то она может быть исправлена в ходе репарационных процессов.

Рис.1 Схема основных этапов репликации ДНК (по Т.Т.Березову и Б.Ф.Коровкину)

Репарация ДНК и РНК.

Ряд экзогенных и эндогенных факторов приводят к различным повреж –дениям ДНК в клетке. В клетке существуют системы репарации ДНК. Это фер­ментативные механизмы, которые обнаруживают и исправляют повреждения.

Какие необходимы для этого условия?

1.Необходимо узнавание места повреждения ДНК (с помощью эндонуклеаз);

2.Удаление поврежденного участка (с помощью ДНК –гликозидаз);

3.Синтез нового фрагмента (ДНК – полимеразе репарирующая);

4.Соединение образования новых участков со старой цепью (фермент ДК -лигаза).

Транскрипция РНК.

Транскрипция отличается от репликации. При репликации реплицируется полностью одна из цепей ДНК, а при транскрипции транскрибируется
отдельные гены. Поэтому каждый ген ДНК несет свою информацию.

Процесс образования мРНК на ДНК - затравке возможен только на функционирующей ДК. Процесс транскрипции - многоступенчатый. До открытия феномена сплайсинга (созревание, сращивание) мРНК было известно, что многие мРНК эукариот синтезируются в еще гигантских высокомолекулярных предшественников (пре - мРНК), которые уже в ядре подвергаются посттранскрипционному процеосингу . Оказалось, что ген у эукариотов имеет сложное мозаичное строение. Он включает в себя участки, несущие информацию, это кодирующие - экзоны и участки не несущие информации, т.е. ничего не кодирующие - интроны . Отсюда и возникло понятие об экзонинтронной структуре (рис. 2).

Фермент ДНК - зависимая РНК - полимераза катализирует транскрипцию как экзонов так и интронов с образованием гетерогенной ядерной РНК (гя РНК) называемой также первичным транскриптом. Интроны вместе с экзонами транскрибируются; однако еще в ядре интроны вырезаются малыми ядерными РНК (мя РНК), что приводит к образованию функционирующей мРНК. Ферментативный процесс удаления интронов из РНК - транскрипта и объединение (соединение), соответствующих экзонов получил название - сплайсинга .

Последовательность нуклеотидов в молекуле мРНК начинается с пар ГУ (5"- конец) и заканчивается парой АГ (3" - конец). Эти последователь­ности служат сайтами (местами) узнавания для ферментов сплайсинга.

Кэпирование (КЭП) сводится к присоединению 7 метилгуанозина с помощью трифосфатной связи к 5" концу мРНК, считают, что "НЭП" участвует в узнавании подходящего сайта на молекуле мРНК и, возможно, защищает саму молекулу от ферментативного распада.

Полиаденилирование заключается в последовательном ферментативном присоединении от 100 до 200 остатков АМФ к 3" концу мРНК. Функция этого процесса окончательно изучена, но считают, что этот процесс защищает мРНК от гидролиза клеточными РНКазами.

Процессинг, сплайсинг, кэпирование, полиаденилирование - процессы обеспечивающие синтез молекулы РНК, состоящие лишь из экзонов.

Все типы РНК (рРНК, тРНК, мРНК) синтезируются сходным образом.

Поэтому для любой молекулы РНК, имеющейся в организме можно найти участок ДНК, которому она комплементарна. Но все же в синтезе различных видов имеются некоторые особенности.

мРНК - синтезируется гораздо большего размера, чем требуется для синтеза белка. Так белок иммуноглобулин включает тяжелую цепь, кодируется 1800851 нуклеотидными остатками, из них непосредственно структуру белка кодирует 1300 нуклеотидных остатка.

тРНК - синтезируется также как и мРНК, но при этом синтез идет из большего предшественника. Этот процесс подвергается сплайсингу при учас­тии ферментов цитоплазмы.

рРНК - бывает нескольких типов. У прокариотов синтез рРНК трех ти­пов 235, 16S , 5S . Они образуются из длинного предшественника пре - рРНК. Из них идет образование одной из субъединиц рибосомы.

Таким образом транскрипция - многоступенчатый процесс, в результате которого синтезируются все виды РНК.

Биосинтез белка (трансляция).

Генетический текст при трансляции переводится в линейную последовательность аминокислот полипептидной цепи белка.

Процесс трансляции можно разделить на два этапа, которые имеют разную локализацию в клетке: рекогниция (узнавание аминокислот) и собственно биосинтез белка. Рекогниция протекает в цитоплазме, а биосинтез белка протекает в рибосомах.

Рекогниция,или узнавание аминокислот. Сущность узнавания аминокислот состоит в том, чтобы соединить аминокислоту со своей тРНК. Структура тРНК обладает качествами потенциального "переводчика", так как в одной молекуле совмещены способности ""читать"" нуклеотидный текст (антикодон тРНК специфически спаривается с кодоном мРНК и нести (на акцепторном конце) свою аминокислоту. Специальные ферменты обеспечивают узнавание тРНК своей аминокислоты. Эти ферменты получили название аминоацил - тРНК - синтетаз (АРСазы). Аминокислоты при этом должны быть активированы, активация осуществляется также при помощи АРСаз. Этот процесс протекает в 2 стадии:

Рибосомы, не участвующие в синтезе белка легко диссоциируют на субъединицы. В клетке рибосомы или находятся в свободном состоянии или связаны с мембранами эндоплазматической сети. Свободное перемещение рибосом в различные участки клетки или соединение их в разных местах с мембранами эндоплазматического ретикулума, очевидно, дает возможность соби­рать белки в клетке там, где это нужно.

Биосинтез белков отличается от других типов матричных биосинтезов-репликации и транскрипции - двумя особенностями:

1) Нет соответствия между числом знаков (мономеров) в матрице и продуктов реакции в мРНК 4 разных нуклеотида, в белке 20 разных аминокислот;

2) Структура рибонуклеотидов (мономеров матрицы) и аминокислот (мономеров продукта) такова, что между мРНК (матрицей) и полипептидной цепью белка (продуктом) нет комплементарности.

Синтез белка или трансляцию делят на 3 фазы: инициацию (начало), элонгацию (удлинение полипептидной цепи), терминация (окончание).

В настоящее время установлено, что для начала синтеза белка существует специальный инициирующий комплекс (формил мет тРНК и мРНК связанные с несколькими молекулами белка ГТФ). Происходит взаимодействие между кодонами мРНК и антикодонами формил мет РНК. (рис.3)

Вначале инициирующая формил мет РНК связывается с большой субъединицей рибосомы в участке П (пептидильный центр). Следующая аминокислота в виде алат РНК связывается в участке А (аминоацильный центр). Рибосомы за счет взаимодействия антикодона ала тРНК и кодона мРНК. В результате «NH 2 » этой аминокислоты оказывается вблизи от «СООН» группы первой аминокислоты с помощью пептидотрансферазы образуется пептидная связь в участке А. Образовавшийся дипептид переносится транслоказой из участка А в участок П, вытесняя оттуда тРНК, которая вновь может вступать во взаимодействия с другой аминокислотой, необходимо участие ГТФ. Под действием пептидтрансферазы пептидная цепь с учатска П переносится на участок А. Рибосома сдвигается и против А участка становится новый кодон мРНК. На этом один рибосомальный цикл завершается. Процесс синтеза белка продолжается до тех пор, пока к А участку не подойдет бессмысленный кодон (УАГ, УАА, УГА). На этом синтез белка заканчивается и синтезируемый пептид с участка П отделяется от поверхности рибосомы.

Большинство синтезируемых белков остается в клетке, а часть уходит путем экзоцитоза. Для этого требуется энергия АТФ, поэтому при дефиците АТФ белки задерживаются в клетке. Особенно активно белки выделяются железистыми клетками и клетками печени. Что происходит дальше с синтезируемым белком?

После отделения от рибосомы она тут же гидролизуется цитоплазматическими рибонуклеазами. Уже в ходе трансляции белок начинает укладываться в трехмерную структуру, которую он окончательно принимаем после отделения синтезированного белка от рибосомы. В результате трансляции не всегда образуется функционально активный белок. Во многих слу­чаях необходимы дополнительные посттрансляцивнные изменения. Например, инсулин, образуется из предшественников (проинсулина) в результате отщепления части пептидной цепи под действием специфических протеаз. Сходным образом, т.е. путем частичного протеолиза, активируются многие проферменты.

Присоединение простетической группы с образованием сложных белков и объединение протомеров олигомерных белков также относятся к посттрансляционньм изменениям. В некоторых белках после завершения синтеза пептидной цепи происходит модификация аминокислотных остатков, например превращение пролина и лизина в гидроксилизин и гидроксипролин в коллаге­нах, метелирование аргинина и лизина в гистонах, иодирование тирозина в трио глобулине. Некоторые белки подвергаются гликозилированию, присоеди -няя олигосахаридные остатки (образование гликопротеинов). Одной из пост­синтетических модификаций является фосфорилирование некоторых остатков тирозина в молекуле белка и в настоящее время рассматривается как один из специфических этапов формирования онкобелков при малигнизации нормальных клеток. Хотя биосинтез белка, представляющий сложный многоступенчатый процесс, однако структурно - функциональные взаимоотношения различных его этапов еще недостаточно изучены.

Рис.3 Схема элонгации полипептидной цепи

Матричный синтез представляет собой образование биополимера, последовательность звеньев в котором определяется первичной структурой другой молекулы. Последняя как бы выполняет роль матрицы, "диктующей" нужный порядок сборки цепи. В живых клетках известны три биосинтетических процесса, основанных на этом механизме.

Какие молекулы синтезируются на основе матрицы

К реакциям матричного синтеза относят:

• репликацию - удвоение генетического материала;
• транскрипцию - синтез рибонуклеиновых кислот;
• трансляцию - производство белковых молекул.

Репликация представляет собой превращение одной молекулы ДНК в две идентичные друг другу, что имеет огромное значение для жизненного цикла клеток (митоз, мейоз, удвоение плазмид, деление бактериальных клеток и т. д.). Очень многие процессы основаны на "размножении" генетического материала, а матричный синтез позволяет воссоздать точную копию любой молекулы ДНК.

Транскрипция и трансляция представляют собой две стадии реализации генома. При этом наследственная информация, записанная в ДНК, преобразуется в определенный белковый набор, от которого зависит фенотип организма. Данный механизм именуется путем "ДНК-РНК-белок" и составляет одну из центральных догм молекулярной биологии.

Реализация этого принципа достигается при помощи матричного синтеза, который сопрягает процесс образования новой молекулы с "исходным образцом". Основой такого сопряжения является фундаментальный принцип комплементарности.

Основные аспекты синтеза молекул на основе матрицы

Информация о структуре синтезируемой молекулы содержится в последовательности звеньев самой матрицы, к каждому из которых подбирается соответствующий элемент "дочерней" цепи. Если химическая природа синтезируемой и матричной молекул совпадают (ДНК-ДНК или ДНК-РНК), то сопряжение происходит напрямую, так как каждый нуклеотид имеет пару, с которой может связаться.

Для синтеза белка требуется посредник, одна часть которого взаимодействует с матрицей по механизму нуклеотидного соответствия, а другая присоединяет белковые звенья. Таким образом, принцип комплементарности нуклеотидов работает и в этом случае, хоть и не связывает напрямую звенья матричной и синтезируемой цепей.

Этапы синтеза

Все процессы матричного синтеза поделены на три этапа:

• инициация (начало);
• элонгация;
• терминация (окончание).

Инициация представляет собой подготовку к синтезу, характер которой зависит от вида процесса. Главной целью этой стадии является приведение системы фермент-субстрат в рабочее состояние.

Во время элонгации непосредственно осуществляется наращивание синтезируемой цепи, при котором между подобранными согласно матричной последовательности звеньями замыкается ковалентная связь (пептидная или фосфодиэфирная). Терминация приводит к остановке синтеза и освобождению продукта.

Роль комплементарности в механизме матричного синтеза

Принцип комплементарности основан на выборочном соответствии азотистых оснований нуклеотидов друг другу. Так, аденину в качестве пары подойдут только тимин или урацил (двойная связь), а гуанину - цитозин (3 тройная связь).

В процессе синтеза нуклеиновых кислот со звеньями одноцепочечной матрицы связываются комплементарные нуклеотиды, выстраиваясь в определенную последовательность. Таким образом, на основании участка ДНК ААЦГТТ при репликации может получиться только ТТГЦАА, а при транскрипции - УУГЦАА.

Как уже было отмечено выше, белковый синтез происходит с участием посредника. Эту роль выполняет транспортная РНК, которая имеет участок для присоединения аминокислоты и нуклеотидный триплет (антикодон), предназначенный для связывания с матричной РНК.

В этом случае комплементарный подбор происходит не по одному, а по три нуклеотида. Так как каждая аминокислота специфична только к одному виду тРНК, а антикодон соответствует конкретному триплету в РНК, синтезируется белок с определенной последовательностью звеньев, которая заложена в геноме.

Как происходит репликация

Матричный синтез ДНК происходит с участием множества ферментов и вспомогательных белков. Ключевыми компонентами являются:

• ДНК-хеликаза - расплетает двойную спираль, разрушает связи между цепями молекулы;
• ДНК-лигаза - "зашивает" разрывы между фрагментами Оказаки;
• праймаза - синтезирует затравку, необходимую для работы ДНК-синтезирующего фрагмента;
• SSB-белки - стабилизируют одноцепочечные фрагменты расплетенной ДНК;
• ДНК-полимеразы - синтезируют дочернюю матричную цепь.

Хеликаза, праймаза и SSB-белки подготавливают почву для синтеза. В результате каждая из цепей исходной молекулы становится матрицей. Синтез осуществляется с огромной скоростью (от 50 нуклеотидов в секунду).

Работа ДНК-полимеразы происходит в направлении от 5`к 3`- концу. Из-за этого на одной из цепей (лидирующей) синтез происходит по ходу расплетания и непрерывно, а на другой (отстающей) - в обратном направлении и отдельными фрагментами, названными "Оказаки".

Y-образная структура, образованная в месте расплетания ДНК, называется репликационной вилкой.

Механизм транскрипции

Ключевым ферментом транскрипции является РНК-полимераза. Последняя бывает нескольких видов и отличается по строению у прокариот и эукариот. Однако механизм ее действия везде одинаков и заключается в наращивании цепи комплементарно подбираемых рибонуклеотидов с замыканием фосфодиэфирной связи между ними.

Матричной молекулой для этого процесса служит ДНК. На ее основе могут создаваться разные типы РНК, а не только информационные, которые используются в белковом синтезе.

Участок матрицы, с которого "списывается" последовательность РНК, называется транскриптоном. В его составе имеется промотор (место для присоединения РНК-полимеразы) и терминатор, на котором синтез останавливается.

Трансляция

Матричный синтез белка и у прокариот, и у эукариот осуществляется в специализированных органоидах - рибосомах. Последние состоят из двух субъединиц, одна из которых (малая) служит для связывания тРНК и матричной РНК, а другая (большая) принимает участие в образовании пептидных связей.

Началу трансляции предшествует активация аминокислот, т. е. присоединение их к соответствующим транспортным РНК с образованием макроэргической связи, за счет энергии которых впоследствии осуществляются реакции транспептидирования (присоединения к цепи очередного звена).

В процессе синтеза также принимают участие белковые факторы и ГТФ. Энергия последнего необходима для продвижения рибосомы по матричной цепи РНК.

Матричный синтез 3 типа:

Синтез ДНК - репликация - самоудв-е мол-л ДНК,к-ое обычно происх перед дел-ем кл-ки. Во время репликацииматер мол-ла раскручив, и комплемент нити её разъедин(образ репликативн вилка) Формир-е репликат вилки происх под дей-ем ферментов геликазы и топоизомеразы. Геликаза разрыв водор связи между комплемент-ными нуклеотидами и разъедин нити, топоизомераза сним напряж-е, возникающее при этом в мол-ле. Одиночн нити матер мол-лы служат матрицами для синтеза дочерних комплемент-х нитей. С одиночн нитями связыв SSB-белки(дестабилизирующие белки),к-ые не дают им соедин в двойн спираль. В рез-те репликации образ две одинак мол-лы ДНК,полностью повторяющие матер мол-лу. При этом кажд нов мол-ла сост из одной нов и одной стар цепи. Комплемент нити мол-лы ДНК антипараллельны. Наращив-е полинуклеотидной цепи всегда происх в направл от 5" конца к 3" концу. Вследствие этого одна нить лидирующ (3" конец в основании репликативной вилки), а др-запаздывающ (5" конец в основ вилки) и поэтому строится из фрагменьов Оказаки, растущих от 5" к 3" концу. Фрагменты Оказаки – это участки ДНК, которые у эукариот имеют длину 100-200 нуклеотидов, у прокариот – 1000-2000 нуклеотидов.

Синтез цепи ДНК осуществляет фермент ДНК-полимераза. Она наращив дочерн цепь, присоединяя к её 3" концу нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам материнской цепи. Особ-ть ДНК-полимеразы сост в том, что она не может начать работу на «пустом месте», не имея 3" конца дочерней нити. Поэтому синтез лидирующей нити и синтез каждого фрагмента Оказаки начинает фермент праймаза. Это разновидность РНК-полимеразы. Праймаза способна начать синтез новой полинуклеотидной цепи с соедин-я двух нуклеотидов. Праймаза синтезирует из РНК-нуклеотидов короткие затравки - праймеры. Их длина около 10 нуклеотидов. К 3" концу праймера ДНК полимераза начин присоединять ДНК-нуклеотиды.

Фермент экзонуклеаза удал праймеры. ДНК-полимераза достраивает фрагменты Оказаки, фермент лигаза сшивает их.

Синтез РНК - транскрипция - синтез РНК на матрице ДНК (у эукариот в ядре, у прокариот-в цитоплазме). В процессе транскрипции строится комплемент копия одной из нитей ДНК. В рез-те транскрипции синтезир-ся иРНК, рРНК и тРНК. Транскр-ю осущ РНК-полимераза. У эукариот транскрипцию оскществл три разные РНК-полимеразы:

РНК-полимераза I синтезир рРНК

РНК-полимераза II синтезир иРНК

РНК-полимераза III синтезир тРНК

РНК-полимераза связыв-ся с молекулой ДНК в области промотора. Промотор – это участок ДНК, отмечающий начало транскрипции. Он расположен перед структурным геном. Присоединившись к промотору, РНК-полимераза раскручивает участок двойной спирали ДНК и раздел комплемент-ые цепи. Одна из двух цепей – смысловая – служит матрицей для синтеза РНК. Нуклеотиды РНК комплементарны нуклеотидам смысловой цепи ДНК. Транскрипция идёт от 5" конца к её 3" концу. РНК-полимераза отдел синтезиров-ый уч-к РНК от матрицы и восстанавливает двойную спираль ДНК. Транскрипция продолжается до тех пор, пока РНК-полимераза не доёдет до терминатора. Терминатор – это уч-к ДНК, обозначающий конец транскрипции. Достигнув терминатора, РНК-полимераза отделяется и от матричной ДНК и от новосинтезированной молекулы РНК.

Транскр-я дел на 3 этапа:

Инициация –присоед-е РНК-полимеразыи помогающих ей белков-факторов транскрипции к ДНК и начало их работы.

Элонгация -наращив- полинуклеот-ой цепи РНК.

Терминация -оконч-е синтеза мол-лы РНК.

Синтез белка - трансляция - процесс синтеза полипепт-ной цепи, проходящей на рибосоме. Происх в цитоплазме. Рибосома сост из двух субъединиц: большой и малой. Субъединицы построены из рРНК и белков. Неакт рибосома находится в цитоплазме в диссоциированном виде. Активная рибосома собирается из двух субъединиц, приэтом в ней образ-ся активные центры, в том числе – аминоацильный и пептидильный. В аминоацильном центре происход образ-е пептидной связи. Транспортные РНК специфичны, т.е. одна тРНК может перенос только одну определ-ую а/к. Эта а/к зашифрована кодоном, которому комплементарен антикодон тРНК. В процессе трансляции рибосома переводит последоват-ть нуклеотидов иРНК в последоват-ть а/к полипептидной цепи.

Трансляция дел на 3 этапа.

Инициация -сборка рибосомы на инициирующем кодоне иРНК и начало её работы. Инициация начинается с того, что с иРНК соедин-ся малая субъединица рибосомы и тРНК, несущая метионин, к-рый соответствует инициирующему кодону АУГ. Затем к этому комплексу присоедин-ся большая субъединица. В рез-те инициирующий кодон оказыв-ся в пептидильном центре рибосомы, а в аминоацильном центре наход-ся первый значащий кодон. К нему подходят различные тРНК, а останется в рибосоме только та, антикодон к-рой комплементарен кодону. Между комплемент-ми нуклеотидами кодона и антикодона образ-ся водородные связи. В итоге в рибосоме с иРНК оказыв-ся временно связаны две тРНК. Кажд тРНК принесла в рибосому а/к, зашифрованную кодоном иРНК. Между этими а/к образ-ся пептидная связь. После этого тРНК, принесшая метионин, отдел-ся от своей а/к и от иРНК и уходит из рибосомы. Рибосома перемещ-ся на один триплет от 5" конца к 3" концу иРНК.

Элонгация – процесс наращив-я полип-ой цепочки. В аминоацильный центр рибосомы будут подходить различн тРНК. Процесс узнавания тРНК и поцесс формирования пептидной связи будет повтор-ся до тех пор, пока в аминоацильном центре рибосомы не окажется стоп-кодон.

Терминация – заверш-е синтеза полипептида и диссоциация рибосомы на две субъединицы. Существ три стоп-кодона: УАА, УАГ и УГА. Когда один из них оказыв-ся в аминоацильном центре рибосомы, с ним связыв-ся белок – фактор терминации трансляции. Это вызывает распад всего комплекса.

Как уже упоминалось (стр. 59), важнейшие биополимеры – белки и нуклеиновые кислоты - синтезируются в живом организме путем матричной поликонденсации. Для осуществления матричного синтеза полимера необходима макромолекула-матрица , несущая всю информацию о первичной структуре синтезируемой макромолекулы. В ходе синтеза происходит «считывание» этой информации, и разные мономеры вступают в реакции синтеза в определенном порядке . Для этого необходимо, чтобы каждый мономер «узнавал» то место на макромолекуле-матрице, где «записана» информация именно об этом мономере. Иными словами, необходимо некое структурное соответствие между молекулой мономера и соответствующим ему участком матрицы; это соответствие принято называть комплементарностью (в некоторых русскоязычных источниках встречается написание «компли ментарность»; дело, вероятно, в том, что английское слово с ompl e mentary произносится как ‘kompl i ment  ry ).

Принцип комплементарности макромолекулы-матрицы и синтезируемого полимера может быть использован для синтеза полимеров с определенной первичной структурой любым методом (и полимеризацией и поликонденсацией); ведутся исследования по матричному получению синтетических сополимеров. Однако до настоящего времени единственными эффективными примерами матричных синтезов полимеров являются синтезы белков и нуклеиновых кислот путем матричной поликонденсации. Все эти синтезы протекают в ходе генетических процессов , прежде всего – репликации, транскрипции и трансляции (синтез небольших участков ДНК протекает также в ходе еще одного генетического процесса – репарации).

Во всех этих случаях матрицей является макромолекула нуклеиновой кислоты : при репликации и транскрипции – ДНК, при трансляции – матричной (информационной) РНК. Комплементарное узнавание осуществляется: А. При репликации и транскрипции (а также репарации) - между нуклеотидными звеньями макромолекулы матрицы и мономерами (нуклеозидтрифосфатами); Б. При трансляции – между нуклеотидными звеньями макромолекулы - матрицы и нуклеотидными звеньями антикодонов. Это узнавание осуществляется путем образования водородных связей между гетероциклическими основаниями: для ДНК в парах аденин-тимин (A-T, Ade-Thy) и гуанин-цитозин (G-C, Gua-Cyt), для РНК – в парах аденин-урацил (А-U, Ade-Ura) и гуанин-цитозин. В парах А-Т и А-U образуются две водородные связи, в паре G-C – три:

Эти пары имеют абсолютно одинаковый размер (1,085 нм); это делает возможным построение регулярных вторичных структур (прежде всего, двойной спирали ДНК).

Репликация, транскрипция и трансляция начинаются и заканчиваются в строго определенных местах макромолекулы-матрицы (иначе говоря, для матричных синтезов существуют «старт-сигнал» и «стоп-сигнал»). Начало этих процессов называют инициацией , процесс формирования полимерной цепи – элонгацией, окончание – терминацией. Все эти процессы протекают при катализе несколькими ферментами.

Репликация. В ходе этого генетического процесса происходит удвоение молекул ДНК, т.е. копирование генетической информации. Суть процесса – расплетение двойной спирали ДНК на единичные цепи; каждая из них служит матрицей для синтеза новой (дочерней) цепи из мономеров – дезоксирибонуклеозид-5’-трифосфатов. Синтез катализируется ферментами ДНК-полимеразами , которые осуществляют линейный синтез (т.е. на каждой стадии формирования цепи взаимодействуют полимер и мономер) по направлению 5’→3’ (т.е. на каждой стадии реагируют 3’-концевая группа ОН полимера и 5’-трифосфатная группа мономера:

Поскольку каждый мономер узнает свой участок, дочерняя цепь представляет собой точную копию отделившейся [если в ходе синтеза все же к цепи присоединяется «неправильный» мономер (т.е. не комплементарный своему звену матрицы), то фермент осуществляет коррекцию – отщепляет это звено].

Двойная связь начинает расплетаться в каком-то определенном месте; синтез дочерних цепей начинается сразу вслед за началом расплетения двойной спирали; двойная спираль продолжает расплетаться, а вслед за расплетением (движением «репликативной вилки») идет наращивание дочерних цепей. При этом на двух одиночных цепях-матрицах синтез идет по разным схемам. Дело в том, что в двойной спирали исходной (материнской) ДНК цепи ориентированы антипараллельно ; поэтому для одной цепи репликативная вилка движется в направлении 5’→3’ (эта цепь называется ведущей ), а для другой – в направлении 3’→5’ (эта цепь называется отстающей ). Поскольку синтез дочерней цепи может идти только в направлении 5’→3’, то на ведущей цепи она синтезируется в том же направлении , что и движение вилки, а на отстающей – в противоположном направлении. Поэтому на ведущей цепи идет непрерывный синтез «вдогонку» движению вилки, а на отстающей – прерывистый , в виде отдельных фрагментов, называемых фрагментами Оказаки (пока синтезируется один фрагмент, вилка движется в обратном направлении и освобождается место на матрице; тогда синтез этого фрагмента прекращается, и на освободившемся месте начинается синтез второго фрагмента и т.д.):

После окончания синтеза фрагменты Оказаки сшиваются специальными ферментами (лигазами) в одну цепь. Таким образом, на одной цепи (ведущей) идет чисто линейный синтез, а на другой – отстающей – блочный (конвергентный).

Дочерние цепи образуют с материнскими цепями двойные спирали – копии исходных двойных спиралей.

Полимеразная цепная реакция (амплификация фрагментов ДНК)

Относительно недавно (К. Маллис, 1988) разработана методика, позволяющая проводить процесс, подобный репликации, не в организме, а «в колбе» (in vitro ) . Такой процесс получил название полимеразной цепной реакции, ПЦР (Polymerase Chain Reaction , PCR ) . Полимеразная цепная реакция позволяет многократно увеличивать количество первоначально взятой ДНК; такое увеличение количества (размножение) принято обозначать термином «амплификация». Амплификации по способу ПЦР подвергается не вся нативная ДНК, а ее фрагменты, содержащие гены, интересующие исследователя. Для получения таких фрагментов нативную ДНК подвергают специфическому расщеплению (рестрикции) специальными ферментами – рестриктазами (будут рассмотрены в дальнейшем). Необходимое условие для амплификации: для амплифицируемого фрагмента должна быть известна первичная структура с 3’- концов обеих цепей примерно на 20-30 звеньев.

Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо иметь праймеры – олигонуклеотиды длиной 20-30 звеньев, комплементарные первичным структурам обоих цепей с 3’ –концов. Синтез таких олигонуклеотидов разработан достаточно хорошо.

Для проведения ПЦР в реакционный сосуд помещают амплифицируемый фрагмент ДНК, прибавляют большой избыток обоих праймеров и мономеров – дезоксирибонуклеотид – 5’-трифосфатов - и вводят ДНК-полимеразу; обычно используют термостойкую полимеразу, выделенную из термобактерий. Смесь нагревают до 95 0 С; при этом двойная спираль амплифицируемого фрагмента ДНК распадается на одиночные цепи; затем быстро охлаждают до 60 0 С; при этом праймеры координируются с комплементарными им 3’-концами каждой цепи. Это более вероятно, чем воссоздание распавшейся двойной спирали, т.к. праймеры находятся в большом избытке. Праймеры, ассоциированные с цепями, служат затравками для матричного синтеза ДНК из мономеров, который катализируется ДНК-полимеразой. Синтез идет в направлении 5’→3’; на каждой цепи синтезируется комплементарная ей вторая цепь и, следовательно, количество ДНК удваивается. Далее цикл нагрев-охлаждение повторяется; каждая из макромолекул ДНК снова удваивается и т.д. Таким образом, удается провести несколько циклов и многократно увеличить количество ДНК; большой избыток праймеров и мономеров это позволяет сделать. Проведение ПЦР представлено на приведенной ниже схеме; для упрощения изображены праймеры длиной 7 звеньев, хотя в действительности они заметно длиннее (20-30 звеньев):

Синтез полинуклеотидных цепей идет, разумеется, по той же схеме (полимер + мономер), что и при обычной репликации (стр. 91).

Транскрипция. В ходе этого процесса происходит передача информации от ДНК на матричную (информационную) ДНК (а также на транспортные и рибосомальные РНК). Процесс имеет много общего с репликацией: макромолекула ДНК является матрицей для синтеза макромолекулы РНК из мономеров – рибонуклеозид-5 ’-трифосфатов; синтез также начинается с расплетения двойной спирали ДНК и протекает в направлении 5’→3’ по линейной схеме при катализе ферментами –РНК-полимеразами. Однако имеются и принципиальные особенности: 1) В отличие от репликации, матрицей служит только одна цепь исходной ДНК (так называемая минус-цепь); 2) Синтезируемая цепь не образует двойную спираль с молекулой-матрицей, а отделяется в виде единичной цепи; молекула- матрица снова образует двойную спираль с ранее отделившейся цепью ДНК (плюс-цепью): двойная спираль ДНК-ДНК устойчивее спирали ДНК-РНК:

И при репликации и при транскрипции синтезируются весьма высокомолекулярные полинуклеотидные цепи с высочайшей скоростью (у эукариот –1000-3000 звеньев в мин., у прокариот – до 50000 тыс. звеньев в мин.). А. Скорость процесса обусловлена: 1. Точной пространственной ориентацией реагирующих частиц : 5’-трифосфатная группа мономера точно подводится к 3’-ОН-концевому звену синтезируемой цепи; это происходит в процессе комплементарного узнавания; 2. Ферментативным катализом , который, как известно, наиболее эффективен. Матричный синтез нуклеиновых кислот, в отличие от нематричного, не требует защиты «лишних групп»: приведенные факторы обеспечивают абсолютную специфичность взаимодействия функциональных групп. Б. Высокая молекулярная масса синтезируемого полимера достигается полным удалением низкомолекулярного продукта реакции – пирофосфата, которых гидролизуется до фосфата [как уже упоминалось (стр. 72), синтез нуклеиновых кислот относится к равновесной поликонденсации].

Трансляция. Матричный биосинтез полипептидов. В ходе трансляции происходит передача генетической информации от матричной РНК (мРНК) на белок.

Матрицей для синтеза полипептидной цепи служит молекула мРНК; при этом возникает проблема перевода информации из 4- буквенного «алфавита» РНК на 20-буквенный «алфавит» полипептидной цепи (одно из значений термина «трансляция» – перевод). Иными словами, необходимо существование структурного соответствия между определенными участками РНК-матрицы и определенными мономерами для синтеза полипептидов - α-аминокислотами. Это соответствие получило название белкового кода. Код является триплетным : каждая аминокислота соответствует участку мРНК, содержащему три нуклеотидных звена ; иначе говоря, она кодируется триплетом нуклеотидных звеньев; такой триплет называется кодоном. Совокупность всех кодонов – белковый код .

Белковый код является вырожденным – большинство α-аминокислот кодируется более чем одним кодоном. Кодоны, кодирующие одну и ту же аминокислоту, называют синонимичными ; как правило, первые два звена синонимичных кодонов одинаковы, а третье различается: например, пролин (Pro ) кодируется четырьмя кодонами: ССU, CCA, CCC, CCG. Из 64 кодонов (это число возможных сочетаний из четырех типов звеньев по три) 61 кодируют α-аминокислоты, а три не кодируют ничего; они называются терминальными или стоп-кодонами; на этих участках матрицы синтез полипептида останавливается. Код, как правило, не перекрывается, кодоны идут «встык» один за другим: если, например, в последовательности GAAUGUCCG первые три звена (GAA) кодируют одну аминокислоту, то вторые три (UGU) – вторую, а третьи (CCG) – третью; в то же время, например, триплет AAU здесь кодоном не является.

Белковый код был расшифрован в 60-х годах ХХ века во многом благодаря использованию синтетических матриц – продуктов поликонденсации олигонуклеотидов (стр. 89).

α-Аминокислоты не могут непосредственно узнавать соответствующие им кодоны, поскольку нет прямой комплементарности между их структурами. Узнавание осуществляется с помощью молекул- посредников (адапторов или уж совсем по русски - переходников) – молекул, которые могут специфически координироваться с одной стороны с кодонами, а с другой – с соответствующими им α-аминокислотами. Такими адапторами являются транспортные РНК (тРНК) – сравнительно низкомолекулярные полинуклеотиды (73-85 нуклеотидных звеньев); эти РНК растворимы и весьма мобильны, что и позволяет им выполнять транспортную функцию – доставку аминокислот к матрице. Транспортная РНК имеет специфическую пространственную структуру («клеверного листа»); один из фрагментов этой структуры («акцепторный стебель») специфически связывается со своей α-аминокислотой (и только с ней!); другой фрагмент («антикодоновая петля») содержит триплет нуклеотидных звеньев, комплементарных кодону, который кодирует именно эту аминокислоту; этот триплет называют антикодоном (например, если аминокислота кодируется триплетом UСA, то в ее тРНК антикодон – AGU).

Перед процессом собственно трансляции происходит узнавание α-аминокислотами «своих» тРНК и далее ковалентное связывание с ними с образованием сложного эфира по 3’-концевому звену «акцепторного стебля» - аминоацил-тРНК:

Ковалентное связывание происходит при участии 5’-аденозинтрифосфата (АТР, рррА), который поставляет необходимую для этого энергию (расщепляясь до аденозинмонофосфата и пирофосфата). Образование аминоацил-тРНК катализируются ферментами – аминоацил-тРНК-синтетазами; каждая из них узнает с одной стороны «свою» α-аминокислоту, а с другой – «свою» тРНК («двойной контроль», практически исключающий ошибки при узнавании).

Далее т-РНК транспортирует связанную с ней α-аминокислоту к матрице, где и происходит «сборка» полипептидной цепи. Матрица – мРНК – образует комплекс с рибосомой – клеточной органеллой, представляющей собой специфический комплекс рибосомальных РНК с белками. Рибосома в ходе синтеза перемещается вдоль цепи мРНК от кодона к кодону (это перемещение называется транслокацией) . Именно на рибосоме и происходит синтез полипептидной цепи. Опуская описание строения рибосомы, отметим, что на ней имеются два центра связывания – А-центр (аминокислотный) и Р-центр (пептидный), которые и принимают непосредственное участие в синтезе.

Опять-таки опуская начало (инициацию) процесса трансляции, рассмотрим единичный цикл элонгации – совокупность процессов, при которых полипептидная цепь увеличивается на одно звено (рис. 9)

Один цикл элонгации включает три этапа. Перед первым этапом Р-центр занят тРНК, связанной с С-концевым звеном формирующейся полипептидной цепи; А-центр свободен и находится у кодона, кодирующего следующую аминокислоту. На первом этапе (1) тРНК, связанная с этой следующей аминокислотой (здесь – фенилаланином), узнает кодон этой аминокислоты (при помощи антикодона) и координируется с ним, закрепляясь на А-центре. При этом весьма важно, что пептидная цепь на Р-центре и очередная аминокислота точно ориентированы друг по отношению к другу – группа NH 2 очередной аминокислоты точно «нацелена» на сложноэфирный карбонил С-концевого звена пептидной цепи. Такая ориентация обусловлена специфической структурой рибосомы. Точная ориентация позволяет весьма эффективно осуществить ключевой второй этап (2) – образование пептидной связи (конденсацию). Эта реакция идет по типу аминолиза сложного эфира; «спиртовая» компонента – тРНК – вытесняется и остается на Р-центре, а пептидная цепь, удлинившаяся на одно звено, теперь связана с новой молекулой тРНК, прикрепленной к А-центру.

Образование пептидной связи катализируется ферментом – пептидилтрансферазой – и протекает с очень большой скоростью – за время порядка 10 -2 – 10 -3 сек.

Далее следует третий этап (3), который состоит из трех стадий. На первой стадии освободившаяся тРНК предыдущей аминокислоты уходит с Р-центра (удаление побочного продукта равновесной поликонденсации). На второй стадии тРНК с прикрепленной к ней пептидной цепью переходит с А-центра на освободившийся Р-центр. Наконец, на третьей стадии рибосома перемещается вдоль цепи мРНК на один кодон (на рисунке - вправо), т.е. происходит транслокация. После этого картина полностью аналогична исходной (до начала первого этапа), но полипептидная цепь имеет на одно звено больше, а рядом с А-центром находится новый кодон; далее все повторяется. Один цикл элонгации проходит в течение порядка 0,05 сек., так что синтез достаточно большого белка из 400 звеньев проходит за 20 сек. Синтез идет в направлении 5"->3" мРНК и от N-конца полипептидной цепи к ее С-концу.

Терминация трансляции наступает при попадании А-центра рибосомы на стоп-кодон; синтез прекращается, готовая полипептидная цепь отделяется от последней тРНК и покидает рибосому.

Рис. 9. Схема одного цикла элонгации при трансляции

Резюме

Процессы поликонденсации в подавляющем большинстве случаев (за исключением поли- рекомбинации) сводятся к взаимодействию между собой функциональных групп мономеров. Если каждый мономер содержит две группы, образуется линейный полимер (линейная поликонденсация), если три или более – возможно сшивание с образованием трехмерной структуры (трехмерная поликонденсация). Концевые группы полимеров – неиспользованные функциональные группы мономеров.

Для поликонденсации используют самые разнообразные взаимодействия между функциональными группами, из которых, вероятно, наиболее часто – полиацилирование; по этой схеме, в частности, идет синтез белков и по сходной схеме – синтез нуклеиновых кислот.

Реакции поликонденсации протекают по ступенчатым механизмам. Конечный результат линейной поликонденсации определяется, в основном, двумя факторами: степенью обратимости реакции и соотношением реагирующих групп. По степени обратимости различают равновесную и неравновесную поликонденсацию. В первом случае обратные реакции (деструкции) протекают в заметной степени, поэтому необходимо удаление низкомолекулярного продукта реакции; во втором случае такое удаление не обязательно. Нарушение эквивалентности реагирующих групп во всех случаях ограничивает длину полимерной цепи. Поэтому для достижения высоких молекулярных масс нужно обеспечить строгую эквивалентность групп; напротив, для получения олигомеров нужно использовать рассчитанный избыток одной из групп. Для трехмерной поликонденсации эти ограничения не столь существенны, т.к. для сшивания во многих случаях достаточно неполной глубины процесса.

При обычной непрограммируемой поликонденсации образуются полимеры с высокой степенью полидисперсности; однако, долю молекул любой величины (как по числу, так и по массе) во многих случаях можно достаточно точно рассчитать.

С другой стороны, именно поликонденсация предоставляет возможность осуществления программируемых синтезов, в результате которых образуются монодисперсные полимеры, в том числе сополимеры с заданной первичной структурой. Это могут быть синтезы с контролем каждой стадии формирования полимерной цепи (синтез дендримеров, синтезы полипептидов и полинуклеотидов «в пробирке»). Наиболее совершенный вариант программируемого синтеза – матричный синтез, в ходе которого считывается информация, «записанная» на молекуле-матрице. Это – процессы репликации, транскрипции и трансляции; ферментативный катализ и точная ориентация реагирующих молекул позволяет проводить эти синтезы не только с высочайшей точностью, но и с высочайшей скоростью.