Біологічна роль та біохімічні механізми репарації. Стадія регенерації та репарації

Синтез ДНК відбувається за напівконсервативним механізмом: кожен ланцюг ДНК копіюється. Синтез відбувається на ділянках. Існує система, що усуває помилки при редуплікації ДНК (фоторепарація, дорепродуктивна та пострепродуктивна репарації). Процес репарації дуже довгий: до 20 годин і складний. Ферменти – рестриктази вирізують невідповідну ділянку ДНК і добудовують її заново. Репарації ніколи не протікають зі 100% ефективністю, якби це було, не існувала б еволюційна мінливість. Механізм репарації ґрунтується на наявності в молекулі ДНК двох комплементарних ланцюгів. Спотворення послідовності нуклеотидів в одній з них виявляється специфічними ферментами. Потім відповідна ділянка видаляється та заміщається новим, синтезованим на другому комплементарному ланцюзі ДНК. Таку репарацію називають ексцизійної,тобто. із вирізанням. Вона здійснюється до чергового циклу реплікації, тому її називають також дореплікативною.У тому випадку, коли система ексцизійної репарації не виправляє зміни, що виникли в одному ланцюгу ДНК, в ході реплікації відбувається фіксація цієї зміни і стає надбанням обох ланцюгів ДНК. Це призводить до заміни однієї пари комплементарних нуклеотидів на іншу або до появи розривів у знову синтезованому ланцюгу проти змінених ділянок. Відновлення нормальної структури ДНК може відбутися і після реплікації. Стреплекативна репараціяздійснюється шляхом рекомбенації між двома новоствореними подвійними спіралями ДНК. У ході дореплікативної та постреплікативної репарації відновлюється більша частина пошкодженої структури ДНК. Якщо в клітині, незважаючи на репарацію, кількість пошкоджень залишається високою, в ній блокуються процеси реплікації ДНК. Така клітка не ділиться.

19. Ген, його властивості. Генетичний код, властивості. Структура та види РНК. Процессинг, сплайсинг. Роль РНК у реалізації спадкової інформації.

Ген - Ділянка молекули ДНК, яка несе інформацію про структуру поліпептидного ланцюга або макромолекули. Гени однієї хромосоми розташовуються лінійно, утворюючи групу зчеплення. ДНК у хромосомі виконує різні функції. Існують різні послідовності генів, є послідовності генів, що контролюють експресію генів, реплікацію та ін. Є гени, що містять інформацію про структуру поліпептидного ланцюга, зрештою – структурні білки. Такі послідовності нуклеотидів довгою в один ген називаються структурними генами. Гени, що визначають місце, час, тривалість включення структурних генів – регуляторні гени.

Гени мають невеликий розмір, хоча складаються із тисяч пар нуклеотидів. Наявність гена встановлюється за проявом ознаки гена (кінцевого продукту). Загальну схему будови генетичного апарату та її роботи 1961 року запропонували Жакоб, Моно. Вони запропонували, що є ділянка молекули ДНК із групою структурних генів. До цієї групи примикає ділянку в 200пар нуклеотидів - промотор (ділянка примикання ДНК залежної РНК-полімерази). До цієї ділянки примикає ген-оператор. Назва всієї системи – оперон. Регулювання здійснюється регуляторним геном. У результаті білок-репресор взаємодіє з геном-оператором, і оперон починає працювати. Субстрат взаємодіє із геном регуляторами, оперон блокується. Принцип зворотний зв'язок. Експресія оперону включається як єдине ціле.

У еукаріотів експресія генів не досліджена. Причина – серйозні перешкоди:

Організація генетичного матеріалу у формі хромосом

У багатоклітинних організмів клітини спеціалізовані і тому частина генів вимкнена.

Наявність гістонових білків, у той час як у прокаріотів - «гола» ДНК.

ДНК – макромолекула, вона може виходити в цитоплазму з ядра і передавати інформацію. Синтез білка можливий завдяки мРНК. В еукаріотичній клітині транскрипція відбувається з величезною швидкістю. Спочатку виникає про-і-РНК чи пре-і-РНК. Це тим, що з еукаріотів і-РНК утворюється внаслідок процесингу (дозрівання). Ген має уривчасту структуру. Кодуючі ділянки – екзони та некодуючі – інтрони. Ген у еукаріоічних організмів має екзонно-інтронну структуру. Довжина інтрону більша за довжину екзону. У процесі процесингу інтрони «вирізаються» – сплайсинг. Після утворення зрілої і-РНК після взаємодії з особливим білком перетворюється на систему – інформосому, яка несе інформацію в цитоплазму. Зараз екзоно-інтронні системи добре вивчені (наприклад, онкоген – Р-53). Іноді інтрони одного гена є екзонами іншого, тоді сплайсинг неможливий. Процессинг і сплайсинг здатні поєднувати структури, віддалені одна від одної, в один ген, тому вони мають величезне еволюційне значення. Подібні процеси спрощують видоутворення. Білки мають блокову структуру. Наприклад, фермент – ДНК-полімераза. Він є безперервним поліпептидним ланцюгом. Він складається з власної ДНК-полімерази та ендонуклеази, яка розщеплює молекулу ДНК з кінця. Фермент складається з 2 доменів, які утворюють 2 незалежні компактні частинки, пов'язані поліпептидним містком. На межі між двома генами ферментів знаходиться інтрон. Колись домени були роздільними генами, а потім зблизилися. Порушення подібної структури гена призводить до генних хвороб. Порушення будови інтрону фенотипно непомітно, порушення у екзонній послідовності призводять до мутації (мутації глобінових генів).

10-15% РНК у клітині – транспортна РНК. Є комплементарні ділянки. Є спеціальний триплет – антикодон, триплет, який не має комплементарних нуклеотидів – ГГЦ. Взаємодія 2 субодиниць рибосоми та і-РНК призводить до ініціації. Є 2 ділянки – пектидильна та аміноацильна. Вони відповідають амінокислот. Синтез поліпептиду відбувається покроково. Елонгація - процес побудови поліпептидного ланцюга триває доки не дійде до безглуздого кодону, тоді відбувається термінація. Закінчується синтез поліпептиду, який потім надходить до каналів ЕПР. Субодиниці розходяться. У клітині синтезуються різні кількості білка.

План лекції 1.Типи пошкоджень ДНК 1.Типи пошкоджень ДНК 2.Репарація ДНК, типи та механізми: 2.Репарація ДНК, типи та механізми: Пряма Пряма Ексцизійна Ексцизійна Постреплікативна Постреплікативна SOS репарація і SOS репарація 3. хвороби

Процес відновлення вихідної нативної структури ДНК називають репарацією ДНК, чи генетичної репарацією, а системи, що у ньому - репараційними. Процес відновлення вихідної нативної структури ДНК називають репарацією ДНК, чи генетичної репарацією, а системи, що у ньому - репараційними. Нині відомо кілька механізмів генетичної репарації. Одні з них простіші і «включаються» відразу після пошкодження ДНК, інші вимагають індукції великої кількості ферментів, і їхня дія розтягнута в часі. Нині відомо кілька механізмів генетичної репарації. Одні з них простіші і «включаються» відразу після пошкодження ДНК, інші вимагають індукції великої кількості ферментів, і їхня дія розтягнута в часі.

З позицій молекулярного механізму первинні ушкодження в молекулах ДНК можуть бути усунуті трьома шляхами: З позицій молекулярного механізму первинні ушкодження в молекулах ДНК можуть бути усунені трьома шляхами: 1. прямим поверненням до вихідного стану; 1.прямим поверненням до вихідного стану; 2. вирізанням пошкодженої ділянки та заміною її нормальним; 2. вирізанням пошкодженої ділянки та заміною її нормальним; 3. рекомбінаційним відновленням в обхід пошкодженої ділянки. 3. рекомбінаційним відновленням в обхід пошкодженої ділянки.

Спонтанні пошкодження ДНК Помилки реплікації (поява некомплементарних пар нуклеотидів) Помилки реплікації (поява некомплементарних пар нуклеотидів) Апуринізація (відщеплення азотистих основ з нуклеотиду) лення аміногрупи)

Індуковані пошкодження ДНК Димеризація (зшивання сусідніх піримідинових основ з утворенням димера) Димеризація (зшивання сусідніх піримідинових основ з утворенням димера) Розриви в ДНК: однониткові та двониткові Розриви в ДНК: однониткові та двониткові Поперечні зшивки між нитками ДНК

ПРЯМА РЕПАРАЦІЯ ДНК Цей тип репарації забезпечує пряме відновлення вихідної структури ДНК або видалення пошкодження. Цей тип репарації забезпечує пряме відновлення вихідної структури ДНК чи видалення ушкодження. Широко поширена система репарації такого роду фотореактивація піримідинових димерів. Широко поширена система репарації такого роду фотореактивація піримідинових димерів. Це поки що єдина, відома ферментна реакція, в якій фактором активації служить не хімічна енергія, а енергія видимого світла. Це поки що єдина, відома ферментна реакція, в якій фактором активації служить не хімічна енергія, а енергія видимого світла. При цьому активізується фермент фотоліаз, який роз'єднує димери. При цьому активізується фермент фотоліаз, який роз'єднує димери.

Фоторепарація Схематично світлова репарація має такий вигляд: 1. Нормальна молекула ДНК Опромінення УФ-світлом 2. Мутантна молекула ДНК – утворення піримідинових димерів. Дія видимого світла 3. Синтез ферменту фотоліази 4. Розщеплення димерів піримідинових основ 5. Відновлення нормальної структури ДНК

Встановлено, що більшість полімераз крім 5"-3"-полімеразної активності мають 3"-5"-екзонуклеазну активність, завдяки якій забезпечується корекція можливих помилок. Встановлено, що більшість полімераз крім 5"-3"-полімеразної активності мають 3"-5"-екзонуклеазну активність, завдяки якій забезпечується корекція можливих помилок. Ця корекція здійснюється у два етапи: спочатку йде перевірка відповідності кожного нуклеотиду матриці перед включенням його до складу зростаючого ланцюга, а потім перед включенням до ланцюга наступного за ним нуклеотиду. Ця корекція здійснюється у два етапи: спочатку йде перевірка відповідності кожного нуклеотиду матриці перед включенням його до складу зростаючого ланцюга, а потім перед включенням до ланцюга наступного за ним нуклеотиду. РЕПАРАЦІЯ ДНК ЗА РАХУНОК ЕКЗОНУКЛЕАЗНОЇ АКТИВНОСТІ ДНК-ПОЛІМЕРАЗ

Під час вбудовування неправильного нуклеотиду подвійна спіраль деформується. Це дозволяє ДНК-П розпізнати в більшості випадків дефект у зростаючому ланцюзі. Якщо помилково вбудований нуклеотид не здатний формувати водневий зв'язок з комплементарною основою, ДНК-П призупинить процес реплікації доти, доки потрібний нуклеотид не стане на його місце. У еукаріотів ДНК-П не має 3-5 екзонуклеазної активності. Під час вбудовування неправильного нуклеотиду подвійна спіраль деформується. Це дозволяє ДНК-П розпізнати в більшості випадків дефект у зростаючому ланцюзі. Якщо помилково вбудований нуклеотид не здатний формувати водневий зв'язок з комплементарною основою, ДНК-П призупинить процес реплікації доти, доки потрібний нуклеотид не стане на його місце. У еукаріотів ДНК-П не має 3-5 екзонуклеазної активності.

Репарація алкілуючих ушкоджень Генетичні ушкодження, що викликаються приєднанням алкільних або метильних груп, можуть репаруватися внаслідок видалення цих груп специфічними ферментами. Специфічний фермент Про 6 метилгуанін трансферазу розпізнає Про 6 метилгуанін у ДНК і видаляє метильну групу і повертає основу у вихідну форму. Генетичні ушкодження, що викликаються приєднанням алкільних або метильних груп, можуть репаруватися внаслідок видалення цих груп специфічними ферментами. Специфічний фермент Про 6 метилгуанін трансферазу розпізнає Про 6 метилгуанін у ДНК і видаляє метильну групу і повертає основу у вихідну форму.

Дія полінуклеотидлігази Наприклад, під дією іонізуючого опромінення можуть виникнути однониткові розриви ДНК. Фермент полінуклеотидлігаза з'єднує розірвані кінці ДНК. Наприклад, під дією іонізуючого опромінення можуть виникнути однониткові розриви ДНК. Фермент полінуклеотидлігаза з'єднує розірвані кінці ДНК.

Етапи ексцизійної репарації 1. Впізнавання пошкодження ДНК ендонуклеазою 1. Впізнавання пошкодження ДНК ендонуклеазою 2. Інцизія (надрізання) ланцюга ДНК ферментом по обидва боки від ушкодження 2. Інцизія (надрізання) ланцюга ДНК ферментом по обидва боки від ушкодження 3. Ексцізія (Ексцізія). різання та видалення) пошкодження за допомогою гелікази 4. Ресинтез: ДНК-П забудовує пролом та лігаза з'єднує кінці ДНК 4. Ресинтез: ДНК-П забудовує пролом та лігаза з'єднує кінці ДНК

Місметч-репарація Під час реплікації ДНК бувають помилки спарювання, коли замість комплементарних пар А-Т, Г-Ц утворюються некомплементарні пари. Неправильне спарювання торкається лише дочірнього ланцюга. Система репарації місметч має знайти дочірнє коло і зробити заміну некомплементарних нуклеотидів. Під час реплікації ДНК бувають помилки парування, коли замість комплементарних пар А-Т, Г-Ц утворюються некомплементарні пари. Неправильне спарювання торкається лише дочірнього ланцюга. Система репарації місметч має знайти дочірнє коло і зробити заміну некомплементарних нуклеотидів.

Місметч репарація Як відрізнити дочірній ланцюг від материнської? Як відрізнити дочірній ланцюг від материнської? Виявляється, спеціальні ферменти метилази приєднують метильні групи до аденінів у послідовності ГАТЦ на материнський ланцюг і вона стає метильованою, на відміну неметильованою дочірньою. У E.coli продукти 4-х генів відповідають зп місметч репарацію: mut S, mut L, mut H, mut U. Виявляється, спеціальні ферменти метилази приєднують метильні групи до аденінів у послідовності ГАТЦ на материнську ланцюг і вона стає метильованою, на відміну неметильованою дочкою. У E.coli продукти 4-х генів відповідають зп місметч репарацію: mut S, mut L, mut H, mut U.

ПОСТРЕПЛІКАТИВНА РЕПАРАЦІЯ ДНК Постреплікативна репарація здійснюється в тих випадках, коли пошкодження доживає до фази реплікації (занадто багато пошкоджень, або пошкодження виникло безпосередньо перед реплікацією) або має таку природу, яка унеможливлює його виправлення за допомогою ексцизійної репарації (наприклад, Ця система грає особливо важливу роль у еукаріотів, забезпечуючи можливість копіювання навіть з пошкодженої матриці (хоча і зі збільшеною кількістю помилок). Один із різновидів цього типу репарації ДНК - рекомбінаційна репарація.

SOS-репарація Виявлено в 1974 р. М.Радманом. Він дав назву, включивши до нього міжнародний сигнал лиха. Включається тоді, коли пошкоджень у ДНК настільки багато, що вони загрожують життю клітини. Індукується синтез білків, які приєднуються до ДНК-П комплексу та будують дочірній ланцюг ДНК навпроти дефектної матричної. В результаті ДНК подвоюється з помилкою і може статися клітинний поділ. Але якщо були зачеплені життєво важливі функції, клітина загине. Виявлено 1974 р. М.Радманом. Він дав назву, включивши до нього міжнародний сигнал лиха. Включається тоді, коли пошкоджень у ДНК настільки багато, що вони загрожують життю клітини. Індукується синтез білків, які приєднуються до ДНК-П комплексу та будують дочірній ланцюг ДНК навпроти дефектної матричної. В результаті ДНК подвоюється з помилкою і може статися клітинний поділ. Але якщо були зачеплені життєво важливі функції, клітина загине.

РЕПАРАЦІЯ ДНК І СПАДЧІ ХВОРОБИ ЛЮДИНИ Порушення системи репарації у людини є причиною: Передчасного старіння онкозахворювань (80-90 % всіх ракових захворювань) Аутоімунних захворювань (ревматоїдний артрит, ВКВ, хвороба Альцгеймера)

Хвороби, пов'язані з порушенням репарації Пігментна ксеродерма Пігментна ксеродерма Атаксія-телеангіектазія або синдром Луї-Бар Атаксія-телеангіектазія або синдром Луї-Бар нконі Анемія Фанконі Прогерія дітей (синдром Хатчинсона-Гілфорда) Прогерія дітей (синдром Хатчинсона-Гілфорда) Прогерія дорослих (синдром Вернера) Прогерія дорослих (синдром Вернера)

Атаксія-телеангіектазія або синдром Луї-Бар: А-Р, мозочкова атаксія, порушення координації рухів, телеангіектази – локальне надмірне розширення дрібних судин, імунодефіцит, схильність до онкозахворювань. Синдром Блума: А-Р, висока чутливість до УФ променів, гіперпігментація, почервоніння на обличчі у вигляді метелика.

Трихотіодистрофія: А-Р, нестача сірки в клітинах волосся, ламкість, нагадують тигровий хвіст, аномалії шкіри, зубів, дефекти статевого розвитку. Синдром Кокейна: А-Р, карликовість при нормі гормонів росту, глухота, атрофія зорового нерва, прискорення старіння, чутливі до сонячного світла. Анемія Фанконі: зменшення кількості всіх клітинних елементів крові, скелетні порушення, мікроцефалія, глухота. Причина-порушення вирізування піримідинових димерів і порушення репарації міжланцюжкових зшивок ДНК.

Література: 1. Генетика. За ред. Іванова В.І. М., Жімульов І.Ф. Загальна та молекулярна генетика. Новосибірськ, Мумінов Т.А., Куандиков Є.У. Основи молекулярної біології (курс лекцій). Алмати, Мушкамбаров Н.М., Кузнєцов С.Л. Молекулярна біологія М., 2003.

Незважаючи на високу точність роботи ферментів, що здійснюють реплікацію ДНК, а також на існування механізму коректорської правки, при синтезі нових ланцюгів ДНК все ж таки відбуваються помилки, пов'язані з включенням до їх складу некомплементарних нуклеотидів. Крім того, молекули ДНК піддаються в клітинах впливу різноманітних фізичних та хімічних факторів, що порушують їхню структуру. До найбільш часто виникають пошкоджень ДНК можна віднести такі:

Розрив (b-N)-глікозидних зв'язків між пурином та дезоксирибозою (депуринізація), який найчастіше є наслідком підвищення температури. За добу у клітині людини відбувається від 5000 до 10 000 актів депуринізації;

Спонтанне дезамінування залишків цитозину та аденіну з утворенням, відповідно, залишків урацилу та гіпоксантин (приблизно 100 подій на геном на добу);

Алкілювання азотистих основ під дією хімічних речовин особливого класу ( алкілуючих агентів);

- інтеркаляція(вбудовування) деяких сполук між сусідніми парами нуклеотидів;

Утворення ковалентних зшивок між ланцюгами ДНК під дією біфункціональних агентів;

Освіта, що виникають при поглинанні ультрафіолетового світла (УФ) циклобутанових димерів (рис. 2.2) між сусідніми піримідинами в ланцюзі.

Більшість перерахованих ушкоджень порушує процеси реплікації та експресії генів, наприклад, кожен тіміновий димер ДНК E. coli затримує реплікацію на 10 с. Крім того, ці пошкодження є джерелом мутацій, якщо їхнє виправлення не здійсниться до початку реплікації ДНК.

Найчастіше подібні порушення відбуваються лише в одній із ниток ДНК, при цьому в другій нитці навпроти ушкодження у більшості випадків міститься «правильна» послідовність, яка може бути матрицею для виправлення помилок. Таким чином, подвійна спіраль ДНК, а також те, що в ній закодована інформація про структуру репараційних ферментів, уможливлює унікальний механізм виправлення помилок - репарацію, характерний тільки для одного класу молекул - ДНК.

Репараційних систем та механізмів, що існують у різних організмів, дуже багато, серед них є такі, які є специфічними лише для виправлення пошкоджень одного роду, а є й менш специфічними. Для зручності всі відомі до теперішнього часу репараційні процеси можна розділити на дві категорії: 1) ті, що не вимагають участі реплікації і є безпосереднім виправленням порушень у ДНК; 2) складніші процеси, у яких відбувається репараційна реплікація. Найкраще репараційні механізми вивчені стосовно виправлення ушкоджень, спричинених УФ-опроміненням, – піримідинових димерів (рис. 2.2).

Оскільки в найбільш відомих процесах репарації наслідків УФ-опромінення беруть участь залежні від УФ-світла ферменти, репараційні механізми ділять також на світлову (здатну здійснитися лише на видимому світлі) та темнову (не вимагає видимого світла) репарацію.

До репараційних механізмів прямого виправлення пошкоджень можна віднести дезалкілювання залишків гуаніну та мономеризацію циклобутанових димерів між сусідніми піримідиновими основами. Дезалкілювання метилгуанінових залишків відноситься до темнової репарації і відбувається за участю ферментів, присутніх у клітинах бактерій та живильних. Про 6 -метилгуанін-ДНК-алкіл-трансфераза каталізує перенесення алкільних груп на сульфгідрильні групи залишків цистеїнових ферменту (рис. 2.3).

Розщеплення димерів між піримідиновими нуклеотидами відбувається у процесі фотореактивації- відновлення структури молекул ДНК, пошкоджених УФ-випромінюванням внаслідок подальшого впливу видимого світла (світлова репарація). Відома неферментативна короткохвильова фотореактивація, яка полягає в мономеризації димерів при дії ультрафіолетового випромінювання з довжиною 240 нм хвилі, а також ферментативна фотореактивація. Останню зазвичай і мають на увазі під власне фотореактивацією. Цей процес вимагає участі видимого світла з довжиною хвилі 300-600 нм і здійснюється під дією специфічних фотореактивуючих ферментів (дезоксирибопіримідинфотоліази). Субстратом фотоліази є димери піримідинових основ, з якими вона утворює комплекс (з неушкодженою ДНК фермент не зв'язується). Використовуючи енергію поглиненого світла, фермент руйнує димер без розриву ланцюгів ДНК (рис. 2.4).

Явище фотореактивації поширене у природі і виявлено навіть у таких примітивних мікроорганізмів, як мікоплазми. Фотореактивні ферменти знайдені у деяких вищих рослин і тварин, а також у всіх вивчених бактерій, за винятком Deinococcus radiodurans, який, проте, надзвичайно стійкий до дії УФ-світла: ці бактерії витримують дози у 1000 разів вищі, ніж ті, що вбивають E. coli. При повній відсутності здатності до фотореактивації D. radiodurans має потужну систему ексцизійної репарації.

Репараційні події, пов'язані із заміною спотворених ділянок, не вимагають участі видимого світла і в них, крім інших ферментів, важливу роль відіграють нуклеази двох типів: екзо- та ендонуклеази. Екзонуклеази здійснюють розщеплення ДНК, починаючи з кінців ланцюгів, а ендонуклеази атакують ланцюги у внутрішніх частинах, формуючи ДНК однониткові розриви. Серед різноманіття різних видів репарації, пов'язаної з репаративним синтезом ДНК, можна виділити два основні: ексцизійнуі постреплікативнурепарацію.

Ексцизійна репарація.Відмінною особливістю ексцизійної репарації є видалення пошкодженої ділянки ДНК. Цей вид репарації не настільки специфічний щодо пошкоджень ДНК, як фотореактивація, і за його допомогою можуть виправлятися не тільки піримідинові димери, але і багато інших змін структури ДНК. Ексцизійна репарація (рис. 2.5, А) є багатоетапним процесом і включає наступні події:

1) впізнавання пошкодження в ДНК, яке здійснюється специфічними ендонуклеазами, що виконують та наступну стадію;

2) надрізання одного ланцюга ДНК поблизу пошкодження - інцизія(здійснюють ендонуклеази);

3) видалення групи нуклеотидів разом із пошкодженням - ексцизія(здійснюють екзонуклеази);

4) ресинтез ДНК - заповнення пролому (ДНК-полімеразна активність);

5) відновлення безперервності репарованого ланцюга за рахунок утворення ковалентних зв'язків сахарофосфатного кістяка молекули.

Найкраще механізм ексцизійної репарації вивчений з прикладу темнового видалення піримідинових димерів з ДНК E. coli, опромінених ультрафіолетом. У клітинах кишкової палички за цей процес відповідають гени uvrA-D (кодують структуру ферментів, що вирізають ділянку ланцюга ДНК з димером), а також polА (визначає структуру ДНК-полімерази I, що здійснює репартивний синтез ДНК). Особливістю такого способу ексцизійної репарації є утворення одноланцюгових надрізів з обох боків тімінового димеру.

Деякі організми використовують для репарації ушкоджень, у тому числі пов'язаних з утворенням тімінових димерів, ще один різновид ексцизійної репарації, що передбачає участь у процесі особливого ферменту – N-глікозилази. У цьому випадку першою репаративною подією є розщеплення глікозидного зв'язку між ушкодженою основою (наприклад, одним з тимінів у димері, N-алкільованим пурином та ін.) та дезоксирибозою. Таким чином, має місце локальна апуринізація, або апіримідінізація; з'являється так званий АР-сайт, відомий АР-специфічною ендонуклеазою, яка розщеплює фосфоди ефірну зв'язок поруч із АР-сайтом. Потім пролом заповнюється за допомогою звичайного репаративного синтезу.

У бактеріальних та еукаріотичних клітинах виявлено цілу низку різних N-глікозилаз. Наприклад, урацил-ДНК-глікозилаза дізнається про неправильну пару dG/dU, що виникла в результаті спонтанного дезамінування залишку дезоксицитозину з пари dG/dC. Дезамінування цитозину може призвести до реплікації до виникнення мутантної нуклеотидної пари dA/dT, оскільки з точки зору утворення водневих зв'язків урацил поводиться аналогічно тиміну. Інший, поширений фермент подібного типу, являє собою піримідиновий димер-N-глікозилазу, яка створює апіримідиновий сайт при репарації пошкоджень, пов'язаних з утворенням піримідинових димерів.

Сайти, в яких відбулася депуринізація або депіримідінізація, вищеплюються ферментами АР (апуринові та апіримідинові)-ендонуклеазами. У клітинах про- та еукаріотів є багато різноманітних АР-ендонуклеаз. Деякі з них надрізають ланцюг із 3'-сторони АР-сайту, а інші розщеплюють діефірний зв'язок з 5'-сторони; у будь-якому випадку утворюються 3'-гідроксильний і 5'-фосфорильний кінці. Це дозволяє екзонуклеазі видалити прилеглі залишки по обидва боки надрізу разом із пошкодженням.

Різні варіанти ексцизійної репарації широко поширені у про- та еукаріотичних організмів, у тому числі у ссавців. Порушення процесів ексцизійної репарації можуть призводити до драматичних наслідків. Так, у людей відоме спадкове захворювання. пігментна ксеродерма, основними симптомами якого є підвищена чутливість до сонячного світла, що веде до розвитку раку шкіри. У цих хворих виявлено різноманітні дефекти ексцизійної репарації.

Постеплікативна репарація. Цей тип репарації вимагає участі продуктів генів, задіяних також у рекомбінаційних подіях (rec-гени), і здійснюється в клітинах rec-мутантів, тому його називають ще й рекомбінаційної репарацією. Рекомбінаційна постреплікативна репарація заснована на процесах реплікації та рекомбінації пошкодженої ДНК, вона найменш специфічна з усіх розглянутих типів репарації, оскільки в ній відсутня етап впізнавання ушкодження. Це досить швидкий спосіб відновлення нативнийструктури ДНК у дочірніх (ново синтезованих) ланцюгах: показано, що репарація відбувається вже перші хвилини після опромінення. Особливістю цього процесу є збереження ушкодження у вихідних (материнських) ланцюжках (рис.2.5, б).

Поряд із швидкою існує і повільна постреплікативна репарація, для якої потрібно кілька годин. Її виробляє система ферментів, яка відсутня у неопромінених клітинах та яку індукує опромінення. Цей механізм отримав назву SOS-репарації. Його дивовижною відмінністю є значне збільшення частоти мутацій, незважаючи на те, що ДНК і так вже пошкоджена. Це може бути наслідком використання як матриці ланцюга ДНК, що містить ушкодження.

Постреплікативна репарація існує не тільки у бактерій, а й у клітинах еукаріотів, у тому числі у ссавців.

Репарація – це властивість живої клітини боротися з різними ушкодженнями ДНК. В навколишньому світі існує безліч факторів, здатних викликати незворотні зміни у живому організмі. Щоб зберегти свою цілісність, уникнути патологічних і несумісних із життям мутацій, має існувати система самостійного відновлення. Як порушується цілісність генетичного матеріалу клітини? Розглянемо це питання докладніше. Також з'ясуємо, які існують відновлювальні механізми організму та як вони працюють.

Порушення у ДНК

Молекула дезоксирибонуклеїнової кислоти може бути розірвана як під час біосинтезу, так і під впливом шкідливих речовин. До негативних факторів, зокрема, відносять температуру чи фізичні сили різного походження. Якщо руйнація сталася, клітина запускає процес репарації. Так починається відновлення вихідної структури За репарацію відповідають спеціальні ферментні комплекси, присутні усередині клітин. З неможливістю окремих клітин здійснювати відновлення пов'язані деякі захворювання. Наука, що вивчає процеси репарації, – це біологія. В рамках дисципліни проведено досить багато дослідів та експериментів, завдяки яким стає зрозумілішим процес відновлення. Слід зазначити, що механізми репарації ДНК дуже цікаві, як і історія відкриття та вивчення цього феномену. Які фактори сприяють початку відновлення? Щоб процес запустився, необхідно, щоб на ДНК впливав стимулятор репарації тканин. Що це таке, докладніше розповімо трохи нижче.

Історія відкриття

Це дивовижне явище почав вивчати американський вчений Кельнер. Першим значним відкриттям шляху дослідження репарації став такий феномен, як фотореактивація. Цим терміном Кельнер назвав ефект зниження шкоди від ультрафіолетового опромінення при подальшій обробці пошкоджених клітин яскравим випромінюванням видимого спектру.

"Світлове відновлення"

Згодом дослідження Кельнера отримали своє логічне продовження у роботах американських біологів Сетлоу, Руперта та інших. Завдяки праці цієї групи вчених було достовірно встановлено, що фотореактивація є процесом, який запускається завдяки особливій речовині – ферменту, що каталізує розщеплення димерів тиміну. Саме вони, як з'ясувалося, утворювалися під час експериментів під впливом ультрафіолету. При цьому яскраве видиме світло запускало дію ферменту, який сприяв розщепленню димерів та відновленню початкового стану пошкоджених тканин. У цьому випадку йдеться про світловий різновид відновлення ДНК. Визначимо це чіткіше. Можна сміливо сказати, що світлова репарація - це відновлення під впливом світла початкової структури ДНК після ушкоджень. Однак цей процес не є єдиним, що сприяє усуненню пошкоджень.

"Темнове" відновлення

Через деякий час після відкриття світлової було виявлено темнову репарацію. Це відбувається без будь-якого впливу світлових променів видимого спектра. Ця здатність до відновлення виявилася під час дослідження чутливості деяких бактерій до ультрафіолетових променів і Темнова репарація ДНК - це здатність клітин прибирати будь-які патогенні зміни дезоксирибонуклеїнової кислоти. Але слід сказати, що це не фотохімічний процес, на відміну світлового відновлення.

Механізм "темнового" усунення пошкоджень

Спостереження за бактеріями показали, що згодом після того, як одноклітинний організм отримав порцію ультрафіолету, внаслідок чого деякі ділянки ДНК виявилися пошкодженими, клітина регулює свої внутрішні процеси певним чином. В результаті змінений шматочок ДНК просто відрізається від загального ланцюжка. Проміжки, що вийшло, заново заповнюються необхідним матеріалом з амінокислот. Іншими словами, здійснюється ресинтез ділянок ДНК. Відкриття вченими такого явища, як темнова репарація тканин - це ще один крок у вивченні дивовижних захисних здібностей організму тварини та людини.

Як влаштовано систему репарації

Експерименти, що дозволили виявити механізми відновлення та саме існування цієї здатності, проводилися за допомогою одноклітинних організмів. Але процеси репарації притаманні живим клітинам тварин та людини. Деякі люди страждають Це захворювання спричинене відсутністю здатності клітин ресинтезувати пошкоджену ДНК. Ксеродерма передається у спадок. З чого складається репараційна система? Чотири ферменти, на яких тримається процес репарації - це ДНК-хеліказа, -екзонуклеаза, -полімераза та -лігаза. Перший з цих сполук здатний розпізнавати пошкодження ланцюга молекули дезоксирибонуклеїнової кислоти. Він не лише розпізнає, а й обрізає ланцюг у потрібному місці, щоб видалити змінений відрізок молекули. Саме усунення здійснюється за допомогою ДНК-екзонуклеази. Далі відбувається синтез нової ділянки молекули дезоксирибонуклеїнової кислоти з амінокислот з метою повністю замінити пошкоджений відрізок. Та й фінальний акорд цієї складної біологічної процедури відбувається за допомогою ферменту ДНК-лігази. Він відповідає за прикріплення синтезованої ділянки до пошкодженої молекули. Після того, як всі чотири ферменти зробили свою роботу, молекула ДНК повністю оновлена і всі пошкодження залишаються в минулому. Ось так злагоджено працюють механізми усередині живої клітини.

Класифікація

На даний момент вчені виділяють такі різновиди систем репарації. Вони активуються залежно від різних факторів. До них відносяться:

Реактивація.
Рекомбінаційне відновлення.
Репарація гетеродуплексів.
Ексцизійна репарація.
Возз'єднання негомологічних кінців молекул ДНК.

Всі одноклітинні організми мають як мінімум три ферментні системи. Кожна з них має здатність здійснювати процес відновлення. До цих систем відносять: пряму, ексцизійну та постреплікативну. Цими трьома видами відновлення ДНК мають прокаріоти. Що стосується еукаріотів, то в їхньому розпорядженні знаходяться додаткові механізми, які називаються Miss-mathe і Sos-репарація. Біологія докладно вивчила ці види самовідновлення генетичного матеріалу клітин.

Структура додаткових механізмів

Пряма репарація - це найменш складний спосіб позбавлення патологічних змін ДНК. Її здійснюють спеціальні ферменти. Завдяки їм відновлення структури молекули ДНК відбувається дуже швидко. Як правило, процес протікає протягом однієї стадії. Одним із вищеописаних ферментів є O6-метилгуанін-ДНК-метилтрансферазу. Ексцизійна система репарації - це тип самовідновлення дезоксирибонуклеїнової кислоти, який передбачає вирізання змінених амінокислот та подальшу заміну їх заново синтезованими ділянками. Цей процес вже здійснюється у кілька стадій. У ході постреплікативного відновлення ДНК у структурі цієї молекули можуть утворюватися проломи величиною в один ланцюжок. Потім вони закриваються з участю білка RecA. Постреплікативна система репарації є унікальною тим, що в її процесі відсутня етап розпізнавання патогенних змін.

Хто відповідає за механізм відновлення

На сьогоднішній день вченим відомо, що така найпростіша істота, як кишкова паличка, має не менш як півсотню генів, які відповідають безпосередньо за репарацію. Кожен ген виконує певні функції. До них відносять: розпізнавання, видалення, синтез, прикріплення, ідентифікацію наслідків впливу ультрафіолету тощо. На жаль, будь-які гени, у тому числі й ті, що відповідають за процеси репарації в клітині, зазнають мутаційних змін. Якщо це відбувається, то вони запускають частіші мутації і у всіх клітинах організму.

Чим небезпечне пошкодження ДНК

Щодня ДНК клітин нашого організму наражаються на небезпеку пошкоджень і патологічних змін. Цьому сприяють такі фактори навколишнього середовища, як харчові добавки, хімічні речовини, перепади температур, магнітні поля, численні стреси, що запускають певні процеси в організмі, та багато іншого. Якщо структура ДНК буде порушена, це може спричинити важку мутацію клітини, а може в майбутньому призвести до раку. Саме тому організм має комплекс заходів, покликаних боротися з такими ушкодженнями. Навіть якщо ферментам не вдається повернути ДНК у первозданний вигляд, система репарації працює на те, щоб звести пошкодження до мінімуму.

Гомологічна рекомбінація

Розберемося, що таке. Рекомбінація являє собою обмін генетичним матеріалом у процесі розриву та сполуки молекул дезоксирибонуклеїнової кислоти. У разі, коли в ДНК виникають розриви, починається процес гомологічної рекомбінації. У результаті здійснюється обмін фрагментами двох молекул. Завдяки цьому точно відновлюється початкова структура дезоксирибонуклеїнової кислоти. У деяких випадках може відбуватися проникнення ДНК. Завдяки рекомбінації можлива інтеграція цих двох різнорідних елементів.

Механізм відновлення та здоров'я організму

Репарація – це обов'язкова умова нормального функціонування організму. Зазнаючи щодня і щогодини загрозам ушкоджень і мутацій ДНК, багатоклітинна структура пристосовується та виживає. Це відбувається навіть за рахунок налагодженої системи репарації. Відсутність нормальної відновлювальної здатності спричиняє хвороби, мутації та інші відхилення. До них відносяться різні патології розвитку, онкологія і навіть саме старіння. Спадкові хвороби внаслідок порушень репарації можуть призводити до тяжких злоякісних пухлин та інших аномалій організму. Наразі визначено деякі захворювання, що викликаються саме збоями систем репарації ДНК. Це такі, наприклад, патології, як ксеродерма, неполіпозний рак товстої кишки, трихотіодистрофія та деякі ракові пухлини.

У клітинах є різноманітні "ремонтні бригади", які стежать за збереженням інформації, що зберігається на ДНК. Такі клітинні системи, що виправляють пошкодження ДНК, називають репараційними системами.

У бактерії кишкової палички зараз відомо понад 50 генів, які контролюють процеси репарації. Ці гени кодують ферменти, які вміють, наприклад, вирізати пошкоджені ділянки одного ланцюга ДНК. ДНК-полімераза добудовує це місце ланцюга до норми, а ДНК-лігази "зашивають" розрив у місці вбудованої ділянки. Є спеціальні ферменти, які усувають ушкодження, створювані ультрафіолетом, тощо.

Якщо мутації виникають у якомусь гені системи репарації, це веде до збільшення частоти мутацій. Таким чином є гени, мутації в яких збільшують частоту мутацій в інших генах організму.

Існують і складні клітинні механізми, які забезпечують правильне розходження хромосом у гамети. Якщо ці механізми дають збій, одну гамету потрапляє зайва хромосома, а інший виникає брак хромосоми. Такі геномні мутації зазвичай призводять до загибелі ембріонів, вроджених каліцтв або до спадкових захворювань.

Щодня в молекулах ДНК кожної клітини людського тіла близько 100000 ланок ушкоджуються за рахунок різноманітних ендогенних процесів та екзогенних генотоксичних впливів. Пошкодження ДНК може призводити до появи мутацій, провокувати загибель клітини або поштовхом до її злоякісного переродження. Для запобігання таким наслідкам у клітині існує кілька взаємодоповнюючих ферментативних систем, які підтримують процеси, що мають загальну назву репарація ДНК. Головна мета всіх цих систем - відновлення послідовності ДНК, що існувала до її пошкодження, або, якщо це неможливо, зведення змін до мінімуму. Системи репарації ДНК забезпечують точність відтворення та збереження генетичної інформації. Репаративні механізми, які використовує клітина підтримки стабільності інформації, закладеної в ДНК універсальні - функціональна, котрий іноді структурна гомологія елементів, утворюють ці механізми, простежується від бактерій до людини. Чим складніше клітина, тим більше структурних і регуляторних генів та його продуктів беруть участь у процесах репарації ДНК, хоча важлива схема конкретного процесу, зазвичай, залишається незмінною. Репаративні механізми утворюють складну мережу, пов'язану з функціональними зв'язками або запозиченнями структурних елементів, що забезпечує баланс між стабільністю інформації в ДНК та її еволюційною мінливістю. Точність відтворення ДНК та передачі інформації, в ній закладеної, забезпечується двома матричними процесами – реплікацією та транскрипцією ДНК. Хоча ДНК-полімераза має коригуючу активність, реплікація не абсолютно точна, і, якщо виникають неспарені основи, то системи корекції основ виправляють помилку.

Якщо ДНК з'являються одно- і двунитевые розриви, то дію вступає гомологічна рекомбінація , яка з допомогою сестринських обмінів точно відновлює цілісність ДНК. Однак рекомбінація - це "важка артилерія", і призначена вона найбільше для мінливості. При вступі в клітину ДНК, яка лише частково гомологічна ДНК клітини, ймовірна її інтеграція в геном за допомогою гомологічної рекомбінації. На варті точності цього процесу стоїть система корекції неспарених основ з довгою ділянкою, що ресентезується (ДКНО), яка перериває рекомбінацію, якщо гомологія взаємодіючих молекул ДНК надмірно недосконала. Більше того, ДКНО ліквідує більшість рекомбінаційних забудов на рівні онДНК, якщо вони порушують комплементарність парування нуклеотидів. Тим самим ДКНО знижує частоту рекомбінаційних обмінів у ДНК. Так система ДКНО відстоює стабільність геному та його видоспецифічність. Спадкові порушення клітинних репаративних систем у людини призводять до тяжких вроджених аномалій та/або схильності до розвитку ракових захворювань.

Системи репарації відрізняються один від одного субстратами, ферментами і механізмами усунення пошкоджених ланок, що використовуються. На даний момент виділяють 6 основних систем репарації-систему реактивації та інші системи репарації, які діють з деградацією та повторним синтезом пошкодженої частини ДНК.

У разі сильного пошкодження ДНК - утворення дволанцюгових розривів, великих однониткових проломів, зшивок між ланцюжками - функціонує система рекомбінаційної репарації, при якій пошкоджена ДНК виправляється за рахунок рекомбінації з повноцінною копією генетичного матеріалу, якщо вона присутня в клітині. Дволанцюгові розриви також можуть лігуватися в процесі возз'єднання негомологічних кінців, що, однак, призводить до втрати частини генетичного матеріалу.

Неканонічні пари основ і короткі гетеродуплекси в ДНК дізнаються системою репарації гетеродуплексів, яка видаляє фрагмент ДНК довжиною до декількох сотень дезоксинуклеотидів, що включає неканонічний елемент, і забудовує пролом, що утворився.