ওয়েস্টার্ন ব্লট পদ্ধতি দ্বারা Borrelia, IgM শ্রেণীর অ্যান্টিবডি (অ্যান্টি-Borrelia IgM, ওয়েস্টার্ন ব্লট)। ওয়েস্টার্ন ব্লট (ওয়েস্টার্ন ব্লট, প্রোটিন ইমিউনোব্লট, ওয়েস্টার্ন ব্লট) ওয়েস্টার্ন ব্লট চালানোর ত্রুটি

ব্লটিং(ইংরেজী থেকে " দাগ" - স্পট) - এনকে, প্রোটিন এবং লিপিডগুলিকে একটি কঠিন স্তরে স্থানান্তর করা, উদাহরণস্বরূপ, একটি ঝিল্লি এবং তাদের স্থিরকরণ।

• পলিঅ্যাক্রিলামাইড জেলে ইলেক্ট্রোফোরেসিস:
o ইউরিয়া যোগ করার সাথে ডিনাচারিং অবস্থার অধীনে - সংক্ষিপ্ত একক-স্ট্র্যান্ডেড এনএ এর বিচ্ছেদ;
o সোডিয়াম ডোডেসিল সালফেট (ল্যামেমলি ইলেক্ট্রোফোরেসিস) যোগ করার সাথে বিকৃত অবস্থার অধীনে - আণবিক ওজন দ্বারা প্রোটিন পৃথকীকরণ;
o নেটিভ অবস্থায় - ত্রিমাত্রিক গঠন অনুযায়ী প্রোটিন পৃথকীকরণ;
• আইসোইলেকট্রিক ফোকাসিং - আইসোইলেকট্রিক পয়েন্ট (পিআই) দ্বারা প্রোটিন আলাদা করা;
• দ্বি-মাত্রিক (2D) ইলেক্ট্রোফোরেসিস - দুটি দিকে প্রোটিন আলাদা করতে - আইসোইলেকট্রিক পয়েন্ট এবং আণবিক ওজন দ্বারা;
• অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরসিস - এনসি বিচ্ছেদ:
o রৈখিক খণ্ডের দৈর্ঘ্য বরাবর;
o রিং অণুর "সুপারকয়লিং" দ্বারা;
• পাতলা স্তর ক্রোমাটোগ্রাফি - লিপিড কমপ্লেক্স থেকে লিপিডের বিচ্ছেদ।

• অণুর প্রসারণ - ধীর পরিবহন, প্রায়ই লিপিডের জন্য ব্যবহৃত হয়;
• কৈশিক ব্লটিং - ঝিল্লিটি জেলের বিরুদ্ধে চাপা হয়, এটির উপরে ফিল্টার পেপারের একটি স্তুপ স্থাপন করা হয়, স্থানান্তর বাফারটি জেলটিকে ময়শ্চারাইজ করে এবং কৈশিক শক্তির ক্রিয়ায় উঠে যায়, ফিল্টার পেপারটি ভিজিয়ে দেয় এবং জেল থেকে ম্যাক্রোমলিকুলগুলিকে স্থানান্তর করে। ঝিল্লি; কৈশিক ব্লটিং করা যেতে পারে:
জেল বাফার ময়শ্চারাইজিং সহ চেম্বারগুলিতে - "আধা-শুষ্ক" স্থানান্তর;
o বাফারে জেল নিমজ্জন সহ চেম্বারে;

• ভ্যাকুয়াম ব্লটিং - কৈশিক ব্লটিং-এর মতোই, তবে ফিল্টার পেপার ভেজানোর মাধ্যমে তৈরি কৈশিক শক্তির পরিবর্তে ভ্যাকুয়াম ব্যবহার করে স্থানান্তর ত্বরান্বিত হয়;
• ইলেক্ট্রোব্লটিং - ঝিল্লিতে চার্জযুক্ত ম্যাক্রোমোলিকুলের স্থানান্তর বৈদ্যুতিক প্রবাহের প্রভাবে ঘটে;
• UV বিকিরণ বা গরম করার ক্রিয়াকলাপের অধীনে ঝিল্লিতে NK এর "সেলাই" - নাইলন ঝিল্লিতে চূড়ান্ত ফিক্সিংয়ের জন্য;
• ডট ব্লটিং (স্লট ব্লটিং) - জেলে বা টিএলসি প্লেটে অণুগুলির পূর্বে পৃথকীকরণ ছাড়াই নমুনাটি সরাসরি ঝিল্লিতে বিন্দু বা ড্যাশ আকারে প্রয়োগ করা হয়।

• PVDF ঝিল্লি (পলিভিনিলাইডেন ফ্লোরাইড);
• NC ঝিল্লি (নাইট্রোসেলুলোজ);
• নাইলন ঝিল্লি (NDT এর জন্য ব্যবহৃত)।

• স্টেনিং - ডাই বাইন্ডিং (সিলভার আয়ন, কুমাসি, পোনসেউ, ইথিডিয়াম ব্রোমাইড) সরাসরি সনাক্তযোগ্য ম্যাক্রোমলিকুলসের সাথে;
• ইমিউনোকেমিক্যাল লেবেলিং - ম্যাক্রোমোলিকিউলগুলির লেবেল লেবেলযুক্ত অ্যান্টিবডিগুলি বিশেষভাবে তাদের সাথে আবদ্ধ হওয়ার কারণে ঘটে, সনাক্তকরণ করা হয়:
o immunostaining - অ্যান্টিবডিগুলিকে রঞ্জক দ্বারা লেবেল করা হয়, একটি নির্দিষ্ট তরঙ্গদৈর্ঘ্যের আলোর শোষণ রেকর্ড করা হয়;
o এনজাইম-সংযুক্ত ইমিউনোসর্বেন্ট - অ্যান্টিবডিগুলিকে একটি এনজাইম দিয়ে লেবেল করা হয়, এনজাইম্যাটিক প্রতিক্রিয়া (ELISA) এর সময় উত্পাদিত রঙিন পণ্যের পরিমাণ রেকর্ড করা হয়;
o কেমিলুমিনেসেন্ট - অ্যান্টিবডিগুলিকে একটি রিপোর্টার এনজাইম দিয়ে লেবেল করা হয়, যা একটি সাবস্ট্রেটের উপস্থিতিতে লুমিনেসেন্স নির্গত করে, হালকা নির্গমন রেকর্ড করা হয়
নির্দিষ্ট তরঙ্গদৈর্ঘ্য;
o ফ্লুরোসেন্ট - অ্যান্টিবডিগুলিকে একটি ফ্লুরোসেন্ট লেবেল দিয়ে লেবেল করা হয়, যা একটি নির্দিষ্ট তরঙ্গদৈর্ঘ্যের আলো দ্বারা উত্তেজিত হয়, আলোর নির্গমন রেকর্ড করা হয়
দীর্ঘতর তরঙ্গদৈর্ঘ্য অঞ্চল;
• বিকিরণ লেবেল - বিকিরণ লেবেল (রেডিওআইসোটোপ) ম্যাক্রোমোলিকুলে প্রবর্তিত হয়, সনাক্তকরণ ব্যবহার করে করা হয়:
o অটোরেডিওগ্রাফি (ঝিল্লির উপর একটি ফিল্ম চাপানো);
o রেডিও ইমেজিং (বিকিরণ নির্গমনের পরিমাণগত সংকল্প এবং চিহ্নের আপেক্ষিক অবস্থানের একটি ছবি নির্মাণ);
• সংকরকরণ - একটি পরিপূরক কাঠামোর সাথে লেবেলযুক্ত অলিগোনিউক্লিওটাইড দ্বারা নিউক্লিক অ্যাসিডের বাঁধন, একটি নিয়ম হিসাবে সনাক্তকরণ, লেবেলের বিকিরণ বা ফ্লুরোসেন্সের নির্গমন রেকর্ড করে বাহিত হয়;
• ভর স্পেকট্রোমেট্রি - লিপিডের সরাসরি কাঠামোগত বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহৃত হয়।

• দক্ষিণ ব্লটিং(সাউদার্ন ব্লটিং) - এডউইন সাউদার্নের নামে, যিনি একটি পদ্ধতি প্রস্তাব করেছিলেন - একটি নমুনায় ডিএনএ ক্রম নির্ধারণ করা এবং জিনোমিক ডিএনএতে জিনের অনুলিপির সংখ্যা নির্ধারণ করা। ঝিল্লিতে স্থানান্তর করা হয় নমুনার পরিপাক এবং এন্ডোনিউক্লিজকে খণ্ডে পরিণত করার এবং এগারোজ জেলে ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা তাদের ভগ্নাংশের মাধ্যমে। ঝিল্লি বিশ্লেষণ পরিচিত অনুক্রমের লেবেলযুক্ত oligonucleotides সঙ্গে সংকরকরণ দ্বারা সঞ্চালিত হয়;
• উত্তর blotting- নমুনায় আরএনএ ক্রম নির্ধারণ এবং জিনের প্রকাশের অধ্যয়ন (mRNA নির্ধারণ)। সাউদার্ন ব্লটিং-এর মতোই, কিন্তু নমুনা থেকে বিচ্ছিন্ন আরএনএ অণু পরীক্ষা করা হয়, এন্ডোনিউক্লিজ দ্বারা বিভাজন ছাড়াই। অণুর বিভাজন একটি অ্যাগারোজ জেলে ফর্মালডিহাইড যোগ করে (আরএনএ বিকৃতকরণের জন্য) বা ইউরিয়া যোগ করার সাথে একটি পলিঅ্যাক্রিলামাইড জেলে (মাইক্রোআরএনএ বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহৃত হয়) সঞ্চালিত হয়। ঝিল্লির উপর আরএনএ অণুগুলির অস্থিরতা ভ্যাকুয়ামের নীচে গরম করার কারণে বা UV বিকিরণ ব্যবহার করে "সেলাই" করার কারণে ঘটে;
• পশ্চিমা শোষক- প্রোটিন ইমিউনোব্লটিং - একটি বিশ্লেষণমূলক পদ্ধতি যা একটি নমুনায় নির্দিষ্ট প্রোটিন নির্ধারণ করতে ব্যবহৃত হয়। একটি পলিঅ্যাক্রিলামাইড জেলে প্রোটিন পৃথকীকরণের আগে ঝিল্লিতে স্থানান্তর করা হয়। ঝিল্লিতে প্রোটিনের বিশ্লেষণ ইমিউনোকেমিক্যালভাবে করা হয়;
• সুদূর পশ্চিমী ব্লটিং- প্রোটিন ব্লটিং, প্রোটিন-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া নির্ধারণ করতে ব্যবহৃত হয়, পশ্চিমা ব্লটিং এর মতো, তবে অ্যান্টিবডির পরিবর্তে, অন্যান্য প্রোটিন ব্যবহার করা হয় যা বিশেষভাবে অধ্যয়নের অধীনে প্রোটিনের সাথে আবদ্ধ হয়;
• দক্ষিণ-পশ্চিম ব্লটিং- ডিএনএ-বাইন্ডিং প্রোটিন এবং ডিএনএ অণুতে প্রোটিন-বাইন্ডিং সাইটগুলির নির্ণয় - পশ্চিমী ব্লটিং-এর মতো, কিন্তু পলিঅ্যাক্রাইলামাইড জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস ডিনাচার করার পরে, প্রোটিনগুলি ইউরিয়ার উপস্থিতিতে সোডিয়াম ডোডেসিল সালফেট থেকে ধুয়ে ফেলা হয় এবং ডিফিউশনের কারণে নাইট্রোসেলুলোজ ঝিল্লিতে স্থানান্তরিত হয়। . একটি নমুনা হিসাবে, জিনোমিক ডিএনএ-এর একটি বৃহত্তর অধ্যয়নকৃত খণ্ডের বিভাজন দ্বারা প্রাপ্ত বিভিন্ন দৈর্ঘ্যের লেবেলযুক্ত ডিএনএ খণ্ডগুলি ব্যবহার করা হয়। আবদ্ধ ডিএনএ অণুগুলি তারপর প্রতিটি প্রোটিন-ডিএনএ কমপ্লেক্স থেকে ধুয়ে ফেলা হয় এবং পলিঅ্যাক্রিলামাইড জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়;
• ইস্টার্ন ব্লটিং- প্রোটিনের অনুবাদ-পরবর্তী পরিবর্তনের সংকল্প (লিপিড, গ্লাইকোপলিস্যাকারাইডস, তাদের সাথে যুক্ত ফসফেট অবশিষ্টাংশ) - ওয়েস্টার্ন ব্লটিং এর মতো, তবে অ্যান্টিবডিগুলি প্রোটিনের জন্য নয়, লিপিড, গ্লাইকোপলিস্যাকারাইড ইত্যাদিতে ব্যবহৃত হয়। এছাড়াও, অ্যান্টিবডি ছাড়াও, অন্যান্য প্রোটিন অণু যা অধ্যয়নকৃতদের সাথে আবদ্ধ থাকে (উদাহরণস্বরূপ, লেকটিন) নমুনা হিসাবে ব্যবহৃত হয়;
• সুদূর পূর্ব ব্লটিং- উচ্চ কর্মক্ষমতা পাতলা স্তর ক্রোমাটোগ্রাফি দ্বারা পৃথক লিপিড বিশ্লেষণ. ঝিল্লিতে স্থানান্তর, একটি নিয়ম হিসাবে, প্রসারণ দ্বারা বাহিত হয়। নিবন্ধন সরাসরি ভর-স্পেকট্রোমেট্রিক কাঠামোগত বিশ্লেষণ দ্বারা বাহিত হয়.

একবার ডিএনএ, আরএনএ, বা প্রোটিন আলাদা হয়ে গেলে, তাদের অবশ্যই একটি জেলে সনাক্তকরণ এবং অন্যান্য অপারেশনের জন্য কঠিন সমর্থনে স্থানান্তর করতে হবে যা একটি জেলে কঠিন। স্থানান্তর প্রক্রিয়া নেতৃস্থানীয় অণুর স্থিরকরণ , অর্থাৎ স্থির অবস্থায় ফিক্সেশন বলা হয় blotting (ইংরেজীতে. - blotting ) নাইলন বা নাইট্রোসেলুলোজ ঝিল্লি একটি সাবস্ট্রেট হিসাবে ব্যবহৃত হয়।

ব্লটিং(ইংরেজি ব্লটিং থেকে - ব্লটিং) হল ইলেক্ট্রোফোরেটিক ডিএনএ টুকরাগুলিকে নাইট্রোসেলুলোজ দিয়ে তৈরি একটি বিশেষ ফিল্মে (ঝিল্লি) স্থানান্তর করার একটি পদ্ধতি যা একক-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ অণুকে আবদ্ধ করে (অচল করে)।

দক্ষিণ ব্লটিং(লেখকের নামে যিনি এটি প্রস্তাব করেছেন) কৈশিক প্রভাবের কারণে ডিএনএ খণ্ডগুলির গতিবিধির উপর ভিত্তি করে। ফিল্টার পেপার ব্যবহার করে অ্যাগারোজ জেলে ডিএনএ খণ্ডগুলিকে নাইট্রোসেলুলোজ ফিল্মে স্থানান্তর করার প্রক্রিয়াটি ব্লটিং এর মতো।

বিশ্লেষণটি নিম্নরূপ বাহিত হয়:

- বিচ্ছিন্ন, বিশুদ্ধ, বিকৃত এবং খণ্ডিত ডিএনএ একটি অ্যাগারোজ জেল শীটে স্থাপন করা হয়, যেখানে খণ্ডগুলি ইলেক্ট্রোফোরেটিক্যালি ভর এবং চার্জ দ্বারা পৃথক করা হয়।

– অ্যাগারোজ জেলের শীটটি ঘনীভূত স্যালাইন (বাফার) দ্রবণে ভেজা ফিল্টার পেপারে স্থাপন করা হয়।

- তারপরে একটি নাইট্রোসেলুলোজ ফিল্টার জেলে প্রয়োগ করা হয়, যেখানে একক-অবস্থিত ডিএনএ টুকরোগুলির অস্থিরতা (বা শোষণ বা ফিক্সেশন) ঘটে।

- শুকনো ফিল্টার পেপারের শীটগুলির একটি স্তুপ ফিল্টারের উপরে স্থাপন করা হয়, যা জেলের মাধ্যমে বাফার দ্রবণের একটি ধীর প্রবাহ সরবরাহ করে (অর্থাৎ এক ধরণের কৈশিক পাম্প হিসাবে কাজ করে)। অ্যাগারোজ জেলের মধ্য দিয়ে যাওয়া স্যালাইন দ্রবণটি ডিএনএ খণ্ডের সাথে বহন করে যা নাইট্রোসেলুলোজ দ্বারা ধরে রাখা হয় এবং এতে আবদ্ধ হয় এবং দ্রবণটি শুকনো ফিল্টার পেপার দ্বারা শোষিত হয়।

– এর পরে, ডিএনএ ক্ষার দিয়ে বিকৃত করা হয় এবং ফিল্টারটিকে 80 0 সেন্টিগ্রেড তাপমাত্রায় ভ্যাকুয়ামে রাখা হয়, যার ফলস্বরূপ একক-স্ট্র্যান্ড ডিএনএ খণ্ডগুলি নাইট্রোসেলুলোসে অপরিবর্তনীয়ভাবে স্থির (স্থির) হয়। এই ক্ষেত্রে, স্থির ডিএনএ ব্যান্ডগুলির বিন্যাসটি জেলে তাদের অবস্থানের সাথে হুবহু মিলে যায়।

- ফিল্টারের সাথে আবদ্ধ ডিএনএ একটি লেবেলযুক্ত ডিএনএ প্রোবের সাথে একটি দ্রবণে স্থাপন করা হয়, যেখানে সংকরায়ন ঘটে। শুধুমাত্র এর পরিপূরক ডিএনএ খণ্ডগুলোই একটি নির্দিষ্ট প্রোবের সাহায্যে হাইব্রিডাইজ করবে (হাইড্রোজেন বন্ড তৈরি করবে), যা এক্স-রে ফিল্মে হালকা স্ট্রাইপ হিসাবে সনাক্ত করা যেতে পারে, অর্থাৎ নাইট্রোসেলুলোজ ফিল্টারের অটোগ্রাফ

বিন্দু blotting. ডট ব্লট প্রস্তুত করতে, ডিএনএ বা আরএনএ প্রস্তুতি সরাসরি ফিল্টারে প্রয়োগ করা হয়। ওষুধের ফোঁটাগুলি ফিল্টারে বিন্দুর মতো দেখায়, যা ব্লটিং ধরণের নাম ব্যাখ্যা করে (ইংরেজি ডট - ডট)। 1) আল্ট্রাসাউন্ডের সাহায্যে প্রিট্রিটেড জিনোমিক ডিএনএ থেকে দৈর্ঘ্যে 5-10 বেস জোড়ার টুকরা তৈরি হয়।

2) ডিএনএ বা আরএনএ প্রোবগুলিকে প্রোবের জন্য উপলব্ধ করতে, তাদের অবশ্যই বিকৃত হতে হবে, যেমন একক আটকা পড়া ফর্ম রূপান্তরিত. এটি 100 ডিগ্রি সেলসিয়াসের তাপমাত্রার প্রভাবে ঘটে।

3) বিকৃত নিউক্লিক অ্যাসিডগুলি বরফের উপর সঞ্চিত হয়: তাপমাত্রার দ্রুত হ্রাস তাদের পুনর্নবীকরণকে বাধা দেয়, যেমন চেইনের পরিপূরক জোড়া। বিকৃত ডিএনএ বা আরএনএ সরাসরি ফিল্টারে প্রয়োগ করা হয়, যা প্রোব ধারণকারী দ্রবণে ইনকিউবেট করা হয়।

4) যাতে বিশ্লেষিত নিউক্লিক অ্যাসিড দ্রবণে না যায়, এটি অবশ্যই ফিল্টারে (মেমব্রেন) স্থির করতে হবে। এর জন্য, দুটি ধরণের ফিল্টার ব্যবহার করা হয়: নাইট্রোসেলুলোজ এবং নাইলন।

একটি নাইট্রোসেলুলোজ ফিল্টারে নিউক্লিক অ্যাসিডগুলিকে স্থির করার জন্য, ভ্যাকুয়ামে 80 ডিগ্রি সেলসিয়াসে ভাজা ব্যবহার করা হয় এবং একটি নাইলন ফিল্টারে, 3-5 মিনিটের জন্য UV বিকিরণ ব্যবহার করা হয়।

5) আইসোটোপ-লেবেলযুক্ত প্রোবের সাথে নিউক্লিক অ্যাসিড প্রস্তুতির ইনকিউবেশনের পরে, অটোরাডিওগ্রাফি একটি বিশেষ ক্যাসেটে বা অ-তেজস্ক্রিয় পদ্ধতি দ্বারা সনাক্তকরণ বাহিত হয়।

ডট ব্লটিং আপনাকে শুধুমাত্র একটি প্রশ্নের উত্তর দিতে দেয়: একটি প্রদত্ত নমুনায় একটি পছন্দসই নিউক্লিওটাইড ক্রম আছে কি?

উত্তর দাগ বিশ্লেষণপ্রযোজ্য:

1) RNA এর বিচ্ছিন্নতা এবং বিশ্লেষণের জন্য (উদাহরণস্বরূপ, একটি প্রদত্ত জিন থেকে পড়া mRNA একটি প্রদত্ত কোষের প্রকারে উপস্থিত আছে কিনা তা খুঁজে বের করার জন্য, যেমন জিনটি প্রকাশ করা হয়েছে কিনা;

2) এই আরএনএর পরিমাণ এবং প্রদত্ত কোষের প্রকারের বিকাশে এর পরিবর্তনগুলি নির্ধারণ করতে;

3) কিছু জিনের প্রতিলিপির আকার নির্ধারণ করা।

এই ক্ষেত্রে, কোষ থেকে বিচ্ছিন্ন আরএনএ অণুগুলি জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস ব্যবহার করে আকার দ্বারা পৃথক করা হয় এবং তারপর একটি ফিল্টারে স্থানান্তরিত হয়। লেবেলযুক্ত সিঙ্গেল-স্ট্র্যান্ডেড প্রোবের সাথে হাইব্রিডাইজেশনের পরে, আরএনএ এবং প্রোবের হাইব্রিডাইজেশন (হোমোলজি) সাইটগুলি চিহ্নিত করা হয়।

যদি কাঙ্খিত জিনের (বা mRNA) নিউক্লিওটাইড ক্রম জানা না থাকে, তবে যে প্রোটিনটির সংশ্লেষণ এটি নিয়ন্ত্রণ করে তা জানা যায়, তবে অল্প পরিমাণ বিশুদ্ধ প্রোটিন বিচ্ছিন্ন করা যেতে পারে, এর কিছু অংশের অ্যামিনো অ্যাসিড ক্রম নির্ধারণ করা যেতে পারে ( 5-6 অ্যামিনো অ্যাসিড অবশিষ্টাংশের জ্ঞান যথেষ্ট)। জেনেটিক কোডের সারণী ব্যবহার করে, এমআরএনএ (অথবা জিন নিজেই) যে একটি প্রদত্ত অ্যামিনো অ্যাসিড ক্রম এনকোড করে সেই বিভাগে সমস্ত সম্ভাব্য নিউক্লিওটাইড ক্রম স্থাপন করা সম্ভব। এই ক্ষেত্রে, জিন লাইব্রেরিতে পছন্দসই ক্লোনগুলি অনুসন্ধান করার জন্য একটি প্রোব সংশ্লেষিত করা যেতে পারে।

ওয়েস্টার্ন ব্লটিনজি(ইমিউনোইলেক্ট্রব্লটিং, প্রোটিন ব্লটিং) অনন্য প্রোটিন সনাক্ত করার একটি পদ্ধতি। এটি অত্যন্ত নির্দিষ্ট অ্যান্টিজেন-অ্যান্টিবডি মিথস্ক্রিয়ার ঘটনার উপর ভিত্তি করে। এইভাবে, অ্যান্টিজেন (লক্ষ্য) হল প্রোটিনটি নির্ধারণ করা হচ্ছে এবং প্রোব হল এটির অ্যান্টিবডি।

গবেষণাধীন প্রোটিনের অ্যান্টিবডি বিভিন্ন উপায়ে পাওয়া যায়। সবচেয়ে সহজ হল একটি পরীক্ষাগার প্রাণীর (সাধারণত একটি খরগোশ) রক্ত ​​​​প্রবাহে একটি বিশুদ্ধ প্রোটিন নমুনার প্রবর্তন। তার শরীরে এই বিদেশী প্রোটিনের জন্য অ্যান্টিবডি (ইমিউনোগ্লোবুলিন) তৈরি হয়। এগুলি প্রাথমিক অ্যান্টিবডি যা লক্ষ্য প্রোটিনের সাথে যোগাযোগ করবে।

যাইহোক, এই অ্যান্টিবডিগুলিতে সরাসরি সনাক্তকরণের জন্য একটি লেবেল প্রবর্তন করা যুক্তিসঙ্গত হবে না। বিভিন্ন প্রোটিন সনাক্ত করতে, বিভিন্ন অ্যান্টিবডি লেবেল করা প্রয়োজন, যা তাদের উচ্চ ব্যয়ের দিকে পরিচালিত করবে। এটি ব্যবহার করা আরও যুক্তিসঙ্গত বলে প্রমাণিত হয়েছে সার্বজনীন অ্যান্টিবডি – সংযোজিত অ্যান্টি-ইমিউনোগ্লোবুলিন, যা আসলে, অ্যান্টিবডিগুলির অ্যান্টিবডিগুলি একটি অ্যান্টিজেন হিসাবে একটি সনাক্তযোগ্য প্রোটিন ব্যবহার করে উত্পাদিত হয়৷ উদাহরণ স্বরূপ, খরগোশের আইজি-তে সংযোজিত অ্যান্টি-ইমিউনোগ্লোবুলিন বিভিন্ন অ্যান্টিজেনের জন্য খরগোশে সংশ্লেষিত সমস্ত ইমিউনোগ্লোবুলিনের সাথে যোগাযোগ করবে। সুতরাং, এই সর্বজনীন সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডিগুলিই একটি আইসোটোপিক বা অ-তেজস্ক্রিয় লেবেল বহন করে। একটি অ-আইসোটোপিক লেবেল ছাড়াও, যা অনেকগুলি প্রতিক্রিয়ার সময় একটি অদ্রবণীয় রঙিন যৌগ গঠনের দিকে পরিচালিত করে (নিউক্লিক অ্যাসিড ব্লটিং এর ক্ষেত্রে), উচ্চ সংবেদনশীলতা সহ একটি কেমিলুমিনেসেন্ট লেবেল প্রায়শই ব্যবহৃত হয়।

1) হোমোজেনেট থেকে প্রোটিন নিষ্কাশন

2) পলিঅ্যাক্রিলামাইড জেলে (PAAG) এসডিএস-ইলেক্ট্রোফোরসিস ব্যবহার করে আণবিক ওজন দ্বারা প্রোটিন পৃথক করা। এসডিএস ইলেক্ট্রোফোরসিস পদ্ধতিতে নেটিভ প্রোটিনের বিকৃতকরণ জড়িত। এইভাবে, একই আণবিক ওজন সহ প্রোটিন অণুগুলি জেলে একই পথ দিয়ে যাবে এবং একটি ব্যান্ড আকারে লাইন আপ করবে। যেহেতু বিভিন্ন আকারের প্রোটিন অণু মিশ্রণে উপস্থিত থাকে, তাই অনেকগুলি ব্যান্ড গঠিত হয়। ইলেক্ট্রোফোরসিসের ফলাফলগুলি প্রোটিন স্টেনিং (Coomassie ব্রিলিয়ান্ট ব্লু, অ্যামিডো ব্ল্যাক, সিলভার স্টেনিং) দ্বারা কল্পনা করা যেতে পারে। সিলভার স্টেনিংয়ের একটি অনন্য সংবেদনশীলতা রয়েছে, যা আপনাকে ফলাফল ব্যান্ডে শুধুমাত্র 0.1 এনজি প্রোটিন সনাক্ত করতে দেয়। জেলে প্রয়োগ করা প্রোটিনের পরিমাণ নিয়ন্ত্রণ করার জন্য এটি খুবই গুরুত্বপূর্ণ।

3) জেল থেকে ঝিল্লিতে প্রোটিন স্থানান্তর। এটি করা হয় কারণ পলিঅ্যাক্রিলামাইড বড় ইমিউনোগ্লোবুলিন অণুকে প্রোটিনে ছড়িয়ে যেতে দেয় না। এবং ঝিল্লিতে স্থির প্রোটিন অ্যান্টিবডিগুলির জন্য উপলব্ধ হয়ে যায়। নিউক্লিক অ্যাসিড ব্লটিং এর বিপরীতে, ঝিল্লিতে প্রোটিন স্থানান্তর বৈদ্যুতিক শক্তির প্রভাবে ঘটে, যেমন একটি বৈদ্যুতিক ক্ষেত্রে।

4) ফলস্বরূপ দাগটি প্রোটিন অ্যান্টিসিরাম এবং তারপরে অ্যান্টিইমিউনোগ্লোবুলিন দিয়ে ইনকিউব করা হয়। ফলাফল ব্যবহৃত লেবেল প্রকার অনুযায়ী রেন্ডার করা হয়.

বিধিনিষেধ:

1) অধ্যয়নকৃত টুকরোগুলির বড় আকার, যা উল্লেখযোগ্যভাবে ডিএনএ প্রোবের দৈর্ঘ্য অতিক্রম করে এবং সরাসরি আণবিক বিশ্লেষণকে বাধা দেয়;

2) মূল ডিএনএ অণুতে সংশ্লিষ্ট সীমাবদ্ধতা সাইটগুলির উপস্থিতি দ্বারা নির্ধারিত অধ্যয়নকৃত ক্রমগুলির প্রান্তগুলির একটি নির্বিচারে পছন্দের অসম্ভবতা;

3) প্রচুর পরিমাণে ভাল-বিশুদ্ধ উচ্চ-আণবিক জিনোমিক ডিএনএর প্রয়োজন (প্রতি প্রতিক্রিয়ায় কমপক্ষে 10 μg, যা 0.5-1 মিলি রক্তের সমতুল্য),

4) জিনোমিক হাইব্রিডাইজেশনের জন্য - কমপক্ষে 109 ডাল / মিনিট * μg এর উচ্চ নির্দিষ্ট কার্যকলাপ সহ তেজস্ক্রিয় ডিএনএ প্রোবের উপস্থিতি, সীমিত সময়ের জন্য কাজ করে এবং একটি বিশেষভাবে সজ্জিত আইসোটোপ ইউনিট। উপরন্তু, অটোগ্রাফের একটি দীর্ঘ এক্সপোজার ফলাফল প্রাপ্তির জন্য সময়কে উল্লেখযোগ্যভাবে দীর্ঘায়িত করে।

5) উচ্চ শ্রম তীব্রতা গবেষণা

ওয়েস্টার্ন ব্লটিং কি?

জটিল মিশ্রণ বা বিভিন্ন টিস্যুর নির্যাসে প্রোটিন সনাক্তকরণ প্রায়শই সম্মুখীন হওয়া সমস্যাগুলির মধ্যে একটি। নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডি হিসাবে এই জাতীয় সরঞ্জাম ব্যবহার করে, ন্যূনতম সময় এবং আর্থিক ব্যয় সহ অধ্যয়নের অধীনে প্রোটিন নির্ধারণ করা সম্ভব।

পশ্চিমা ব্লটিং পদ্ধতিতে, প্রথম পর্যায়ে, সোডিয়াম ডোডেসিল সালফেট (SDS) এর উপস্থিতিতে ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা প্রোটিনের মিশ্রণ আলাদা করা হয়, তারপর ইলেক্ট্রোব্লটিং দ্বারা নাইট্রোসেলুলোজ ঝিল্লিতে স্থানান্তরিত করা হয়। এই পদ্ধতির সারমর্ম এই সত্যে নিহিত যে ইলেক্ট্রোফোরসিসের পরে জেলটি ফিল্টার পেপারের স্তরগুলির মধ্যে একটি নাইট্রোসেলুলোজ ঝিল্লিতে স্থাপন করা হয়। এইভাবে একত্রিত "স্যান্ডউইচ" একটি বৈদ্যুতিক ক্ষেত্রে স্থাপন করা হয় যাতে প্রোটিন-এসডিএস কমপ্লেক্সগুলি জেল প্লেট জুড়ে চলে যায় এবং নাইট্রোসেলুলোজ ঝিল্লির পৃষ্ঠে স্থির থাকে (অনির্দিষ্ট শোষণের ফলে)।

নাইট্রোসেলুলোজ ঝিল্লির সাথে প্রোটিন-এসডিএস কমপ্লেক্সের বাঁধনে, প্রধানত বৈদ্যুতিক শক্তি জড়িত থাকে এবং এই মিথস্ক্রিয়াটি বহুবিন্দু এবং ঝিল্লির পৃষ্ঠে প্রোটিনের "প্রসারণ" ঘটায়। এইভাবে, ইলেক্ট্রোট্রান্সফারের পরে, আমরা পলিঅ্যাক্রিলামাইড জেলের মতো একইভাবে সাজানো প্রোটিন সহ নাইট্রোসেলুলোসে জেলের একটি প্রতিরূপ পাই।

এসডিএস-এর পরে - ইলেক্ট্রোফোরেসিস, ইলেক্ট্রোট্রান্সফার এবং জেল থেকে প্রোটিনগুলিকে নাইট্রোসেলুলোজ ঝিল্লিতে শোষণ করার পরে, প্রোটিনের তৃতীয় স্তরের রূপান্তর ব্যাপকভাবে পরিবর্তিত হয়, যদি এই ধরনের কঠোর চিকিত্সার পরে প্রোটিনের তৃতীয় কাঠামোর অস্তিত্বের কথা বলা সঠিক হয়। . অতএব, অধ্যয়নের অধীনে প্রোটিনের ইমিউনোকেমিক্যাল সনাক্তকরণের জন্য, প্রোটিন অণুর রৈখিক অঞ্চলগুলির জন্য নির্দিষ্ট শুধুমাত্র মনো- বা পলিক্লোনাল অ্যান্টিবডিগুলি সাধারণত ব্যবহৃত হয়। কনফরমেশনাল এপিটোপসের জন্য নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডিগুলি (বা ইন্টারসাবুনিট পরিচিতি জড়িত সাইট) সাধারণত পশ্চিমা ব্লট পদ্ধতিতে ব্যবহারের জন্য উপযুক্ত নয়।

প্রোটিন স্থানান্তরের পরে, অধ্যয়নের অধীনে প্রোটিনের জন্য নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডিগুলির সাথে ঝিল্লিটি ক্রমানুসারে ইনকিউবেট করা হয় এবং তারপরে প্রাথমিক অ্যান্টিবডিগুলির Fc টুকরোগুলির জন্য নির্দিষ্ট সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডিগুলির সাথে, একটি এনজাইম (বা অন্য কিছু) লেবেল (চিত্র 1 এ) দিয়ে সংযুক্ত করা হয়। যে ক্ষেত্রে অধ্যয়ন করা অ্যান্টিজেনের জন্য নির্দিষ্ট প্রাথমিক অ্যান্টিবডিগুলি সরাসরি লেবেলের সাথে সংযুক্ত করা হয়, সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডিগুলির প্রয়োজন হয় না (চিত্র 1 বি)। অধ্যয়নকৃত প্রোটিন স্থানীয়করণের জায়গায় গঠিত প্রতিরোধক কমপ্লেক্সগুলি ক্রোমোজেনিক সাবস্ট্রেটের সাহায্যে "প্রকাশিত" হয় (লেবেলের ধরণের উপর নির্ভর করে)।

পদ্ধতির সংবেদনশীলতা এবং নির্দিষ্টতা গবেষণায় কোন অ্যান্টিবডি ব্যবহার করা হয় তার উপর অত্যন্ত নির্ভরশীল। ব্যবহৃত অ্যান্টিবডিগুলি অবশ্যই অধ্যয়নের অধীনে থাকা প্রোটিনের জন্য নির্দিষ্ট একটি অনন্য অ্যামিনো অ্যাসিড ক্রম অনুসারে নির্দিষ্ট হতে হবে। অন্যথায়, বেশ কয়েকটি প্রোটিন অণুর সাথে অ্যান্টিবডিগুলির মিথস্ক্রিয়া (বিশেষত মোটা প্রোটিন নির্যাসের ক্ষেত্রে) সম্ভব, যা ফলস্বরূপ ঝিল্লিতে বেশ কয়েকটি রঙিন ব্যান্ডের উপস্থিতির দিকে পরিচালিত করবে। এই ক্ষেত্রে অধ্যয়নের অধীনে প্রোটিন সনাক্তকরণ প্রায়ই কঠিন বা এমনকি অসম্ভব।

অ্যান্টিবডি বাছাই করার সময় মনে রাখতে হবে দ্বিতীয় গুরুত্বপূর্ণ বিষয় হল অ্যাফিনিটি। ব্যবহৃত অ্যান্টিবডিগুলির সখ্যতা যত বেশি হবে, প্রোটিন ব্যান্ডের দাগ তত উজ্জ্বল এবং পরিষ্কার হবে, পদ্ধতিটির সংবেদনশীলতা তত বেশি হবে। উচ্চ অ্যাফিনিটি অ্যান্টিবডি ব্যবহার করার সময়, 1 এনজি এবং এমনকি উচ্চতর সংবেদনশীলতা অর্জন করা যেতে পারে।

মেমব্রেন-বাউন্ড অ্যান্টিজেন এবং অ্যান্টিবডিগুলির মিথস্ক্রিয়া ফলাফল কল্পনা করার জন্য, নির্দিষ্ট পরিস্থিতিতে একটি নির্দিষ্ট সংকেত দিতে সক্ষম এজেন্টগুলির সাথে সংযুক্ত সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডিগুলি ব্যবহার করা হয়। সাধারণত, একটি এনজাইম (পেরক্সিডেস বা ফসফেটেস) এই জাতীয় এজেন্ট হিসাবে ব্যবহৃত হয়, যার প্রতিক্রিয়া পণ্যটির একটি রঙ থাকে এবং একটি অদ্রবণীয় অবক্ষেপের আকারে ঝিল্লিতে অবক্ষয় হয়। এই পদ্ধতিতে ফ্লুরোসেন্ট লেবেল ব্যবহার করাও সম্ভব।

ভাত। 1. অধ্যয়নকৃত প্রোটিনের ইমিউনোকেমিক্যাল স্টেনিং এর স্কিম: A - একটি এনজাইম লেবেল দিয়ে সংযুক্ত সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে; B - প্রাথমিক অ্যান্টিবডি সরাসরি একটি এনজাইম লেবেল দিয়ে সংযোজিত হয়।

প্রোটোকল:

I. জেল এবং ঝিল্লি প্রস্তুতি এবং প্রোটিন ইলেক্ট্রোট্রান্সফার

ইলেক্ট্রোফোরসিসের পরে পলিঅ্যাক্রিলামাইড জেলটি ব্লটিং বাফার (25 মিমি ট্রিস, পিএইচ 8.3, 192 মিমি গ্লাইসিন, 10% ইথানল) সহ একটি স্নানে স্থাপন করা হয়েছিল। ফিল্টার পেপারের দুটি শীট, ব্লটিং ক্যাসেটের আকারে কাটা এবং ব্লটিং বাফার দিয়ে আর্দ্র করা, ক্যাসেটের অংশে স্থাপন করা হয় যা অ্যানোডের মুখোমুখি হবে। তারপরে, একই বাফারের সাথে একটি নাইট্রোসেলুলোজ ঝিল্লি আগে থেকে আর্দ্র করে ফিল্টার পেপারে স্থাপন করা হয়, এটি নিশ্চিত করে যে ঝিল্লি এবং কাগজের মধ্যে কোনও বায়ু বুদবুদ নেই। এর পরে, জেলটি সাবধানে ঝিল্লিতে স্থাপন করা উচিত, আবার জেল এবং ঝিল্লির মধ্যে বায়ু বুদবুদগুলির অনুপস্থিতিতে বিশেষ মনোযোগ দেওয়া উচিত। স্যান্ডউইচটি ভেজা ফিল্টার পেপারের দুটি স্তর দ্বারা সম্পন্ন হয়, যা জেলের পৃষ্ঠে স্থাপন করা হয় (চিত্র 2)। ফলস্বরূপ স্যান্ডউইচটি ক্যাসেটে আটকানো হয় এবং ইলেক্ট্রোডগুলির মধ্যে স্থাপন করা হয় যাতে ঝিল্লিটি অ্যানোডের মুখোমুখি হয়।

ভাত। 2. ঝিল্লিতে প্রোটিনের ইলেক্ট্রোট্রান্সফারের স্কিম।

২. ইলেক্ট্রোট্রান্সফার

নাইট্রোসেলুলোজ মেমব্রেনে প্রোটিনের ইলেক্ট্রোট্রান্সফার 25 মিমি ট্রিস, পিএইচ 8.3, 192 মিমি গ্লাইসিন, 10% ইথানল 30-50 মিনিটের জন্য 100 V এর একটি ধ্রুবক ভোল্টেজে থাকা একটি বাফারে সঞ্চালিত হয়। ইলেক্ট্রোট্রান্সফার সময় নির্ভর করে আকারের উপর স্থানান্তরিত প্রোটিন, প্রোটিন যত বড়, স্থানান্তর তত বেশি সময় নেয়। ইলেক্ট্রোট্রান্সপোর্টের গুণমান এবং প্রোটিন ব্যান্ডের বিন্যাস 1% অ্যাসিটিক অ্যাসিডে 0.3% পোনসেউ এস দিয়ে নাইট্রোসেলুলোজ ঝিল্লিতে দাগ দিয়ে মূল্যায়ন করা হয়েছিল। ইমিউনোস্টেইন করার আগে, প্রোটিন-আবদ্ধ রঞ্জক অপসারণের জন্য ঝিল্লিটিকে হালকা ক্ষারীয় জলীয় ট্রিস দ্রবণ দিয়ে কয়েকবার ধুয়ে ফেলতে হবে।

III. নাইট্রোসেলুলোজ ঝিল্লিতে স্থির প্রোটিনের ইমিউনোকেমিক্যাল স্টেনিং

অ-নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডি বাইন্ডিং সাইটগুলিকে ব্লক করতে, ঝিল্লিটি পিবিএসটি-তে 30 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় ধ্রুবক নাড়তে থাকে (ভালভাবে ব্লক করার জন্য, 10% স্কিমড মিল্ক পাউডার ধারণকারী একটি পিবিএসটি দ্রবণ ব্যবহার করা যেতে পারে)। ব্লক করার পর, 1-10 μg/ml নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডি ধারণ করে PBST-তে ধ্রুবক নাড়ার সাথে ঝিল্লিটি ঘরের তাপমাত্রায় এক ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয়। অ্যান্টিবডিগুলির সর্বোত্তম ঘনত্ব পরীক্ষামূলকভাবে নির্বাচিত হয় এবং অ্যান্টিজেনের সাথে অ্যান্টিবডিগুলির মিথস্ক্রিয়ার সখ্যতার উপর নির্ভর করে। ইনকিউবেশনের শেষে, ঝিল্লিটি পিবিএসটি দিয়ে 5 বার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং হর্সরাডিশ পারক্সিডেসের সাথে সংযুক্ত সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডিগুলির দ্রবণে স্থানান্তরিত হয়েছিল। কনজুগেটের তরলীকরণটি সাধারণত প্যাকেজিংয়ে প্রস্তুতকারকের দ্বারা নির্দেশিত হয়, বা গবেষক দ্বারা পরীক্ষামূলকভাবে নির্বাচিত হয়। ধ্রুবক নাড়াচাড়া করে 1 ঘন্টার জন্য সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডিগুলির একটি দ্রবণে ঝিল্লিটি সেঁকুন।

পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে ধোয়ার পর (অন্তত 5-6টি বাফার পরিবর্তন), পিবিএসটি ঝিল্লি একটি ক্রোমোজেনিক সাবস্ট্রেট দ্রবণে স্থানান্তরিত হয় যাতে 3 মিলিগ্রাম ডায়ামিনোবেনজিডিন (ডিএবি) এবং 10 মিলিলিটার 0.1 এম ট্রিস-এইচসিএল-এর 10 মিলিলিটার মধ্যে 30% হাইড্রোজেন পারক্সাইডের 10 μl থাকে। . ইনকিউবেশন 5 থেকে 10 মিনিটের জন্য stirring সঙ্গে বাহিত হয়। সাবস্ট্রেটের সাথে ইনকিউবেশন শেষ হওয়ার পরে, ঝিল্লিটি PBST দিয়ে ধুয়ে ফেলতে হবে, ফিল্টার পেপার দিয়ে ব্লটিং করে শুকিয়ে নিতে হবে এবং অবিলম্বে রঙিন স্ক্যান করে একটি ইলেকট্রনিক কপি তৈরি করতে হবে। ঝিল্লি সম্পূর্ণরূপে শুকিয়ে গেলে, রঙ্গিন প্রোটিন স্ট্রাইপগুলি বিবর্ণ হয়ে যায় এবং চিত্রটি কম উজ্জ্বল এবং বিপরীত হয়।

দ্রষ্টব্য: DAB বিষাক্ত এবং একটি সম্ভাব্য কার্সিনোজেন। শুধুমাত্র রাবারের গ্লাভস দিয়ে কাজ করুন!

এবং অন্যান্য প্রাকৃতিক বিজ্ঞান শাখায়।

অন্যান্য সম্পর্কিত পদ্ধতিগুলি ইমিউনোস্টেইনিং এবং এনজাইম-লিঙ্কড ইমিউনোসর্বেন্ট অ্যাস (ELISA) এর মাধ্যমে টিস্যু এবং কোষে প্রোটিন সনাক্ত করতে অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে। এলিসা).

জর্জ স্টার্কের গবেষণাগারে ওয়েস্টার্ন ব্লটিং তৈরি করা হয়েছিল। জর্জ স্টার্ক) স্ট্যানফোর্ডে। ওয়েস্টার্ন ব্লট নামটি ডব্লিউ নিল বার্নেট এই কৌশলটিকে দিয়েছিলেন। ডব্লিউ নিল বার্নেট) এবং এটি সাউদার্ন ব্লটিং নামের একটি শ্লেষ, একটি ডিএনএ সনাক্তকরণ কৌশল যা পূর্বে এডউইন সাউদার্ন দ্বারা তৈরি করা হয়েছিল। আরএনএ সনাক্তকরণের জন্য একটি অনুরূপ পদ্ধতিকে উত্তর ব্লটিং বলা হয়, প্রোটিনের অনুবাদ-পরবর্তী পরিবর্তন সনাক্তকরণকে ইস্টার্ন ব্লটিং বলা হয়। ইস্টার্ন ব্লটিং).

নমুনা প্রস্তুতি

নমুনা পুরো টিস্যু বা কোষ সংস্কৃতি থেকে নেওয়া যেতে পারে। বেশিরভাগ ক্ষেত্রে, হার্ড টিস্যুগুলি প্রথমে যান্ত্রিকভাবে একটি ব্লেন্ডার ব্যবহার করে (বড় ভলিউমের নমুনার জন্য), একটি হোমোজেনাইজার (ছোট ভলিউম) বা সোনিকেশন ব্যবহার করে গ্রাউন্ড করা হয়। একই সময়ে, ব্যাকটেরিয়া, ভাইরাস এবং অন্যান্য পরিবেশগত উপাদানগুলিও প্রোটিনের উত্স।

জেল electrophoresis

পলিঅ্যাক্রিলামাইড জেল ইলেক্ট্রোফোরসিস ব্যবহার করে প্রোটিন আলাদা করা হয়। আইসোইলেক্ট্রিক পয়েন্ট (পিআই), আণবিক ওজন, বৈদ্যুতিক চার্জ বা এই পরামিতিগুলির সংমিশ্রণ দ্বারা প্রোটিনের পৃথকীকরণ করা যেতে পারে।

সোডিয়াম ডোডেসিল সালফেটের উপস্থিতিতে প্রোটিন আলাদা করার সবচেয়ে সাধারণ পদ্ধতি হল পলিঅ্যাক্রিলামাইড জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস। এসডিএস) Laemmli অনুযায়ী. এসডিএস প্রোটিনের বিকৃতকরণকে প্ররোচিত করে এবং তাদের একটি বিকৃত অবস্থায় রক্ষণাবেক্ষণ করে; ডাইথিওথ্রিটল এবং মারকাপটোথেনলের মতো ডিসালফাইড বন্ড হ্রাসকারী এজেন্টগুলি প্রোটিনের গৌণ এবং তৃতীয় কাঠামোকে ধ্বংস করতে ব্যবহৃত হয়। বিকৃত পলিপেপটাইডগুলি বৈদ্যুতিক ক্ষেত্রে অ্যাক্রিলামাইড জেলের মাধ্যমে অ্যানোডে স্থানান্তরিত হয়, ছোট প্রোটিনগুলি দ্রুত গতিতে চলে এবং এইভাবে আণবিক ওজন অনুসারে পৃথক হয়। অ্যাক্রিলামাইডের ঘনত্ব জেলের রেজোলিউশন নির্ধারণ করে - অ্যাক্রিলামাইডের ঘনত্ব যত বেশি হবে, ছোট আণবিক ওজনের প্রোটিনের রেজোলিউশন তত ভাল। অ্যাক্রিলামাইডের কম ঘনত্ব উচ্চ আণবিক ওজন প্রোটিনের জন্য রেজোলিউশন উন্নত করে। দ্বি-মাত্রিক ইলেক্ট্রোফোরেসিস (2-ডি) ব্যবহার করাও সম্ভব। এই ক্ষেত্রে, প্রোটিনগুলির পৃথকীকরণ দুটি দিকে পরিচালিত হয় - প্রথম দিকে তাদের আইসোইলেক্ট্রিক পয়েন্ট অনুসারে এবং আণবিক ওজন অনুসারে - দ্বিতীয় দিকে।

জেলের নমুনাগুলি পকেটে প্রয়োগ করা হয়। একটি নিয়ম হিসাবে, একটি "ট্র্যাক" আণবিক ওজন মার্কার (পরিচিত জনসাধারণের সাথে প্রোটিনের মিশ্রণ) জন্য রেখে দেওয়া হয়। ভোল্টেজ প্রয়োগ করার পরে, প্রোটিনগুলি বৈদ্যুতিক ক্ষেত্রে বিভিন্ন গতিতে চলে। অগ্রিম গতির পার্থক্য - ইলেক্ট্রোফোরেটিক গতিশীলতা প্রোটিনকে ব্যান্ডে বিভাজনের দিকে নিয়ে যায় (ইঞ্জি. ব্যান্ড).

ঝিল্লিতে স্থানান্তর করুন

অ্যান্টিবডি এবং আরও সনাক্তকরণের জন্য প্রোটিনগুলিকে উপলব্ধ করার জন্য, সেগুলিকে জেলের একটি স্ট্রিপ সহ নাইট্রোসেলুলোজ বা পলিভিনাইলিডিন ফ্লোরাইড দিয়ে তৈরি একটি ঝিল্লিতে স্থানান্তর করা হয় (ইঞ্জি. পিভিডিএফ) জেলের উপর ঝিল্লি প্রয়োগ করা হয় এবং এটির উপরে ফিল্টার পেপারের একটি স্তুপ স্থাপন করা হয়। পুরো স্ট্যাকটি স্থানান্তর বাফারে স্থাপন করা হয়, যা কৈশিক ক্রিয়া দ্বারা কাগজটিকে উপরে নিয়ে যায়, এটির সাথে প্রোটিন বহন করে। প্রোটিন স্থানান্তরের আরেকটি পদ্ধতি বলা হয় ইলেক্ট্রোব্লটিংএবং একটি বৈদ্যুতিক প্রবাহ ব্যবহার করে যা জেল থেকে ঝিল্লিতে প্রোটিন বহন করে। প্রোটিন তাদের অবস্থান বজায় রেখে জেল থেকে ঝিল্লিতে চলে যায়। এই "ওয়েটিং" এর ফলস্বরূপ (ইংরেজি থেকে। blotting) প্রক্রিয়া, প্রোটিন সনাক্তকরণ ঝিল্লির একটি পাতলা পৃষ্ঠ স্তরে রাখা হয়। উভয় ঝিল্লি ভেরিয়েন্ট ব্যবহার করা হয় কারণ তাদের অ-নির্দিষ্ট প্রোটিন-বাইন্ডিং বৈশিষ্ট্য। প্রোটিন বাঁধাই হাইড্রোফোবিক মিথস্ক্রিয়া এবং ঝিল্লি এবং প্রোটিনের মধ্যে ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক মিথস্ক্রিয়া উভয়ের উপর ভিত্তি করে। নাইট্রোসেলুলোজ ঝিল্লি PVDF এর তুলনায় সস্তা, তবে এটি অনেক বেশি ভঙ্গুর এবং রিলেবেলিং এর জন্য কম প্রতিরোধী।

জেল থেকে ঝিল্লিতে প্রোটিন স্থানান্তরের অভিন্নতা এবং সামগ্রিক কার্যকারিতা Coomassie ব্লু বা Ponceau S দিয়ে ঝিল্লিকে দাগ দিয়ে যাচাই করা যেতে পারে। Coomassie হল দুটির মধ্যে সবচেয়ে সাধারণ, এবং Ponceau S হল আরও সংবেদনশীল এবং আরও বেশি জল দ্রবণীয়, যা পরবর্তীকালে তৈরি করে। ঝিল্লির ধোয়া এবং লেবেল করা সহজ। .

ব্লক করা

প্রোটিন, অ্যান্টিবডি এবং লক্ষ্য প্রোটিনকে আবদ্ধ করার ক্ষমতার জন্য একটি ঝিল্লি নির্বাচন করা হলে, লক্ষ্য প্রোটিন সনাক্ত করতে ব্যবহৃত ঝিল্লি এবং অ্যান্টিবডির মধ্যে মিথস্ক্রিয়া এড়াতে যত্ন নেওয়া উচিত (কারণ অ্যান্টিবডি নিজেই একটি প্রোটিন)। একটি পাতলা প্রোটিন দ্রবণে ঝিল্লি স্থাপন করে অ-নির্দিষ্ট বাঁধাইয়ের অবরুদ্ধ করা হয় - সাধারণত বোভাইন সিরাম অ্যালবুমিন (বিএসএ) বা নন-ফ্যাট ড্রাই মিল্ক (উভয়ই সস্তা), টুইন 20-এর মতো ডিটারজেন্টের সামান্য শতাংশ সহ। পাতলা দ্রবণ সমস্ত জায়গায় ঝিল্লির সাথে সংযুক্ত করে যেখানে লক্ষ্য প্রোটিন সংযুক্ত করেনি। অতএব, যখন অ্যান্টিবডিগুলি যোগ করা হয়, নির্দিষ্ট লক্ষ্য প্রোটিনের বাঁধাই সাইটগুলি ব্যতীত তাদের (অ্যান্টিবডিগুলি) সংযুক্ত করার জন্য ঝিল্লিতে কোনও মুক্ত স্থান থাকে না। চূড়ান্ত পশ্চিমী দাগের এই পটভূমি "গোলমাল" পরিচ্ছন্ন ফলাফল এবং মিথ্যা ইতিবাচক নির্মূল ফলাফল.

সনাক্তকরণ

সনাক্তকরণ প্রক্রিয়া চলাকালীন, ঝিল্লিটিকে একটি পরিবর্তিত অ্যান্টিবডির সাথে আগ্রহের প্রোটিন দিয়ে "লেবেল" করা হয় যা একটি প্রতিবেদক এনজাইমের সাথে আবদ্ধ থাকে যা একটি উপযুক্ত সমর্থনে রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়, যার ফলে একটি কালারমিট্রিক প্রতিক্রিয়া হয় এবং রঙ দেয়। বিভিন্ন কারণে, সনাক্তকরণ দুটি পর্যায়ে বাহিত হয়, যদিও একটি এক-পদক্ষেপ সনাক্তকরণ পদ্ধতি এখন নির্দিষ্ট অ্যাপ্লিকেশনের জন্য উপলব্ধ।

কিছু প্রোটিন (বা এর কিছু অংশ) এক শ্রেণীর হোস্ট বা ইমিউন কোষের সংস্কৃতিকে প্রকাশ করার মাধ্যমে অ্যান্টিবডি তৈরি করা হয়। সাধারণত এটি ইমিউন রেসপন্সের অংশ, কিন্তু এখানে (পরীক্ষণে) সংগৃহীত অ্যান্টিবডিগুলি একটি নির্দিষ্ট হিসাবে ব্যবহৃত হয় এবং সংবেদনশীল সনাক্তকরণ টুল যা সরাসরি প্রোটিনের সাথে আবদ্ধ।

ব্লক করার পর, একটি মিশ্রিত প্রাথমিক অ্যান্টিবডি দ্রবণ (সাধারণত 0.5 থেকে 5 µg/ml এর মধ্যে) ঝিল্লির সাথে ইনকিউব করা হয় এবং আলতোভাবে ঝাঁকাতে হয়। সাধারণত দ্রবণে বাফার করা লবণের দ্রবণ থাকে যার মধ্যে অল্প শতাংশ ডিটারজেন্ট, কখনও কখনও গুঁড়ো দুধ বা BSA থাকে। অ্যান্টিবডি দ্রবণ এবং ঝিল্লি একসাথে বন্ধ করা যেতে পারে এবং 30 মিনিট থেকে রাতারাতি যে কোনও জায়গায় ইনকিউব করা যেতে পারে। এগুলি বিভিন্ন তাপমাত্রায়ও ইনকিউবেট করা যেতে পারে, উন্নত তাপমাত্রায় আরও ভাল বাঁধাই থাকে - উভয় নির্দিষ্ট (লক্ষ্যযুক্ত প্রোটিনের, "সংকেত1") এবং অ-নির্দিষ্ট ("শব্দ")।

আবদ্ধ প্রাথমিক অ্যান্টিবডিগুলি অপসারণের জন্য ঝিল্লিটি ধুয়ে ফেলার পরে, ঝিল্লিটি অন্যান্য অ্যান্টিবডিগুলিতে ইনকিউব করা হয় যা প্রাথমিক অ্যান্টিবডিগুলির শ্রেণি-নির্দিষ্ট অঞ্চলে সরাসরি আবদ্ধ হয়। এগুলি সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি হিসাবে পরিচিত এবং তাদের লক্ষ্যবস্তু অনুসারে, সাধারণত "অ্যান্টি-মাউস", "এন্টি-গোট" ইত্যাদি হিসাবে উল্লেখ করা হয়। অ্যান্টিবডিগুলি প্রাণীর উত্স (বা হাইব্রিডোমা সংস্কৃতির প্রাণী উত্স) থেকে প্রাপ্ত হয়; অ্যান্টি-মাউস সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডিগুলি বেশিরভাগ মাউস থেকে প্রাপ্ত প্রাথমিক অ্যান্টিবডিগুলির সাথে আবদ্ধ হবে। এটি একটি পৃথক পরীক্ষাগারকে অ্যান্টিবডিগুলির ব্যাপক উত্পাদনের একটি একক উত্স ব্যবহার করার অনুমতি দিয়ে কিছু সঞ্চয় তৈরি করে এবং অনেক বেশি পুনরুত্পাদনযোগ্য ফলাফলের দিকে নিয়ে যায়। সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডিগুলি সাধারণত বায়োটিনের সাথে বা একটি রিপোর্টার এনজাইমের সাথে আবদ্ধ থাকে যেমন ক্ষারীয় ফসফেটেস বা হর্সরাডিশ পারক্সিডেস। এর মানে হল যে কয়েকটি সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি একটি প্রাথমিকের সাথে আবদ্ধ হতে পারে এবং সংকেতকে প্রশস্ত করতে পারে।

সবচেয়ে সাধারণ হর্সরাডিশ পারক্সিডেস-সম্পর্কিত সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডিগুলি কেমিলুমিনেসেন্ট এজেন্ট কাটাতে ব্যবহৃত হয় এবং প্রতিক্রিয়া পণ্যটি প্রোটিনের পরিমাণের অনুপাতে আলোক বিকিরণ তৈরি করে। আলোক সংবেদনশীল ফটোগ্রাফিক ফিল্মের একটি শীট ঝিল্লির বিপরীতে স্থাপন করা হয় এবং প্রতিক্রিয়া বিকিরণের শিকার হয়, যা দাগের উপর অ্যান্টিবডি ব্যান্ডগুলির একটি চিত্র তৈরি করে। 1% হাইড্রোজেন পারক্সাইডের সাথে মিশ্রিত 4-ক্লোরোনাফথল দাগ ব্যবহার করে একটি সস্তা কিন্তু কম সংবেদনশীল পদ্ধতি; 4-ক্লোরোনাফথলের সাথে পারক্সাইড র্যাডিকালের প্রতিক্রিয়া একটি গাঢ় বাদামী রঙ দেয়, যা একটি বিশেষ ফটোগ্রাফিক ফিল্ম ব্যবহার না করে রেকর্ড করা হয়।

একটি তৃতীয় বিকল্প পদ্ধতি একটি তেজস্ক্রিয় লেবেল ব্যবহার করে একটি এনজাইমের পরিবর্তে একটি সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডিতে আবদ্ধ, যেমন একটি লেবেলযুক্ত প্রোটিন A প্রোটিন। স্ট্যাফিলোকক্কাসআয়োডিনের একটি তেজস্ক্রিয় আইসোটোপ সহ। অন্যান্য পদ্ধতিগুলি নিরাপদ, দ্রুত এবং সস্তা, তাই তেজস্ক্রিয় সনাক্তকরণ খুব কমই ব্যবহৃত হয়।

ঐতিহাসিকভাবে, লেবেলিং প্রক্রিয়া দুটি ধাপে সম্পাদিত হয়েছে কারণ পৃথক প্রক্রিয়ায় প্রাথমিক এবং মাধ্যমিক অ্যান্টিবডি তৈরি করা তুলনামূলকভাবে সহজ। এটি গবেষক এবং সংস্থাগুলিকে নমনীয়তার পরিপ্রেক্ষিতে একটি বিশাল সুবিধা দেয় এবং সনাক্তকরণ প্রক্রিয়াতে একটি পরিবর্ধন পদক্ষেপ যোগ করে। উচ্চ থ্রুপুট প্রোটিন অ্যাসে এবং কম সনাক্তকরণ থ্রেশহোল্ডের আবির্ভাবের পরিপ্রেক্ষিতে, এখনও একটি এক-পদক্ষেপ লেবেলিং সিস্টেম বিকাশে আগ্রহ রয়েছে যা প্রক্রিয়াটিকে দ্রুত এবং কম খরচে চালানোর অনুমতি দেয়। এটির (একটি এক-পদক্ষেপ সিস্টেম) অ্যান্টিবডি ট্যাগগুলির প্রয়োজন যা অধ্যয়নের অধীনে প্রোটিনকে চিনবে এবং একই সাথে সনাক্তকরণের জন্য একটি মার্কার বহন করবে - পরিচিত "প্রোটিন লেজ" এর কাছে সবচেয়ে অ্যাক্সেসযোগ্য ট্যাগগুলি। প্রথমত, লেবেলগুলি প্রাথমিক অ্যান্টিবডি সহ একটি দ্বি-পদক্ষেপ-শৈলীর ঝিল্লির সাথে ইনকিউবেট করা হয় এবং তারপরে একাধিক ধোয়ার পরে সরাসরি সনাক্তকরণের জন্য প্রস্তুত।

বিশ্লেষণ

আনবাউন্ড লেবেল ধুয়ে ফেলার পর, ওয়েস্টার্ন ব্লট লক্ষ্য প্রোটিনের সাথে আবদ্ধ প্রোব সনাক্ত করতে প্রস্তুত। অনুশীলনে, সমস্ত পশ্চিমা ঝিল্লিতে শুধুমাত্র একটি ব্যান্ড সহ প্রোটিন দেখায় না। ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা যোগ করা আণবিক ওজন মার্কারগুলির সাথে দাগযুক্ত ব্যান্ডগুলির তুলনা করে আনুমানিক আকার গণনা করা হয়। প্রক্রিয়াটি স্ট্রাকচারাল প্রোটিন যেমন অ্যাক্টিন বা টিউবুলিন দিয়ে পুনরাবৃত্তি করা হবে যা পরীক্ষার মধ্যে পরিবর্তন হয় না। লক্ষ্য প্রোটিনের পরিমাণ গ্রুপগুলির মধ্যে নিয়ন্ত্রণ কাঠামোগত প্রোটিনের পরিমাণের উপর নির্ভর করে। এই কৌশলটি একটি ত্রুটি বা অসম্পূর্ণ স্থানান্তরের ক্ষেত্রে ঝিল্লিতে মোট প্রোটিনের পরিমাণ সংশোধন করে।

কালারমেট্রিক সনাক্তকরণ

কালোরিমেট্রিক সনাক্তকরণ পদ্ধতিটি একটি সাবস্ট্রেটের সাথে একটি ওয়েস্টার্ন ব্লটের ইনকিউবেশনের উপর ভিত্তি করে যা একটি রিপোর্টার এনজাইমের সাথে প্রতিক্রিয়া করে (যেমন হর্সরাডিশ পারক্সিডেস)। হর্সরাডিশ পারক্সিডেস), সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডিতে "বসা"। দ্রবণীয় রঞ্জক একটি ভিন্ন রঙের একটি অদ্রবণীয় আকারে পরিবর্তিত হয়, এনজাইমের পাশে অবক্ষয় করে এবং ঝিল্লিকে দাগ দেয়। দ্রবণীয় ছোপ ধুয়ে স্পট বৃদ্ধি সীমিত। দাগের তীব্রতা বা বর্ণালী ফোটোমেট্রিকভাবে প্রোটিনের স্তরটি ঘনত্বপূর্ণভাবে মূল্যায়ন করা হয়।

কেমিলুমিনেসেন্ট সনাক্তকরণ

কেমিলুমিনেসেন্ট সনাক্তকরণ পদ্ধতিটি একটি সাবস্ট্রেট সহ একটি নাইট্রোসেলুলোজ ঝিল্লির ইনকিউবেশনের উপর ভিত্তি করে যা সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি রিপোর্টারের সাথে মিথস্ক্রিয়া করার পরে আলোকিত হয়। আলো ফোটোগ্রাফিক ফিল্ম বা একটি সিসিডি ক্যামেরা দ্বারা রেকর্ড করা হয়, যা পশ্চিমা দাগকে ডিজিটালভাবে ক্যাপচার করে। চিত্রটিকে ঘনত্বের সাথে বিশ্লেষণ করা হয়, দাগযুক্ত প্রোটিনের আপেক্ষিক পরিমাণ মূল্যায়ন করে এবং অপটিক্যাল ঘনত্বের এককগুলিতে একটি পরিমাণগত ফলাফল দেয়। নতুন সফ্টওয়্যারটি আরও ডেটা বিশ্লেষণের অনুমতি দেয়, যেমন আণবিক ওজন নির্ধারণ, যদি একটি উপযুক্ত মান ব্যবহার করা হয়।

তেজস্ক্রিয় সনাক্তকরণ

তেজস্ক্রিয় লেবেলগুলির জন্য এনজাইম সাবস্ট্রেটের প্রয়োজন হয় না, তবে মেডিকেল রেডিওগ্রাফিক ফিল্মকে একটি পশ্চিমী দাগের সামনে স্থাপন করার অনুমতি দেয়, এটি (ফিল্ম) লেবেলের সাথে যোগাযোগ করতে এবং অধ্যয়নের অধীনে প্রোটিনের ব্যান্ডগুলির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ অন্ধকার অঞ্চল তৈরি করতে দেয় ( ছবিটি ডানদিকে)। উচ্চ খরচ, উচ্চ স্বাস্থ্য ও নিরাপত্তা ঝুঁকি এবং ECL দ্বারা প্রদত্ত বিকল্পগুলির কারণে তেজস্ক্রিয় সনাক্তকরণ পদ্ধতিগুলির চাহিদা হ্রাস পাচ্ছে।

ফ্লুরোসেন্স সনাক্তকরণ

ফ্লুরোসেন্ট লেবেল আলো দ্বারা উত্তেজিত হয় এবং দীর্ঘতর তরঙ্গদৈর্ঘ্যের আলো নির্গত করে, যা উপযুক্ত নির্গমন ফিল্টার দিয়ে সজ্জিত সিসিডি ক্যামেরার মতো ফটোসেন্সর দ্বারা সনাক্ত করা হয়। ক্যামেরাটি ওয়েস্টার্ন ব্লটের একটি ডিজিটাল ছবি নেয়, যা অর্জিত ডেটার আরও বিশ্লেষণের অনুমতি দেয়, যেমন আণবিক ওজন বিশ্লেষণ এবং পরিমাণগত ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণ।

বিষয়বস্তু

- ভূমিকা
- সমাধান
- নমুনা লাইসিস
- নমুনা প্রস্তুতি
- ইলেক্ট্রোফোরসিস বহন করা
- PAAG থেকে ঝিল্লিতে প্রোটিন স্থানান্তর
- ঝিল্লি রঙ

ভূমিকা

ওয়েস্টার্ন ব্লটিং হল একটি বিশ্লেষণাত্মক পদ্ধতি যা পলিয়ারিলামাইড জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা পৃথক করা নমুনায় নির্দিষ্ট প্রোটিন নির্ধারণ করতে ব্যবহৃত হয়। এর পরে, জেল থেকে প্রোটিনগুলি একটি নাইট্রোসেলুলোজ বা পিভিডিএফ ঝিল্লিতে স্থানান্তরিত হয়, তারপর অধ্যয়ন করা প্রোটিনগুলি একটি নির্দিষ্ট প্রোটিনের জন্য নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে সনাক্ত করা হয় এবং সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে বিকাশ করা হয়।

সমাধান

লাইসিস বাফার
বাফার NP-40
150 মিমি NaCl
1.0% NP-40 (Tergitol® প্রকার NP-40)
50 মিমি Tris-HCl, pH 8.0
প্রোটিজ ইনহিবিটার

নমুনা বাফার (x5)
10% SDS
5% 2-মারকাপটোথেনল
50% গ্লিসারিন
0.01% ব্রোমোফেনল নীল
0.4 এম ইমিডাজল

pH চেক করুন এবং pH 6.8 এ সামঞ্জস্য করুন

পৃথককারী বাফার (নিম্ন, জেল বাফার পৃথক)
400 মিমি Tris-HCl
0.1% SDS
0.01% TEMED
0.1% সোডিয়াম পারসালফেট



স্থানান্তর বাফার (আধা-শুষ্ক)
16 মিমি Tris-HCl
200 মিমি গ্লাইসিন
0.1% SDS
20% মিথানল

pH চেক করুন এবং pH 8.3 এ সামঞ্জস্য করুন

ব্লক করতে বাফার
150 মিমি NaCl
10 mM Na 2 HPO 4
3-5% স্কিমড মিল্ক পাউডার



ওয়াশ বাফার (PBST)
150 মিমি NaCl
10 mM Na 2 HPO 4
0.2% টুইন-20

pH চেক করুন এবং pH 7.5 এ সামঞ্জস্য করুন

নমুনা lysis

কোষ সংস্কৃতি থেকে লাইসেট প্রস্তুতি

1. কোষের পাত্রটি বরফের উপর রাখুন এবং ঠাণ্ডা পিবিএস দিয়ে কোষগুলি ধুয়ে ফেলুন।

2. পিবিএস দ্রবণটি সম্পূর্ণরূপে অপসারণ করুন, তারপরে ঠান্ডা লাইসিস বাফার যোগ করুন (1 মিলি প্রতি 10 7 কোষ/150 সেমি 2; 0.5 মিলি প্রতি 5x10 6 কোষ/75 সেমি 2)।

3. প্লাস্টিক থেকে কোষগুলি আলাদা করুন, তারপর সাবধানে একটি ঠাণ্ডা সেন্ট্রিফিউজ টিউবে সেল সাসপেনশন স্থানান্তর করুন।

4. +4℃ এ 30 মিনিটের জন্য ধ্রুবক নাড়ার সাথে সাসপেনশনের সাথে টিউবটি ইনকিউবেট করুন।

5. +4℃ এ সাসপেনশন সেন্ট্রিফিউজ করুন। প্রস্তাবিত স্ট্যান্ডার্ড গতি হল 20 মিনিটের জন্য 12,000 rpm, তবে এই প্যারামিটারগুলি নির্দিষ্ট পরীক্ষা এবং কোষের প্রকারের জন্য নির্ধারণ করা প্রয়োজন।

6. ফলে সুপারনাট্যান্ট সংগ্রহ করুন

টিস্যু লাইসেট প্রস্তুতি

1. পরিষ্কার যন্ত্র ব্যবহার করে পরীক্ষা করার জন্য টিস্যুর একটি অংশ আলাদা করুন।

2. সেন্ট্রিফিউজ টিউবে টিস্যু রাখুন। টিউবে ঠান্ডা লাইসিস বাফার (0.3 মিলি/5 মিলিগ্রাম টিস্যু) যোগ করুন। একটি homogenizer ব্যবহার করে নমুনা পিষে. 0.2 মিলি ঠাণ্ডা লাইসিস বাফার দিয়ে হোমোজেনাইজার ব্লেডগুলি ধুয়ে ফেলুন। নমুনা একটি ধোয়া যোগ করুন. অতিরিক্ত নমুনা পাতলা এড়িয়ে চলুন. লোড করার সময় সর্বনিম্ন ঘনত্ব 0,1 মিলিগ্রাম/মিলি করে। সর্বোত্তম পরিসর - 1-5 মিগ্রা/মিলি

3. সাসপেনশন সহ টিউবটিকে +4℃-এ 2 ঘন্টা ধরে নাড়তে থাকুন

4. +4℃ এ 20 মিনিটের জন্য 12000 rpm-এ সাসপেনশন সেন্ট্রিফিউজ করুন

5. ফলে সুপারনাট্যান্ট সংগ্রহ করুন

নমুনা প্রস্তুতি

1. প্রাপ্ত লাইসেটগুলিতে প্রোটিনের ঘনত্ব নির্ধারণ করুন।

2. লোড করার জন্য প্রয়োজনীয় প্রোটিনের পরিমাণ নির্ধারণ করুন এবং 5X নমুনায় 4 গুণ কম বাফার যোগ করুন।

আমরা পুনর্গঠিত এবং বিকৃত নমুনা ব্যবহার করার পরামর্শ দিই

3. নমুনাটি পুনরুদ্ধার এবং বিকৃত করতে, এটিকে অবশ্যই নমুনা বাফারে +100℃ এ 5 মিনিটের জন্য সিদ্ধ করতে হবে।

ইলেক্ট্রোফোরসিস আউট বহন

পলিঅ্যাক্রিলামাইড জেলের কূপে সমান পরিমাণে নমুনা এবং আণবিক ওজন মার্কার রাখুন। লাইসেটের লোড মোট প্রোটিনের 20-30 µg হওয়া উচিত, বিশুদ্ধ প্রোটিনের লোড - 10-100 ng।
পলিঅ্যাক্রিলামাইড জেলে প্রোটিন ইলেক্ট্রোফোরসিস সম্পাদন করুন

স্থানান্তরের জন্য, একটি নাইট্রোসেলুলোজ বা পিভিডিএফ ঝিল্লি ব্যবহার করা যেতে পারে। পিভিডিএফ মেমব্রেনকে 1 মিনিটের জন্য মিথেনলে ভিজিয়ে সক্রিয় করুন। স্থানান্তর করার আগে, স্থানান্তর বাফারে এটি ধুয়ে ফেলুন। আমরা ঝিল্লিতে প্রোটিন স্থানান্তর করার জন্য আধা-শুষ্ক পদ্ধতি ব্যবহার করার পরামর্শ দিই। ঝিল্লিতে প্রোটিন স্থানান্তর ডিগ্রী ঝিল্লি ব্লক করার আগে Ponceau S দাগ ব্যবহার করে পরীক্ষা করা যেতে পারে।

দেখানো হিসাবে স্থানান্তর ঝিল্লি প্রস্তুত.

1. পিবিএস দিয়ে ঝিল্লি ধুয়ে ফেলুন।

2. অ-নির্দিষ্ট বাইন্ডিং সাইটগুলিকে ব্লক করতে, ঝিল্লিটিকে ব্লকিং বাফারে রাতারাতি +4℃ বা 40 মিনিটের জন্য +37℃-এ ধ্রুবক আন্দোলনের সাথে ইনকিউবেট করুন।

3. ঝিল্লি ধোয়ার জন্য, এটিকে পিবিএসটি দ্রবণে 3 বার 5 মিনিটের জন্য +37℃ এ অবিরাম নাড়তে থাকুন।

4. পিবিএস দ্রবণে অধ্যয়নের অধীনে প্রোটিনের অ্যান্টিবডি দিয়ে 40 মিনিটের জন্য +37℃ এ অবিরাম নাড়তে থাকুন।

5. ঝিল্লি ধোয়ার জন্য, এটিকে পিবিএসটি দ্রবণে 3 বার 5 মিনিটের জন্য +37℃ এ অবিরাম নাড়তে থাকুন

6. পিবিএস দ্রবণে সেকেন্ডারি অ্যান্টি-প্রজাতির অ্যান্টিবডি (ইমিউনোকনজুগেটস) দিয়ে ঝিল্লিকে 40 মিনিটের জন্য +37℃-এ অবিরাম নাড়তে থাকুন।

7. পিবিএসটি দ্রবণে ঝিল্লিটি 5 মিনিটের জন্য +37℃ এ অবিরাম নাড়তে 5 বার ধুয়ে ফেলুন।

8. হর্সরাডিশ পারক্সিডেসের সাথে সংযুক্ত আবদ্ধ অ্যান্টিবডি সনাক্তকরণের জন্য, আমরা DAB সাবস্ট্রেট সমাধান ব্যবহার করার পরামর্শ দিই।