Биотехнология в животноводстве и ветеринарной медицине. Биотехнология в животноводстве

Нашли своё применение при улучшении пород животных.

Одной из первых в этом направлении является биотехнология получения в больших количествах яйцеклеток крупного рогатого скота с высокими хозяйственными и генетическими показателями.

Известно, что у коров за один год образуется только одна, иногда две яйцеклетки, что не даёт возможности быстро приумножать знаменитые породы крупного рогатого скота. Введение инъекций определённого гормона коровам, дающим высокие удои качественного молока, позволило добиться образования у опытных коров большого количества яйцеклеток. Эти клетки были выделены из матки коров и оплодотворены в искусственных условиях. Образовавшиеся зиготы имплантированы в матку непородистых коров, не имеющих хозяйственно ценных показателей. В результате от непородистой коровы получено потомство ценной породы. Эта биотехнология применяется во многих странах.

Всемирно известная американская компания Монсанто, исполь-зуя методы генной инженерии, начала производство гормона роста (growth hormone), который был инъецирован коровам. Это позволило добиться увеличения надоев молока. Продукция этой компании в настоящее время продаётся в продуктовых магазинах США.

Микроинъецирование зиготы (оплодотворённой яйцеклетки) различными генами и получение трансгенных мышей или крыс практикуется во многих лабораториях.

В 1997 г. шотландским учёным Рослином был создан клон овцы , и это открытие наделало много шума. До этого эксперимента в зиготу с удалённым ядром пересаживалось ядро из другой эмбриональной клетки, и образовавшаяся трансплантная яйцеклетка имплантировалась в матку неродной матери. Отличие результатов опытов Рослина от опытов Гордона и других экспериментов состоит в том, что он впервые добился получения зрелого организма путём введения в зиготу с удалённым ядром ядра, выделенного из соматической клетки зрелого организма.

Использование при создании клона ядра соматической клетки зрелого организма вызывает у отдельных состоятельных лиц желание создать своего клона. Вполне вероятно, что этим способом физически возможно создание клона любого человека , однако идентичность созданного клона своему оригиналу в духовном и умственном отношениях является весьма проблематичной.

Современные биотехнологии в животноводстве Выполнила ученица 10 «Б» класса Суханова Вера Преподаватель Жирнова Л. Е.

Что такое биотехнология животных? На настоящий момент биотехнологии приобретают все более важную роль в повышении доходности животноводства. Внедрение результатов биотехнологических исследований в животноводство происходит в первую очередь в следующих областях деятельности: 1. Улучшение здоровья животных с помощью биотехнологии;2. Новые достижения в лечении людей с помощью биотехнологических исследований на животных;3. Улучшение качества продуктов животноводства с помощью биотехнологии;4. Достижения биотехнологии в охране окружающей среды и сохранении биологического разнообразия.Биотехнология животных включает в себя работу с различными животными (скотом, домашней птицей, рыбой, насекомыми, домашними животными и лабораторными животными) и исследовательскими приемами – геномикой, генной инженерией и клонированием.

Биотехнология для улучшения здоровья животных На сегодняшний день, по оценкам специалистов, рынок биотехнологических ветеринарных средств составляет 2,8 миллиардов долларов США. Ожидается, что в 2005 году эта цифра возрастет до 5,1 миллиардов. На июль 2003 года на фармакологическом рынке было зарегистрировано 111 биотехнологических ветеринарных продуктов, в том числе убитых бактериальных и вирусных вакцин. Ежегодно ветеринарная промышленность инвестирует в исследования и разработку новых препаратов более 400 миллионов долларов США.

Примеры диагностики и лечения животных – биотехнология позволяет фермерам немедленно диагностировать с помощью тестов на основе ДНК-типирования и определения наличия антител следующие инфекционные заболевания: бруцеллез, псевдобешенство, понос, ящур, лейкоз птиц, коровье бешенство и трихинеллез;– в скором времени ветеринары получат в свое распоряжение биотехнологические средства для лечения различных заболеваний, в том числе ящура, свиной лихорадки и коровьего бешенства;– новые биологические вакцины используются для защиты животных от широкого спектра заболеваний, включая ящур, понос, бруцеллез, легочные инфекции свиней (плевропневмонию, пневмонический пастереллез, энзоотическую пневмонию), геморрагическую септицемию, птичью холеру, псевдочуму домашней птицы, бешенство и инфекционные заболевания выращиваемой в искусственных условиях рыбы;

Примеры диагностики и лечения животных – активная работа ведется над созданием вакцины против африканского заболевания скота, получившего название лихорадки Восточного побережья. В случае успеха эта вакцина станет первым препаратом для борьбы с простейшими и одновременно первым шагом на пути к разработке противомалярийной вакцины;– молекулярные методы идентификации патогенов, такие как геномная дактилоскопия, позволяют наблюдать за распространением заболевания внутри стада и от популяции к популяции и идентифицировать источник инфекции;– генетический анализ патогенеза заболеваний животных ведет к улучшению понимания факторов, вызывающих заболевания не только животных, но и человека, и подходов к контролю над ними;

Примеры диагностики и лечения животных – улучшенные с помощью биотехнологии сорта кормовых растений обеспечивают повышение питательности кормов за счет дополнительного содержания в них аминокислот и гормонов, приводящих к ускорению роста животных и повышению их продуктивности. Биотехнологические приемы позволяют повысить усвояемость грубых кормов. Ученые работают над новыми сортами растений с целью создания съедобных вакцин для сельскохозяйственных животных. В ближайшем будущем фермеры получат возможность кормить свиней генетически модифицированной люцерной, стимулирующей специфический иммунитет к опасной кишечной инфекции. – новые ДНК-тесты позволяют выявлять свиней, страдающих генетически обусловленным свиным стресс-синдромом, характеризующимся дрожанием и гибелью животных при воздействии стрессовых факторов; – передающиеся по наследству неблагоприятные признаки скота могут быть идентифицированы с помощью ДНК-тестов, в настоящее время использующихся в национальных селекционных программах в Японии. С их помощью можно выявить дефект адгезии лейкоцитов, характеризующийся повторяющимися бактериальными инфекциями, задержкой роста и гибелью в течение первого года жизни; недостаточность фактора свертываемости крови XIII; наследственные формы анемии и задержку роста крупного рогатого скота.

Руководители животноводческих хозяйств непосредственно заинтересованы в повышении продуктивности сельскохозяйственных животных. Их конечной целью является повышение количества продукции (молока, яиц, мяса, шерсти) без увеличения затрат на содержание поголовья. Увеличение мышечной массы с одновременным снижением количества жира в организме мясных животных с незапамятных времен является целью селекционеров. Повышение продуктивности скота Именно с нее началась селекция и постепенное уменьшение свиней.

1 способ повышение продуктивности скота Биотехнология помогает улучшить продуктивность скота с помощью различных вариантов селекционного разведения. Для начала отбираются особи, обладающие желаемыми характеристиками, после чего, вместо традиционного скрещивания, производится забор спермы и яйцеклето к и последующее экстракорпоральное оплодотворение. Через несколько дней развивающийся эмбрион имплантируется в матку суррогатной матери соответствующего вида, но необязательно той же породы.

2 способ повышение продуктивности скота В 2003 году был официально зарегистрирован первый проверенный с помощью метода полиморфизма одного нуклеотида (SNP – single nucleotide polymorphisms) геном крупного рогатого скота мясного направления. SNP-метод используется для идентификации генных кластеров, ответственных за формирование того или иного признака, например, за поджарость животного. После чего с помощью методов традиционной селекции выводятся породы, в данном случае, отличающиеся повышенной мускулистостью. Во всем мире ведется активная работа по секвенированию геномов различных животных и насекомых. В октябре 2004 года было объявлено об успешном завершении проекта по секвенированию коровьего генома (Bovine Genome Sequencing Project). В декабре 2004 года было также успешно завершено секвенирование генома курицы.

3 способ повышение продуктивности скота Для повышения продуктивности животных нужен полноценный корм. Микробиологическая промышленность выпускает кормовой белок на базе различных микроорганизмов - бактерий, грибов, дрожжей, водорослей. Богатая белками биомасса одноклето чных организмов с высокой эффективностью усваивается сельскохозяйственными животными. Так, 1 т кормовых дрожжей позволяет получить 0,4- 0,6 т свинины, до 1,5 т мяса птиц, 25-30 тыс. яиц и сэкономить 5-7 т зерна (Р. С. Рычков, 1982). Это имеет большое народнохозяйственное значение, поскольку 80% площадей сельскохозяйственных угодий в мире отводятся для производства корма скоту и птице. Производство кормового белка на основе одноклето чных - процесс, не требующий посевных площадей, не зависящий от климатических и погодных условий. Он может быть осуществлен в непрерывном и автоматизированном режиме.

Что такое биотехнология животных? На настоящий момент биотехнологии приобретают все более важную роль в повышении доходности животноводства. Внедрение результатов биотехнологических исследований в животноводство происходит в первую очередь в следующих областях деятельности: 1. Улучшение здоровья животных с помощью биотехнологии; 2. Новые достижения в лечении людей с помощью биотехнологических исследований на животных; 3. Улучшение качества продуктов животноводства с помощью биотехнологии; 4. Достижения биотехнологии в охране окружающей среды и сохранении биологического разнообразия. Биотехнология животных включает в себя работу с различными животными (скотом, домашней птицей, рыбой, насекомыми, домашними животными и лабораторными животными) и исследовательскими приемами – геномикой, генной инженерией и клонированием.геномикойгенной инженерией и клонированием

Примеры диагностики и лечения животных – биотехнология позволяет фермерам немедленно диагностировать с помощью тестов на основе ДНК-типирования и определения наличия антител следующие инфекционные заболевания: бруцеллез, псевдобешенство, понос, ящур, лейкоз птиц, коровье бешенство и трихинеллез; – в скором времени ветеринары получат в свое распоряжение биотехнологические средства для лечения различных заболеваний, в том числе ящура, свиной лихорадки и коровьего бешенства; – новые биологические вакцины используются для защиты животных от широкого спектра заболеваний, включая ящур, понос, бруцеллез, легочные инфекции свиней (плевропневмонию, пневмонический пастереллез, энзоотическую пневмонию), геморрагическую септицемию, птичью холеру, псевдочуму домашней птицы, бешенство и инфекционные заболевания выращиваемой в искусственных условиях рыбы; коровье бешенство

Примеры диагностики и лечения животных – активная работа ведется над созданием вакцины против африканского заболевания скота, получившего название лихорадки Восточного побережья. В случае успеха эта вакцина станет первым препаратом для борьбы с простейшими и одновременно первым шагом на пути к разработке противомалярийной вакцины; – молекулярные методы идентификации патогенов, такие как геномная дактилоскопия, позволяют наблюдать за распространением заболевания внутри стада и от популяции к популяции и идентифицировать источник инфекции; – генетический анализ патогенеза заболеваний животных ведет к улучшению понимания факторов, вызывающих заболевания не только животных, но и человека, и подходов к контролю над ними;геномная дактилоскопия

Примеры диагностики и лечения животных – улучшенные с помощью биотехнологии сорта кормовых растений обеспечивают повышение питательности кормов за счет дополнительного содержания в них аминокислот и гормонов, приводящих к ускорению роста животных и повышению их продуктивности. Биотехнологические приемы позволяют повысить усвояемость грубых кормов. Ученые работают над новыми сортами растений с целью создания съедобных вакцин для сельскохозяйственных животных. В ближайшем будущем фермеры получат возможность кормить свиней генетически модифицированной люцерной, стимулирующей специфический иммунитет к опасной кишечной инфекции. – новые ДНК-тесты позволяют выявлять свиней, страдающих генетически обусловленным свиным стресс- синдромом, характеризующимся дрожанием и гибелью животных при воздействии стрессовых факторов; – передающиеся по наследству неблагоприятные признаки скота могут быть идентифицированы с помощью ДНК-тестов, в настоящее время использующихся в национальных селекционных программах в Японии. С их помощью можно выявить дефект адгезии лейкоцитов, характеризующийся повторяющимися бактериальными инфекциями, задержкой роста и гибелью в течение первого года жизни; недостаточность фактора свертываемости крови XIII; наследственные формы анемии и задержку роста крупного рогатого скота.

1 способ повышение продуктивности скота Биотехнология помогает улучшить продуктивность скота с помощью различных вариантов селекционного разведения. Для начала отбираются особи, обладающие желаемыми характеристиками, после чего, вместо традиционного скрещивания, производится забор спермы и яйцеклеток и последующее экстракорпоральное оплодотворение. Через несколько дней развивающийся эмбрион имплантируется в матку суррогатной матери соответствующего вида, но необязательно той же породы.

3 способ повышение продуктивности скота Для повышения продуктивности животных нужен полноценный корм. Микробиологическая промышленность выпускает кормовой белок на базе различных микроорганизмов бактерий, грибов, дрожжей, водорослей. Богатая белками биомасса одноклеточных организмов с высокой эффективностью усваивается сельскохозяйственными животными. Так, 1 т кормовых дрожжей позволяет получить 0,4- 0,6 т свинины, до 1,5 т мяса птиц, 2530 тыс. яиц и сэкономить 57 т зерна (Р. С. Рычков, 1982). Это имеет большое народнохозяйственное значение, поскольку 80% площадей сельскохозяйственных угодий в мире отводятся для производства корма скоту и птице. Производство кормового белка на основе одноклеточных процесс, не требующий посевных площадей, не зависящий от климатических и погодных условий. Он может быть осуществлен в непрерывном и автоматизированном режиме.

Увеличение производства продукции и снижение материало - и энергоемкости животноводческой отрасли - важное народнохозяйственное задачи. Его решение зависит от формирования и развития сложных интегрированных систем, которые охватывают животных, технику и человека. Особенностью нового направления в развитии біотехно - логических систем в животноводстве является интегрированное применение технических средств механизации и автоматизации, электроники и вычислительной техники, создание систем управления биотехнологическими процессами.

Зооинженерия определяет способ получения продукции при минимальных затратах сырья (корма), труда и материальных ресурсов с оптимальным использованием биологических возможностей животных, системы содержания, кормления и ухода, изучает вопросы воспроизводства стада и санитарно-ветеринарного обслуживания.

Стабильное воспроизводство поголовья - сложное и экономически важный вопрос любой технологии производства животноводческой продукции. Это основное условие интенсивного развития отрасли, поскольку с каждой новой тварью, включенной в процесс воспроизводства, определяющие уровень, качество и эффективность производства продукции на период, который зависит от продолжительности хозяйственного использования животных и интервала между поколениями.

Крупный рогатый скот играет важную роль в производстве животноводческой продукции, но она принадлежит к одноплідних видов животных, поэтому численность и плодовитость являются факторами, которые лимитируют воспроизводства и как следствие - производство молока и мяса. Современные биотехнологические методы дают возможность рационально влиять на воспроизводственный потенциал самок, значительно увеличивать количество высокопродуктивных особей и тем самым - производство продукции животноводства.

Биотехнология - это наука, которая изучает возможности использования биологических процессов в различных отраслях сельского хозяйства, промышленности и медицины с целью разработки методов и технологий получения желаемых организмов и полезных веществ.

Биотехнология ускоренного и направленного управления размножением сельскохозяйственных животных стала возможной благодаря искусственному осеменению, гормональном регуляции половых циклов самок, трансплантации (пересадке) эмбрионов, методы клеточной и генной инженерии. Сельскохозяйственная біотехноло - гия в растениеводстве достигла значительных успехов в выведении новых сортов растений, в животноводстве она направлена преимущественно на создание желаемых генотипов, обеспечивающих высокую продуктивность животных и их интенсивное воспроизводство нетрадиционными методами.

Как биотехнологический метод успешно используют половые клетки производителей во время искусственного осеменения самок во всех отраслях животноводства.

□ Например, спермой одного быка можно ежегодно осеменить от 2 до 50 тыс. коров. Во многих странах есть банки, где хранятся миллионы доз замороженной спермы. От некоторых производителей за период использования получают 300 - 400 тыс. доз спермы.

Искусственная гормональная регуляция половых циклов самок способствует синхронизации охоты и дает возможность организовать одновременно искусственное оси - меніння больших групп животных. С наступлением половой зрелости в фолликулах яичников созревают яйцеклетки. Выход их из фолликула называется овуляцией. У коров и кобыл созревает одновременно обычно один фолликул, у овец - 2 - 3, у свиней - 8 - 12 в каждом яичнике. От количества фолликулов, что овулювали, и оплодотворенных яйцеклеток зависит количество приплода.

Гормональные средства издавна использовали для повышения плодовитости животных. Введение гормонов стимулирует многочисленную овуляции (суперовуляции), или увеличение в 10 - 12 раз количества яйцеклеток, которые образуются в каждом цикле. У коров и овец количество их возрастает до 25, у свиней - до 80. Этот метод применяют для получения потомства от высокопродуктивных особей пересадою оплодотворенных яйцеклеток самкам-реципиентам.

Трансплантация эмбрионов - это изъятие их из яйцеводов матки или одного животного (самка-донор) и пересадка в яйцевод или матку другого животного (самка-реципиент), которая находится в той же фазе полового цикла, что и донор. В дальнейшем эмбрион развивается в организме реципиента. Теленок-трансплантат наследует только генетические качества отца и матери-донора, реципиент не влияет на качество приплода.

Трансплантация эмбрионов - прогрессивное направление ускоренного воспроизводства поголовья, который дает возможность решать следующие задачи: интенсивно использовать генетический потенциал коров - рекордисток, ускорить создание высокопроизводительных семей и линий, получения двойняшек пересадкой двух эмбрионов одному реципиенту, создание банка эмбрионов от выдающихся животных способом глубокого их замораживания (криоконсервации), сохранение генетических ресурсов редких и исчезающих пород, упрощение транспортировки живого материала (эмбрионов) в различные регионы Земного шара.

Для получения эмбрионов в производственных условиях применяют не - хирургический метод, то есть вымывание их из матки с помощью специальных инструментов и питательных сред. Вводят эмбрионы реципиентам специальным катетером через шейку матки. В основном от одного донора получают за одно вымывание от трех до десяти пригодных для трансплантации эмбрионов. Вымывание проводят 3 - 4 раза в год, стельность наступает у 40 - 50 % реципиентов, то есть пока реально можно рассчитывать на получение до десяти телят - трансплантатов за год от одного донора. Для сравнения отметим, что от 100 коров при надлежащей организации искусственного осіме - ніння получают лишь 90 - 100 телят. Преимущество ембріопересадок очевидна.

В качестве реципиентов используют преимущественно физиологически здоровых животных, не представляющих племенной ценности, но которые отвечают требованиям стандартов по развитием и живой массой.

□ Например, телки пригодны для трансплантации в возрасте 16 - 18 мес живой массой 360 - 380 кг при хорошо выраженных признаков половой охоты. В последнее время станции по искусственному осеменению животных Канады, США, Франции, Великобритании,

Германии на 70 - 75% комплектуют быками-производителями, полученными методом трансплантации от выдающихся по молочной продуктивности коров с надоем 8000 - 10 000 кг молока за год.

Применяют также метод микрохирургического разделения эмбрионов с целью получения однояйцевых близнецов-двойняшек, что дает возможность гораздо рациональнее использовать генофонд выдающихся производителей и маток. Метод разделения эмбрионов на отдельные бластоміри с последующей пересадкой их реципиентам увеличивает выход телят во время трансплантации в два раза, что значительно повышает ее экономическую эффективность. Кроме того, монозиготні близнецы являются ценным материалом для решения многих генетических и селекционных вопросов.

Генетическая инженерия - новая прикладная ветвь молекулярной биологии и генетики, применение которой в животноводстве создает реальную основу для вывода желаемых форм животных с измененной наследственностью, молекулярной реконструкцией организма. Этого можно добиться планомерным действием на физиологические процессы воспроизводительной функции с помощью зоотехнических и биотехнологических мероприятий и оптимально управлять технологией и организацией процессов воспроизводства поголовья.

Лекция № 2. Биотехнология животных

1. Культивирование животных клеток

Признание идеи о том, что клетки тканей высших животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro, датируется первым десятилетием XX века. После того как стало известно, что подобные процессы реальны, наступил второй этап работ, начало которому положила демонстрация возможности выращивания и репродукции в таких клетках фильтрующихся инфекционных агентов-вирусов. Третий этап истории начинается со времени, когда была показана практическая возможность получения в клетках животных больших количеств вирусного материала для применения в вакцинных препаратах, и простирается до времени, когда: 1) стало возможным вставить в клетки специфические экзогенно полученные гены и получить их экспрессию и 2) подтверждена возможность выращивания в культуре из одиночной клетки целой популяции. Когда такие популяции получали из клетки, выделявшей в окружающую среду антитела, то все молекулы антител в надосадочной жидкости были одинаковыми. Причины и следствия этих двух феноменов в настоящее время интенсивно исследуются и они знаменуют собой начало четвертого этапа работ в данной области.

Чтобы показать способность клеток животных расти и делиться в культуре, потребовалось овладеть рядом подходов и методик. Особенности их приведены ниже.

1. Методики получения клеток, свободных от экзогенных прокариотов и грибов.

2. Методики разработки среды, в которых рост «вырезанных из ткани» или изолированных клеток не подавляется.

3. Методики наблюдения за клетками в динамике их развития.

4. Методики непрерывного культивирования культур клеток животных in vitro и поддержания их свободными от других биологических агентов.

Научную основу для разработки этих методик составляет представление о клетке как основном структурном элементе живых организмов животного и растительного происхождения. Идея о том, что клетки тканей животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro возникла на базе концепции, принадлежащей Клоду Бернару. Он предположил, что не только живые организмы способны сохранять постоянство внутренних условий, вне зависимости от изменений в окружающей среде. Клетка вне организма животного тоже будет стремиться поддерживать свои внутренние условия. Если различия между внутренними и внешними условиями будут незначительными, то высока вероятность роста и деления клетки. Такое понимание явления приводит к необходимости разработки сред, способных поддерживать и стимулировать рост клеток вне организма.

Чуть позже, в 1885 году, У. Ру (W. Roux) показал возможность сохранения вне организма живых тканей на практике. Он сохранял в жизнеспособном состоянии оболочку куриного эмбриона в теплом физиологическом растворе. Впоследствии он стал автором, активно публиковавшимся по проблемам эмбриологии in vitro. Позднее, в 1897 г., Лёб (Loeb) поддерживал в жизнеспособном состоянии клетки крови и соединительной ткани в пробирках с сывороткой и плазмой крови. Льюнгрен (1898) показал возможность поддержания эксплантатов кожи человека в жизнеспособном состоянии в кислой среде с сохранением способности к реимплантации. Дополнительные эксперименты были проведены Джолли (1903), наблюдавшим деление клетки в висячей капле, содержащей лейкоциты саламандры, а Биб и Эвинг (1906) подтвердили это при пересадке лимфосаркомной ткани собаки.

Продолжая работы Ру, Росс Харрисон усовершенствовал методику «висячей капли». Он использовал небольшие кусочки ткани, отторгнутые от медуллярного сосуда лягушки к внедренные в ее лимфатический тромб, и выдерживал их в виде капли на нижней стороне покровного стекла, расположенного поверх углубления в предметном стекле. В 1907 г. ему удалось наблюдать с помощью такой «камеры» рост нервных клеток в течение нескольких недель; он установил, что скорость роста этих клеток составляет 20 мкм за 25 мин. В то время как эксперименты Харрисона были направлены на то, чтобы получить ответы на вопросы, относящиеся к физиологии нервных клеток лягушки, методика, которой он пользовался, была применена Барроузом для других клеток тканей теплокровных животных. Этот исследователь в 1910 г. вместо лимфатического тромба использовал тромб плазмы курицы.

В 1913 г. Алексис Каррель применил плазму крови, обогащенную экстрактом эмбриона. Добавка такого экстракта ускоряла рост тканей. Примененная методика обеспечивала значительно большую вероятность успеха, чем та, которую использовали Левис (1911) и Рид (1908 г.). Рид готовила культуры клеток из костного мозга морской свинки и пыталась выращивать эксплантаты на среде определенного химического состава. Работа Карреля привлекла большое внимание, так как она была опубликована под интригующим названием - культивирование «бессмертных» клеток. Инкубация клеток сердца куриною эмбриона была начала 17 января 1912 г. Пересев клеток продолжил Эблинг, как он сам заявлял, работая с ними 34 года. Поскольку Каррель был хирургом и весьма сведущим в вопросах асептики, он смог внести существенный вклад в культивирование клеток животных in vitro. В то же время организация и технические условия проводимых экспериментов были очень громоздкими. Ассистенты Карреля были одеты в длиннополые резиновые халаты темного цвета с капюшонами для полного прикрытия головы. Процедуры были длительными и отягощенными многими деталями. В результате тех требований, которые выдвигались автором в отношении сложных мер предосторожности для предотвращения контаминации, вокруг данного предмета создалась атмосфера таинственности и исключительности, что скорее тормозило прогресс, чем способствовало ему. Тем не менее им было достигнуто многое. В частности, даже при отсутствии антибиотиков он добился успеха в пересадке клеток, используя хирургическую технику для отторжения отдельных колоний и переноса их в новые условия роста. Каррель также продемонстрировал своим коллегам научное значение тех наблюдений, которые могут быть сделаны в процессе пересадки клеток.

В ходе проделанных работ был внесен ряд поправок в рецептуру среды культивирования. В частности, Тирод модифицировал раствор Рингера и в дополнение к куриной сыворотке и эмбриональному экстракту стал использовать коагулят фибрина. Для наблюдения за делящимися клетками животных Канти в 1928 г. разработал метод кинофотомикрографии. В этот же период был разработан дополнительный и очень существенный подход в технике работы с клетками. Имеется в виду применение трипсина для высвобождения клеток из тканевой матрицы, в которой они находятся. Однако эта методика не находила признания до тех пор, пока в 1937 г. Симмс и Стидлман использовали ее для пассирования клеток между культурами плазмы. Эта методика дает возможность успешно применять в культурах индивидуальные клетки, а не ткани.

Впервые клоны клеток в культуре из одиночной клетки были получены Эрлом с сотрудниками в 1948 году. Игл (1955) систематически исследовал пищевые потребности клеток в условиях. До тех пор пока в 1961 г. Хейфлик и Мурхед не выделили линию диплоидных клеток человека (НДС) WI-38, считалось, что один раз установившаяся клеточная линия имеет неограниченное время жизни. Относительно линии WI-38 было показано, что период ее существования в культуре ограничивается приблизительно 50 удваиваниями популяции. Перед отмиранием популяции для клеток этой линии характерен феномен старения. Однако при отмирании эти клетки оставались диплоидными и не имели признаков злокачественных изменений. Клетки, выделенные из раковых опухолей или трансформированные в ходе культивирования, характеризуются «бессмертностью» и коррелируют с гетероплоидностью. Первые суспензионные культуры клеток животных, как правило, основывались на клетках злокачественных тканей. Это - клетки HeLa, выделенные из раковой опухоли шейки матки человека. Перевиваемая линия карциномы шейки матки была выделена еще в 1952 году Джеем с сотрудниками, она используется и в настоящее время во многих лабораториях мира.

Последующий этап в истории культивирования диплоидных клеток человека связан с установлением факта, что они являются генетически стабильными и свободными от всех известных латентных и онкогенных вирусов. Поэтому линии диплоидных клеток человека разрешено применять для получения продуктов, предназначаемых для людей. Эта догма остается действующей и в настоящее время, хотя новейшие открытия отчетливо показали присутствие в клетках, выделенных из нормальных тканей, потенциальных онкогенов, идентичных тем, которые найдены в таких известных онкогенных вирусах, как вирус саркомы Рауса и вирус саркомы Молони. Раус еще в 1910 году индуцировал опухоль, использовав профильтрованный экстракт куриной опухоли. Эта опухоль была индуцирована РНК-вирусом (вирус саркомы Рауса). Позднее было установлено, что ряд вирусов способен индуцировать возникновение опухолей, такие вирусы были названы онкогенными.

2. Введение в культуру животных клеток

Системы культивирования клеток

Существует 2 основных системы культивирования клеток.

1. Непроточные культуры – тип культур, в котором клетки вводят в фиксированный объем среды. По мере роста клеток происходит использование питательных веществ и накопление метаболитов, поэтому среда должна периодически меняться, что приводит к изменению клеточного метаболизма, называемого еще и физиологической дифференцировкой. Со временем, в результате истощения среды происходит прекращение пролиферации клеток.

Увеличить продолжительность жизни непроточных культур можно несколькими способами:

· прерывистый (часть культуры заменяется равным объемом свежей среды);

· постоянный (объем культуры увеличивается с постоянной низкой скоростью, а небольшие порции клеток периодически удаляются);

· перфузионный (осуществляется постоянное поступление свежей среды в культуру и одновременное удаление равного объема использованной (бесклеточной) среды).
Перфузия может быть открытой, когда из системы удаляется вся среда, и закрытой, когда удаляемая среда проходит через дополнительный сосуд, где восстанавливается ее рН и осуществляется аэрирование, и возвращается в культуральный сосуд.

Все системы непроточных культур характеризуются накоплением отходов в той или иной форме и непостоянством внешних условий.

2. Проточные культуры обеспечивают истинные гомеостатические условия без изменения концентрации питательных веществ и метаболитов, а также числа клеток. Гомеостаз обусловлен постоянным вхождением среды в культуру и одновременным удалением равного объема среды с клетками. Такие системы пригодны для суспензионных культур и монослойных культур на микроносителях.

Существует 2 крупных направления в культивировании животных клеток:монослойные культуры и суспензионные культуры.

Суспензионные культуры предпочтительнее с точки зрения увеличения выхода клеток.

Монослойные культуры также обладают рядом преимуществ:
1. Легко провести полную замену среды и промыть клетки перед добавлением свежей питательной среды. Это важно в тех случаях, когда рост клеток идет в одних условиях, а наработка продукта в других условиях, например при переносе клеток из среды с сывороткой в бессывороточную среду. Можно также полностью удалять нежелательные компоненты.
2. Позволяют обеспечить высокую плотность клеток.
3. У многих клеток экспрессия требуемого продукта идет эффективнее, если клетки прикреплены к субстрату.
4. Монослойные культуры могут быть использованы для любого типа клеток, что обеспечивает наибольшую гибкость исследований.
5. В некоторых случаях, например для распространения вирусов, требуются тесные межклеточные контакты.

Недостатками монослойных культур являются:

· требования большого пространства;

· возрастание стоимости и трудоемкости при увеличении масштаба;

· недостаточно эффективный контроль, обусловленный трудностями отбора пробы;

· сложности в определении и контролировании рН, концентрации кислорода.

Необходимо отметить, что применение микроносителей устраняет эти недостатки. Существует много различных разновидностей этого способа культивирования. Рассмотрим три основных направления:

1. Культивирование в плоских флаконах (матрацах).

2. Культивирование во вращающихся бутылях, когда в каждый момент времени 1520% поверхности бутыли покрыто питательной средой, а клетки находятся попеременно то в среде, то в воздухе.

3. Культивирование в колонках на микроносителях, в качестве которых выступают плотно упакованные, не смещающиеся стеклянные бусы диаметром 35 мм, стопка пластин и др., а питательная среда омывает их, протекая сверху вниз.

3. Клонирование животных

История клонирования

Американские исследователи С. Стик и Дж. Робл, используя методику МакГрата и Солтера, в 1988 г. получили 6 живых кроликов, пересадив ядра 8 клеточных эмбрионов одной породы в лишенные ядра яйцеклетки кроликов другой породы. Фенотип родившихся полностью соответствовал фенотипу донора. В этих экспериментах только 6 из 164 реконструированных яйцеклеток (3,7%) развились в нормальных животных. Это, конечно, очень низкий выход, практически не позволяющий рассчитывать на получение таким методом клона генетически идентичных животных. Ценность этой работы тем не менее в том. что она показала возможность клонирования эмбрионов кроликов.

Первые успешные эксперименты по клонированию сельскохозяйственных животных были проведены С. Уилладсином (S.Willadsen) в 1986 г. Он сливал безъядерные яйцеклетки с бластомерами, выделенными из 8 и 16-клеточного эмбриона овцы.

Дж. Робл и его сотрудники в1987 провели работы по пересадке ядер крупного рогатого скота. Они пересаживали в зиготы кариопласты – мужской и женский пронуклеусы вместе с окружающей их цитоплазмой, а также ядра 2, 4 или 8-клеточных эмбрионов коровы. Сначала зиготы центрифугировали чтобы освободить пронуклеусы от окружающих их гранул желтка, после чего ядра были хорошо видны под микроскопом, что значительно облегчало их удаление. При помощи манипулятора и заостренной стеклянной микропипетки извлекали один из бластомеров вместе с ядром из ранних зародышей и переносили его в энуклеированную зиготу.

Реконструированные зародыши были заключены в агаровый цилиндр и пересажены в перевязанный яйцевод овцы. Через пять дней культивирования их вымывали, освобождали от агара и исследовали. Реконструированные зародыши в этой работе развивались только в тех случаях, когда в зиготы пересаживали пронуклеусы: 17% таких зародышей достигли стадии морулы или бластоцисты. Два зародыша были пересажены второму реципиенту – в матку коровы, и развитие их завершилось рождением живых телят. Если в качестве доноров использовали ядра 2-, 4- или 8-клеточных зародышей, то реконструированные яйцеклетки не развивались даже до стадии морулы.

Позже были и более успешные работы. С. Уиладсин (1989), в частности. сообщил, что ему удалось получить четырех генетически идентичных бычков холстейнской породы в результате пересадки в реципиентные яйцеклетки ядер бластомеров одного 32-клеточного зародыша. Автор утверждал, что большинство ядер сохраняет тотипотентность на 32-клеточной стадии, а значительная их часть даже на 64-клеточной стадии, обеспечивая нормальное развитие реконструированных яйцеклеток до стадии ранней бластоцисты в яйцеводе овцы. После пересадки в матку коров – окончательных реципиентов, как полагает автор, они могут и дальше нормально развиваться.

К. Бондиоли и соавторы (1990), используя в качестве доноров ядер 16-64-клеточные зародыши коров, трансплантировали 463 реконструированных зародыша в матку синхронизированных реципиентов, и было получено 92 живых теленка. Семь из них были генетически идентичны, представляя собой клон, полученный в результате пересадки ядер клеток одного донорского эмбриона.

Таким образом, клеточные ядра зародышей крупного рогатого скота достаточно долго сохраняют тотипотентность и могут обеспечить полное развитие реконструированных яйцеклеток. Иначе говоря, методические трудности клонирования зародышей крупного рогатого скота практически решены.

Экспериментов по клонированию свиней немного. Успешные исследования провели Р. Пратер с сотрудниками в 1989 г. Скудность данных, видимо, связана с определенными трудностями работы с этим объектом.

в 1993-1995 годах, группа исследователей под руководством Я. Уилмута (Ian Wilmut) из Рослинского института получила клон овец – 5 идентичных животных, донорами ядер которых была культура эмбриональных клеток. Клеточную культуру получали следующим образом: выделяли микрохирургически эмбриональный диск из 9-дневного овечьего эмбриона (бластоцисты) и культивировали клетки in vitro в течение многих пассажей (по крайней мере до 25). Сначала клеточная культура напоминала культуру стволовых недифференцированных эмбриональных клеток, но вскоре, после 2-3-х пассажей, клетки становились уплотненными и морфологически сходными с эпителиальными. Эта линия клеток из 9-дневного зародыша овцы была обозначена как TNT4.

Чтобы донорское ядро и реципиентная цитоплазма находились на сходных стадиях клеточного цикла, останавливали деление культивируемых клеток TNT4 на определенной стадии (G O) и ядра этих клеток пересаживали в энуклеированные яйцеклетки (соответственно на стадии метафазы II). Реконструированные эмбрионы заключали в агар и трансплантировали в перевязанные яйцеводы овец. Через 6 дней эмбрионы вымывали из яйцевода первого реципиента и исследовали под микроскопом. Отбирали те, которые достигли стадии морулы или бластоцисты и пересаживали их в матку овцы – окончательного реципиента, где развитие продолжалось до рождения. Родилось 5 ягнят (самок) из них 2 погибли вскоре после рождения, 3-й в возрасте 10 дней, а 2 оставшихся нормально развивались и достигли 8-9-месячного возраста. Фенотипически все ягнята были сходны с породой овец, от которой получали исходную линию клеток TNT4. Это подтвердил и генетический анализ.

Эта работа, особенно в части культуры эмбриональных клеток, – значительное достижение в клонировании млекопитающих, хотя она и не вызвала столь шумного интереса, как статья того же Уилмута с соавторами, опубликованная в начале 1997 года, где сообщалось, что в результате использования донорского ядра клетки молочной железы овцы было получено клональное животное – овца по кличке Долли. Последняя работа методически во многом повторяет предыдущее исследование 1996 года, но в ней ученые использовали эмбриональные и фибробластоподобные клетки плода и клетки молочной железы взрослой овцы. Клетки молочной железы получали от шестилетней овцы породы финн дорcет, находящейся на последнем триместре беременности. Все три типа клеточных культур имели одинаковое число хромосом – 54, как обычно у овец. Эмбриональные клетки использовали в качестве доноров ядер на 7-9-м пассажах культивирования, фибробластоподобные клетки плода – на 4-6-м пассажах и клетки молочной железы – на 3-6-м пассажах. Деление клеток всех трех типов останавливали на стадии G 0 и ядра клеток пересаживали в энуклеированные ооциты (яйцеклетки) на стадии метафазы II. Был использован метод электрослияния. Большинство реконструированных эмбрионов сначала культивировали в перевязанном яйцеводе овцы, но некоторые и in vitro в химически определенной среде. Коэффициент выхода морул или бластоцист при культивировании in vitro в одной серии опытов был даже вдвое выше, чем при культивировании в яйцеводе.

Выход морул или бластоцист в серии опытов с культурой клеток молочной железы был примерно втрое меньше, чем в двух других сериях, когда в качестве доноров ядер использовали культуру фибробластов плода или эмбриональных клеток. Число живых ягнят в сравнении с числом пересаженных в матку окончательного реципиента морул или бластоцист было также в два раза ниже. В серии опытов с клетками молочной железы из 277 реконструированных яйцеклеток был получен только один живой ягненок, что говорит об очень низкой результативности такого рода экспериментов (0,36%). Анализ генетических маркеров всех семи родившихся в трех сериях экспериментов живых детенышей показал, что клетки молочной железы были донорами ядер для одного, фибробласты плода – для двух и эмбриональные клетки – четырех ягнят. Овца по кличке Долли развилась из реконструированной яйцеклетки, донором ядра которой была культивируемая клетка молочной железы овцы породы финн дорсет и фенотипически не отличается от овец этой породы, но сильно отличается от овцы-реципиента. Анализ генетических маркеров подтвердил этот результат.

Успех авторов этой работы прежде всего связан с использованием длительных клеточных культур, так как после многих пассажей в культуре клеток могли быть отобраны малодифференцированные стволовые клетки, которые, вероятно, и были использованы как доноры ядер. Большое значение также имел тот факт, что авторы, учитывая результаты своих предыдущих работ, синхронизировали стадии клеточного цикла яйцеклеток реципиентов и клеток доноров.

Аналогичные эксперименты проводили позднее Tanja Dominko и сотрудники лаборатории Висконсинского университета, которые обеспечили клонирование эмбрионов из клеток кожи ушей взрослого рогатого скота. Эмбрионы, генетически идентичные корове, пожертвовавшей клетки уха, были внедрены в матки коров – рецепиентов. Наблюдалась постепенная гибель эмбрионов, поэтому жизнеспособных телят не получили. Причины пока не установлены.

В августе 1997 года появилось сообщение о том, что Алан Троунсон (Австралия) разработал технологию, которая позволяет сформировать эмбрион из 16, 32 или 64 клеток и затем каждая из них может использоваться для формирования 16, 32 или 64 идентичных эмбрионов. Коллектив исследователей во главе с Аланом Троунсоном создал 470 генетически идентичных эмбрионов рогатого скота от единственной бластоцисты. Такая технология обеспечивает безграничный источник генетического материала для клонирования.

Несмотря на отсутствие немедленных практических результатов сделанного открытия, теоретическую значимость его трудно переоценить. Впервые было доказано, что гены запрограммированы обратимо. Дальнейшие исследования могут позволить понять, как регулируется работа генов, дифференциация клеток, почему клетки в одних случаях растут и размножаются управляемо, а в других (при раке) – неконтролируемо.

Уже сейчас корпорация Genzyme Transgenics планирует исследования с целью создания трансгенного крупного рогатого скота, содержащего в молоке человеческий альбумин. Был куплен патент на получение эмбрионов, содержащих геном клеток соединительной ткани (фибробластов), включающий ген, ответственный за синтез человеческого белка. Несколько коров в настоящее время беременны трансгенными телятами. Подобная технология позволяет увеличить эффективность создания трансгенных молочных животных, так как при обычном впрыскивании генов в оплодотворенную яйцеклетку рождается только 5 – 10% трансформированных животных, из них – несколько самцов, не дающих молока. Использование новой технологии клонирования позволяет получать животных только женского пола, дающих трансгенный протеин.

4. Технология трансплантации эмбрионов

Воспроизводство животных – это основной фактор, лимитирующий эффективность производства животноводческих продуктов на промышленной основе. Причины, препятствующие достижению оптимальных результатов в воспроизводстве домашнего скота различны. Новые методы расширяют возможности регулирования воспроизводства. Они связаны с манипулированием на уровне клеток или эмбрионов, с использованием физиологически активных соединений, поэтому названы биотехнологическими. К числу этих методов относят: стимуляцию и синхронизацию охоты, суперовуляцию, искусственное осеменение, трансплантацию эмбрионов, хранение гамет и эмбрионов, целенаправленное получение двоен, регулирование пола, раннюю диагностику беременности, управление процессом родов, создание химер и др.

Стимуляция и синхронизация охоты осуществляется с помощью прогестерона – женского полового гормона стероидной природы, регулирующего ход эстрального цикла, простагландинов, а также их комбинации. Этот прием позволяет вызывать появление охоты у групп племенных животных в один и тот же период времени.

В США для синхронизации охоты у телок в молочном и мясном скотоводстве выпускается новый препарат под названием “Синхро-мейт-В”. Он представляет совокупность двух гормонов, один из которых имплантируется под кожу, а другой инъецируется внутримышечно. Имплант помещается под кожу уха телки и сразу же после этого следует инъекция другого гормона. Под действием этих двух гормонов эстральный цикл телки прерывается и временно останавливается. Через некоторое время имплант удаляют из уха животного, начинается новый эстральный цикл. Так как имплант удаляется одновременно у всех телок, то и цикл начинается в одно и то же время.

Применение гормональных препаратов снимает необходимость ежедневного контроля за состоянием половой активности животных. Преимущество синхронизированной охоты состоит в реальной возможности формирования однородных групп животных в период осеменения, одновременности рождения приплода, точном учете кормов в группах.

Суперовуляция

Потенциальные возможности воспроизводства самок млекопитающих огромны. В их яичниках содержатся десятки и сотни тысяч овоцитов. Однако в процессе онтогенеза лишь небольшая часть из них реализуется в виде потомков. Остальные овоциты подвергаются атрезии (обратному развитию) и воспроизводстве не участвуют.

Суперовуляция – состояние, вызванное гормонами, когда в яичниках животных развивается и овулирует в несколько раз больше яйцеклеток. В зависимости от вида число овулирующих яйцеклеток может быть увеличено в 3 – 8 и даже в 50 раз. С помощью этого приема становится возможным получение большего количества эмбрионов от лучших по продуктивности коров.

Искусственное осеменение

Искусственное осеменение животных является самым старым и хорошо отработанным биотехнологическим методом разведения сельскохозяйственных животных. Применение этого метода позволяет ограничить распространение половых инфекций, которые нередко служат причиной бесплодия животных. Оно также позволяет эффективно использовать генетический потенциал лучших производителей. Экономический эффект от искусственного осеменения обусловлен снижением затрат на содержание большого поголовья производителей, возможностью быстрого размножения генотипа с хозяйственно – полезными признаками, улучшением генетического потенциала ремонтного стада.

Трансплантация эмбрионов

Трансплантация эмбрионов в настоящее время является одной из наиболее актуальных проблем в области животноводства. С помощью пересадки эмбрионов можно резко увеличить выход числа потомков от высокопродуктивных коров. Трансплантация эмбрионов, или эмбриотехнология, заключается в получении одного или нескольких эмбрионов из матки племенных животных (доноров) и пересадке в матку коров (рецепиентов), где эмбрионы развиваются до отела. Этот метод в сочетании с суперовуляцией у доноров позволяет получить большое потомство от высокопродуктивных животных. Этим способом эмбрионы можно внедрить в ту или иную породу в другие регионы, используя в качестве рецепиентов коров мясных пород. Применение этого метода также упрощает обмен генофондом сельскохозяйственных животных между странами и континентами. Пересадка эмбрионов может быть использована для получения потомства от ценных, но бесплодных коров, утративших способность к размножению в результате несчастного случая, болезни или по возрасту.

Когда было установлено, что кролик обладает иммунитетом по отношению к ящуру, была выдвинута идея использования метода трансплантации для оздоровления потомства зараженных ящуром животных. Половые пути кролика, куда трансплантируются эмбрионы, способны разрушать вирус ящура в эмбрионах. Трансплантация может быть использована и для временного хранения эмбрионов. В яйцеводах крольчих удается осуществлять трансконтинентальную перевозку эмбрионов овец.

Извлечение эмбрионов до 70-х годов производили в основном хирургическим путем, впоследствии он был заменен менее травматичным и трудоемким нехирургическим, основанным на введении в матку особого зонда по естественному каналу. Зонд имеет три канала. Один из каналов предназначен для надувания баллончика, который закупоривает рог матки, препятствуя вытеканию жидкости. По другому каналу вводится физиологический раствор с температурой 25-30 о С, который вымывает эмбрионы и возвращается вместе с ними через третий канал зонда в пробирку, помещенную в водяную баню с температурой 35 о С. Из этой жидкости извлекаются эмбрионы. В среднем при суперовуляции от донора можно получить от 5 до 7 эмбрионов.

Трансплантацию производят с помощью специального зонда или пистолета для осеменения. Эмбрионы помещаются в рога матки. Стельность у самок – рецепиентов проверяется по уровню прогестерона в плазме крови на 21-й день.

Регулирование пола. В практике разведения животных очень важно научиться управлять образованием в потомстве мужских и женских особей. Метод разделения эмбрионов по полу основан на определении белков, специфичных для самцов. Этом метод широко применяется в животноводческой практике многих стран. В Канаде уже с 1975 года рождаются телята, разделенные по полу на стадии эмбрионов. В перспективе для целенаправленного получения особей мужского или женского пола может быть применен метод микрохирургической замены Х и У хромосом. Такие манипуляции уже проводились на растительных клетках и яйцеклетках земноводных.