Біотехнологія у тваринництві та ветеринарній медицині. Біотехнологія у тваринництві

Знайшли своє застосування для поліпшення порід тварин.

Однією з перших у цьому напрямі є біотехнологія отримання у великих кількостях яйцеклітин великої рогатої худоби з високими господарськими та генетичними показниками.

Відомо, що у корів за один рік утворюється лише одна, іноді дві яйцеклітини, що не дає можливості швидко примножувати знамениті породи великої рогатої худоби. Введення ін'єкцій певного гормону коровам, що дає високі надої якісного молока, дозволило досягти утворення у досвідчених корів. великої кількостіяйцеклітин. Ці клітини були виділені з матки корів та запліднені у штучних умовах. Зиготи, що утворилися, імплантовані в матку непородистих корів, що не мають господарсько цінних показників. Через війну від непородистої корови отримано потомство цінної породи. Ця біотехнологія застосовується у багатьох країнах.

Всесвітньо відома американська компанія Монсанто, використовуючи методи генної інженерії, Почала виробництво гормону росту (growth hormone), який був ін'єктований коровам. Це дозволило досягти збільшення надоїв молока. Продукція цієї компанії нині продається у продуктових магазинах США.

Мікроін'єктування зиготи (заплідненої яйцеклітини) різними генами та отримання трансгенних мишей або щурів практикується у багатьох лабораторіях.

У 1997 р. шотландським ученим Росліном було створено клон вівці , і це відкриття наробило багато галасу. До цього експерименту в зиготу з віддаленим ядром пересаджувалося ядро з іншої ембріональної клітини, і трансплантна яйцеклітина, що утворилася, імплантувалася в матку нерідної матері. Відмінність результатів дослідів Рослина від дослідів Гордона та інших експериментів полягає в тому, що він вперше досяг отримання зрілого організму шляхом введення в зиготу з віддаленим ядром ядра, виділеного з соматичної клітинизрілого організму.

Використання під час створення клону ядра соматичної клітини зрілого організму викликає в окремих заможних осіб бажання створити свого клону. Цілком ймовірно, що цим способом фізично можливе створення клону будь-якої людини, однак ідентичність створеного клону своєму оригіналу в духовному та розумовому відношенні є дуже проблематичною.

Сучасні біотехнологіїу тваринництві Виконала учениця 10 «Б» класу Суханова Віра Викладач Жірнова Л.Є.

Що таке біотехнологія тварин? на теперішній моментбіотехнології набувають все більше важливу рольпідвищення прибутковості тваринництва. Впровадження результатів біотехнологічних досліджень у тваринництво відбувається насамперед у таких галузях діяльності: 1. Поліпшення здоров'я тварин за допомогою біотехнології;2. Нові досягнення у лікуванні людей за допомогою біотехнологічних досліджень на тваринах;3. Поліпшення якості продуктів тваринництва за допомогою біотехнології;4. Досягнення біотехнології в охороні навколишнього середовища та збереженні біологічного розмаїття. Біотехнологія тварин включає роботу з різними тваринами (скотом, свійським птахом, рибою, комахами, домашніми тваринами та лабораторними тваринами) та дослідницькими прийомами – геномікою, генною інженерією та клонуванням.

Біотехнологія для покращення здоров'я тварин На сьогоднішній день, за оцінками фахівців, ринок біотехнологічних ветеринарних засобів становить 2,8 мільярда доларів США. Очікується, що 2005 року ця цифра зросте до 5,1 мільярдів. На липень 2003 року на фармакологічному ринку було зареєстровано 111 біотехнологічних ветеринарних продуктів, зокрема убитих бактеріальних та вірусних вакцин. Щорічно ветеринарна промисловість інвестує у дослідження та розробку нових препаратів понад 400 мільйонів доларів США.

Приклади діагностики та лікування тварин - біотехнологія дозволяє фермерам негайно діагностувати за допомогою тестів на основі ДНК-типування та визначення наявності антитіл наступні інфекційні захворювання: бруцельоз, псевдобешенство, пронос, ящур, лейкоз птахів, коров'ячий сказ і трихінельоз; - незабаром ветерин; своє розпорядження біотехнологічні засоби для лікування різних захворювань– нові біологічні вакцини використовуються для захисту тварин від широкого спектру захворювань, включаючи ящур, пронос, бруцельоз, легеневі інфекції свиней (плевропневмонію, пневмонічний пастерельоз, ензоотичну пневмонію). , псевдочуму свійської птиці, сказ та інфекційні захворювання, що вирощується в штучних умовах риби;

Приклади діагностики та лікування тварин – активна роботаведеться над створенням вакцини проти африканського захворювання худоби, що отримало назву лихоманки Східного узбережжя. У разі успіху ця вакцина стане першим препаратом для боротьби з найпростішими та водночас першим кроком на шляху до розробки протималярійної вакцини; молекулярні методиідентифікації патогенів, такі як геномна дактилоскопія, дозволяють спостерігати за поширенням захворювання всередині стада і від популяції до популяції та ідентифікувати джерело інфекції; контролю за ними;

Приклади діагностики та лікування тварин – покращені за допомогою біотехнології сорти кормових рослин забезпечують підвищення поживності кормів за рахунок додаткового змістув них амінокислот і гормонів, що призводять до прискорення росту тварин та підвищення їхньої продуктивності. Біотехнологічні прийоми дозволяють підвищити засвоюваність грубих кормів. Вчені працюють над новими сортами рослин для створення їстівних вакцин для сільськогосподарських тварин. У найближчому майбутньому фермери матимуть можливість годувати свиней генетично модифікованою люцерною, що стимулює специфічний імунітет до небезпечної кишкової інфекції. - нові ДНК-тести дозволяють виявляти свиней, які страждають на генетично обумовлений свинячий стрес-синдром, що характеризується тремтінням і загибеллю тварин при впливі стресових факторів; – несприятливі ознаки худоби, що передаються у спадок, можуть бути ідентифіковані за допомогою ДНК-тестів, які в даний час використовуються в національних селекційних програмах в Японії. З їх допомогою можна виявити дефект адгезії лейкоцитів, що характеризується бактеріальними інфекціями, що повторюються, затримкою росту і загибеллю протягом першого року життя; недостатність фактора згортання крові XIII; спадкові форми анемії та затримку зростання великої рогатої худоби.

Керівники тваринницьких господарств безпосередньо зацікавлені у підвищенні продуктивності сільськогосподарських тварин. Їх кінцевою метоює підвищення кількості продукції (молоко, яєць, м'яса, вовни) без збільшення витрат утримання поголів'я. Збільшення м'язової маси з одночасним зниженням кількості жиру в організмі м'ясних тварин з давніх-давен є метою селекціонерів. Підвищення продуктивності худоби Саме з неї почалася селекція та поступове зменшення свиней.

1 спосіб підвищення продуктивності худоби Біотехнологія допомагає покращити продуктивність худоби за допомогою різних варіантівселекційного розведення. Для початку відбираються особини, що володіють бажаними характеристиками, після чого, замість традиційного схрещування, проводиться забір сперми і яйцеклітини і подальше екстракорпоральне запліднення. Через кілька днів ембріон, що розвивається, імплантується в матку сурогатної матері відповідного виду, але необов'язково тієї ж породи.

2 спосіб підвищення продуктивності худоби У 2003 році був офіційно зареєстрований перший перевірений за допомогою методу поліморфізму одного нуклеотиду (SNP – single nucleotide polymorphisms) геном великої рогатої худоби м'ясного спрямування. SNP-метод використовується для ідентифікації генних кластерів, відповідальних за формування тієї чи іншої ознаки, наприклад, за підсмаження тварини. Після чого за допомогою методів традиційної селекції виводяться породи, даному випадку, що відрізняються підвищеною м'язистістю. У всьому світі ведеться активна робота з секвенування геномів різних тварин та комах. У жовтні 2004 року було оголошено про успішному завершенніпроекту із секвенування коров'ячого геному (Bovine Genome Sequencing Project). У грудні 2004 року було також успішно завершено секвенування геному курки.

3 спосіб підвищення продуктивності худоби Для підвищення продуктивності тварин потрібен повноцінний корм. Мікробіологічна промисловість випускає кормовий білок з урахуванням різних мікроорганізмів - бактерій, грибів, дріжджів, водоростей. Багата білками біомаса одноклітинних організмів з високою ефективністюзасвоюється сільськогосподарськими тваринами. Так, 1 т кормових дріжджів дозволяє отримати 0,4-0,6 т свинини, до 1,5 т м'яса птахів, 25-30 тис. яєць та заощадити 5-7 т зерна (Р. С. Ричков, 1982). Це має велике народногосподарське значення, оскільки 80% площ сільськогосподарських угідь у світі приділяється для виробництва корму худобі та птиці. Виробництво кормового білка на основі одноклітинних - процес, що не вимагає посівних площ, не залежить від кліматичних та погодних умов. Він може бути здійснений у безперервному та автоматизованому режимі.

Що таке біотехнологія тварин? На даний момент біотехнології набувають все більшої ролі у підвищенні прибутковості тваринництва. Впровадження результатів біотехнологічних досліджень у тваринництво відбувається насамперед у таких галузях діяльності: 1. Поліпшення здоров'я тварин за допомогою біотехнології; 2. Нові досягнення у лікуванні людей за допомогою біотехнологічних досліджень на тваринах; 3. Поліпшення якості продуктів тваринництва за допомогою біотехнології; 4. Досягнення біотехнології в охороні навколишнього середовища та збереження біологічного розмаїття. Біотехнологія тварин включає роботу з різними тваринами (скотом, свійським птахом, рибою, комахами, домашніми тваринами та лабораторними тваринами) та дослідницькими прийомами – геномікою, генною інженерією та клонуванням.

Приклади діагностики та лікування тварин – біотехнологія дозволяє фермерам негайно діагностувати за допомогою тестів на основі ДНК-типування та визначення наявності антитіл наступні інфекційні захворювання: бруцельоз, псевдобешенство, пронос, ящур, лейкоз птахів, коров'ячий сказ та трихінельоз; – незабаром ветеринари отримають у своє розпорядження біотехнологічні засоби для лікування різних захворювань, у тому числі ящуру, свинячої лихоманки та коров'ячого сказу; – нові біологічні вакцини використовуються для захисту тварин від широкого спектру захворювань, включаючи ящур, пронос, бруцельоз, легеневі інфекції свиней (плевропневмонію, пневмонічний пастерельоз, ензоотичну пневмонію), геморагічну септицемію, пташину холеру, псевдочу умовах риби; коров'ячий сказ

Приклади діагностики та лікування тварин – активна робота ведеться над створенням вакцини проти африканського захворювання худоби, що отримало назву лихоманки Східного узбережжя. У разі успіху ця вакцина стане першим препаратом для боротьби з найпростішими та водночас першим кроком на шляху до розробки протималярійної вакцини; – молекулярні методи ідентифікації патогенів, такі як геномна дактилоскопія, дозволяють спостерігати за поширенням захворювання всередині стада та від популяції до популяції та ідентифікувати джерело інфекції; - генетичний аналіз патогенезу захворювань тварин веде до поліпшення розуміння факторів, що викликають захворювання не тільки тварин, але і людини, та підходів до контролю над ними; геномна дактилоскопія

Приклади діагностики та лікування тварин – покращені за допомогою біотехнології сорти кормових рослин забезпечують підвищення поживності кормів за рахунок додаткового вмісту в них амінокислот та гормонів, що призводять до прискорення росту тварин та підвищення їхньої продуктивності. Біотехнологічні прийоми дозволяють підвищити засвоюваність грубих кормів. Вчені працюють над новими сортами рослин для створення їстівних вакцин для сільськогосподарських тварин. У найближчому майбутньому фермери матимуть можливість годувати свиней генетично модифікованою люцерною, що стимулює специфічний імунітет до небезпечної кишкової інфекції. – нові ДНК-тести дозволяють виявляти свиней, які страждають на генетично обумовлений свинячий стрес-синдром, що характеризується тремтінням і загибеллю тварин при впливі стресових факторів; – несприятливі ознаки худоби, що передаються у спадок, можуть бути ідентифіковані за допомогою ДНК-тестів, які в даний час використовуються в національних селекційних програмах в Японії. З їх допомогою можна виявити дефект адгезії лейкоцитів, що характеризується бактеріальними інфекціями, що повторюються, затримкою росту і загибеллю протягом першого року життя; недостатність фактора згортання крові XIII; спадкові форми анемії та затримку зростання великої рогатої худоби.

Керівники тваринницьких господарств безпосередньо зацікавлені у підвищенні продуктивності сільськогосподарських тварин. Їх кінцевою метою є збільшення кількості продукції (молоко, яєць, м'яса, вовни) без збільшення витрат на утримання поголів'я. Збільшення м'язової маси з одночасним зниженням кількості жиру в організмі м'ясних тварин з давніх-давен є метою селекціонерів. Підвищення продуктивності худоби Саме з неї почалася селекція та поступове зменшення свиней.

1 спосіб підвищення продуктивності худоби Біотехнологія допомагає покращити продуктивність худоби за допомогою різних варіантів селекційного розведення. Для початку відбираються особини, що володіють бажаними характеристиками, після чого замість традиційного схрещування проводиться паркан сперми і яйцеклітин і подальше екстракорпоральне запліднення. Через кілька днів ембріон, що розвивається, імплантується в матку сурогатної матері відповідного виду, але необов'язково тієї ж породи.

2 спосіб підвищення продуктивності худоби У 2003 році був офіційно зареєстрований перший перевірений за допомогою методу поліморфізму одного нуклеотиду (SNP – single nucleotide polymorphisms) геном великої рогатої худоби м'ясного спрямування. SNP-метод використовується для ідентифікації генних кластерів, відповідальних за формування тієї чи іншої ознаки, наприклад, за підсмаження тварини. Після чого за допомогою методів традиційної селекції виводяться породи, що в даному випадку відрізняються підвищеною м'язистістю. У всьому світі ведеться активна робота з секвенування геномів різних тварин та комах. У жовтні 2004 року було оголошено про успішне завершення проекту із секвенування коров'ячого геному (Bovine Genome Sequencing Project). У грудні 2004 року було також успішно завершено секвенування геному курки. геному курки

3 спосіб підвищення продуктивності худоби Для підвищення продуктивності тварин потрібен повноцінний корм. Мікробіологічна промисловість випускає кормовий білок з урахуванням різних мікроорганізмів бактерій, грибів, дріжджів, водоростей. Багата білками біомаса одноклітинних організмів із високою ефективністю засвоюється сільськогосподарськими тваринами. Так, 1 т кормових дріжджів дозволяє отримати 0,4-0,6 т свинини, до 1,5 т м'яса птахів, 2530 тис. яєць та заощадити 57 т зерна (Р. С. Ричков, 1982). Це має велике народногосподарське значення, оскільки 80% площ сільськогосподарських угідь у світі приділяється для виробництва корму худобі та птиці. Виробництво кормового білка на основі одноклітинних процесів, що не вимагає посівних площ, не залежить від кліматичних та погодних умов. Він може бути здійснений у безперервному та автоматизованому режимі.

Збільшення виробництва продукції та зниження матеріало- та енергоємності тваринницької галузі – важливе народногосподарське завдання. Його рішення залежить від формування та розвитку складних інтегрованих систем, які охоплюють тварин, техніку та людину. Особливістю нового напряму у розвитку біотехно-логічних систем у тваринництві є інтегроване застосування технічних засобів механізації та автоматизації, електроніки та обчислювальної техніки, створення систем управління біотехнологічними процесами.

Зооінженерія визначає спосіб отримання продукції при мінімальних витратах сировини (корми), праці та матеріальних ресурсівз оптимальним використанням біологічних можливостей тварин, системи утримання, годівлі та догляду, вивчає питання відтворення стада та санітарно-ветеринарного обслуговування.

Стабільне відтворення поголів'я - складне та економічно важливе питаннябудь-якої технології виробництва тваринницької продукції. Це основна умова інтенсивного розвитку галузі, оскільки з кожним новим тварюком, включеним у процес відтворення, що визначають рівень, якість та ефективність виробництва продукції на період, що залежить від тривалості господарського використаннятварин та інтервалу між поколіннями.

Велика рогата худоба відіграє важливу роль у виробництві тваринницької продукції, але вона належить до одноплідних видів тварин, тому чисельність та плодючість є факторами, що лімітують відтворення та як наслідок – виробництво молока та м'яса. Сучасні біотехнологічні методи дають можливість раціонально впливати на відтворювальний потенціал самок, значно збільшувати кількість високопродуктивних особин і цим виробництво продукції тваринництва.

Біотехнологія - це наука, яка вивчає можливості використання біологічних процесів у різних галузях сільського господарства, промисловості та медицини з метою розробки методів та технологій отримання бажаних організмів та корисних речовин.

Біотехнологія прискореного та спрямованого управління розмноженням сільськогосподарських тварин стала можливою завдяки штучному запліднюванню, гормональному регулюванню статевих циклів самок, трансплантації (пересадці) ембріонів, методи клітинної та генної інженерії. Сільськогосподарська біотехнологія у рослинництві досягла значних успіхів у виведенні нових сортів рослин, у тваринництві вона спрямована переважно на створення бажаних генотипів, що забезпечують високу продуктивність тварин та їх інтенсивне відтворення нетрадиційними методами.

Як біотехнологічний метод успішно використовують статеві клітини виробників під час штучного запліднення самок у всіх галузях тваринництва.

□ Наприклад, спермою одного бика можна щорічно запліднити від 2 до 50 тис. корів. Багато країнах є банки, де зберігаються мільйони доз замороженої сперми. Від деяких виробників за період використання одержують 300 – 400 тис. доз сперми.

Штучна гормональне регулюваннястатевих циклів самок сприяє синхронізації полювання та дає можливість організувати одночасно штучне осі. великих груптварин. З настанням статевої зрілості у фолікулах яєчників дозрівають яйцеклітини. Вихід їх із фолікула називається овуляцією. У корів і кобил дозріває одночасно зазвичай один фолікул, у овець – 2 – 3, у свиней – 8 – 12 у кожному яєчнику. Від кількості фолікулів, що овулювали, та запліднених яйцеклітин залежить кількість приплоду.

Гормональні засоби здавна використовували підвищення плодючості тварин. Введення гормонів стимулює численну овуляцію (суперовуляцію), або збільшення в 10 - 12 разів кількості яйцеклітин, які утворюються в кожному циклі. У корів та овець кількість їх зростає до 25, у свиней – до 80. Цей метод застосовують для отримання потомства від високопродуктивних особин пересадкою запліднених яйцеклітин самкам-реципієнтам.

Трансплантація ембріонів - це вилучення їх з яйцеводів матки або однієї тварини (самка-донор) та пересадка в яйцевод або матку іншої тварини (самка-реципієнт), яка знаходиться в тій же фазі статевого циклу, що й донор. Надалі ембріон розвивається в організмі реципієнта. Теля-трансплантат успадковує лише генетичні якості батька та матері-донора, реципієнт не впливає на якість приплоду.

Трансплантація ембріонів - прогресивний напрямок прискореного відтворення поголів'я, який дає можливість вирішувати наступні завдання: інтенсивно використовувати генетичний потенціал корів - рекордисток, прискорити створення високопродуктивних сімей і ліній, отримання двійнят пересадкою двох ембріонів одному реципієнту, створення банку ембріонів від видатних тварин способом глибокого їх заморожування кріоконсервації), збереження генетичних ресурсів рідкісних і зникаючих порід, спрощення транспортування живого матеріалу (ембріонів) різні регіониЗемної кулі.

Для отримання ембріонів у виробничих умовах застосовують не - хірургічний метод, тобто вимивання їх із матки за допомогою спеціальних інструментівта поживних середовищ. Вводять ембріони реципієнтам спеціальним катетером через шийку матки. В основному, від одного донора отримують за одне вимивання від трьох до десяти придатних для трансплантації ембріонів. Вимивання проводять 3 - 4 рази на рік, тільність настає у 40 - 50% реципієнтів, тобто поки що реально можна розраховувати на отримання до десяти телят - трансплантатів за рік від одного донора. Для порівняння зазначимо, що від 100 корів за належної організації штучного осі- ння отримують лише 90 – 100 телят. Перевага ембріопересадок очевидна.

Як реципієнти використовують переважно фізіологічно здорових тварин, які не становлять племінної цінності, але відповідають вимогам стандартів щодо розвитку та живої маси.

□ Наприклад, телиці придатні для трансплантації у віці 16 - 18 місяців живою масою 360 - 380 кг при добре виражених ознак статевого полювання. У Останнім часомстанції зі штучного осіменіння тварин Канади, США, Франції, Великобританії,

Німеччини на 70 - 75% комплектують биками-виробниками, отриманими методом трансплантації від видатних молочної продуктивності корів з надоєм 8000 - 10 000 кг молока на рік.

Застосовують також метод мікрохірургічного поділу ембріонів з метою отримання однояйцевих близнюків-двійнят, що дає можливість набагато раціональніше використовувати генофонд видатних виробників та маток. Метод поділу ембріонів на окремі бластоміри з наступною пересадкою їхнім реципієнтам збільшує вихід телят під час трансплантації вдвічі, що значно підвищує її економічну ефективність. Крім того, монозиготні близнюки є цінним матеріалом для вирішення багатьох генетичних та селекційних питань.

Генетична інженерія – нова прикладна гілка молекулярної біологіїта генетики, застосування якої у тваринництві створює реальну основу для виведення бажаних форм тварин із зміненою спадковістю, молекулярною реконструкцією організму. Цього можна досягти планомірною дією на фізіологічні процесивідтворювальної функції за допомогою зоотехнічних та біотехнологічних заходів та оптимально керувати технологією та організацією процесів відтворення поголів'я.

Лекція №2. Біотехнологія тварин

1. Культивування тварин клітин

Визнання ідеї про те, що клітини тканин вищих тварин можна виділити з організму і потім створити умови для зростання та відтворення їх in vitro, датується першим десятиліттям XX століття. Після того як стало відомо, що подібні процеси реальні, настав другий етап робіт, початок якому поклала демонстрація можливості вирощування та репродукції в таких клітинах інфекційних агентів-вірусів, що фільтруються. Третій етап історії починається з часу, коли була показана практична можливість отримання в клітинах тварин великих кількостей вірусного матеріалу для застосування у вакцинних препаратах, і простягається до часу, коли: 1) стало можливим вставити в клітини специфічні екзогенно отримані гени та отримати їх експресію та 2 ) підтверджено можливість вирощування в культурі з одиночної клітини цілої популяції. Коли такі популяції отримували з клітини, що виділяла в навколишнє середовище антитіла, всі молекули антитіл в надосадовій рідині були однаковими. Причини та наслідки цих двох феноменів нині інтенсивно досліджуються і вони знаменують собою початок четвертого етапуробіт у цій галузі.

Щоб показати здатність клітин тварин рости і ділитися в культурі, потрібно було опанувати низку підходів та методик. Особливості їх наведено нижче.

1. Методики отримання клітин, вільних від екзогенних прокаріотів та грибів.

2. Методики розробки середовища, у яких зростання «вирізаних із тканини» чи ізольованих клітин не придушується.

3. Методики спостереження за клітинами у поступовій динаміці розвитку.

4. Методики безперервного культивування культур клітин тварин in vitro та підтримки їх вільними від інших біологічних агентів.

Наукову основу розробки цих методик становить уявлення про клітину як основному структурному елементіживих організмів тваринного та рослинного походження. Ідея про те, що клітини тканин тварин можна виділити з організму і потім створити умови для зростання та відтворення їх in vitro виникла на базі концепції, що належить Клоду Бернару. Він припустив, що не тільки живі організми здатні зберігати сталість внутрішніх умов, незалежно від змін у навколишньому середовищі. Клітина поза організмом тварини теж буде прагнути підтримувати свої внутрішні умови. Якщо відмінності між внутрішніми та зовнішніми умовамибудуть незначними, то висока ймовірність зростання та поділу клітини. Таке розуміння явища призводить до необхідності розробки середовищ, здатних підтримувати та стимулювати зростання клітин поза організмом.

Трохи пізніше, в 1885 році, У. Ру (W. Roux) показав можливість збереження поза організмом живих тканин на практиці. Він зберігав у життєздатному стані оболонку курячого ембріона у теплому фізіологічному розчині. Згодом він став автором, який активно публікувався з проблем ембріології in vitro. Пізніше, в 1897 р., Льоб (Loeb) підтримував у життєздатному стані клітини крові та сполучної тканиниу пробірках із сироваткою та плазмою крові. Льюнгрен (1898) показав можливість підтримки експлантатів шкіри людини у життєздатному стані кислому середовищііз збереженням здатності до реімплантації. Додаткові експерименти були проведені Джоллі (1903), який спостерігав поділ клітини у краплі, що містить лейкоцити саламандри, а Біб і Евінг (1906) підтвердили це при пересадці лімфосаркомної тканини собаки.

Продовжуючи роботи Ру, Росс Харрісон удосконалив методику «висячої краплі». Він використовував невеликі шматочки тканини, відторгнуті від медулярної судини жаби до впроваджених у її лімфатичний тромб, і витримував їх у вигляді краплі на нижній стороні покривного скла, розташованого поверх заглиблення у предметному склі. У 1907 р. йому вдалося спостерігати за допомогою такої «камери» зростання нервових клітинпротягом кількох тижнів; він встановив, що швидкість зростання цих клітин становить 20 мкм за 25 хв. У той час як експерименти Харрісона були спрямовані на те, щоб отримати відповіді на питання, що стосуються фізіології нервових клітин жаби, методика, якою він користувався, була застосована Барроуз для інших клітин тканин теплокровних тварин. Цей дослідник у 1910 р. замість лімфатичного тромбу використав тромб плазми курки.

У 1913 р. Алексіс Каррель застосував плазму крові, збагачену екстрактом ембріона. Додавання такого екстракту прискорювало зростання тканин. Застосована методика забезпечувала значно більшу ймовірність успіху, ніж та, яку використовували Левіс (1911) та Рід (1908). Рід готувала культури клітин з кісткового мозку морської свинки і намагалася вирощувати експлантати на певному середовищі хімічного складу. Робота Кареля залучила велика увага, оскільки вона була опублікована під назвою, що інтригує - культивування «безсмертних» клітин. Інкубація клітин серця курячою ембріона була початку 17 січня 1912 р. Пересів клітин продовжив Еблінг, як він сам заявляв, працюючи з ними 34 роки. Оскільки Каррель був хірургом і дуже обізнаним у питаннях асептики, він зміг зробити істотний внесок у культивування клітин тварин in vitro. У той же час організація та технічні умовипроведених експериментів були дуже громіздкими. Помічники Кареля були одягнені в довгостатеві гумові халати чорного кольору з капюшонами для повного прикриття голови. Процедури були тривалими та обтяженими багатьма деталями. В результаті тих вимог, які висувалися автором щодо складних запобіжних заходів для запобігання контамінації, навколо даного предмета створилася атмосфера таємничості та винятковості, що швидше гальмувало прогрес, ніж сприяло йому. Проте їм було багато досягнуто. Зокрема, навіть за відсутності антибіотиків він досяг успіху в пересадці клітин, використовуючи хірургічну техніку для відторгнення окремих колоній і перенесення їх у нові умови зростання. Карель також продемонстрував своїм колегам наукове значеннятих спостережень, які можуть бути зроблені у процесі пересадки клітин.

У ході виконаних робіт було внесено низку поправок до рецептури середовища культивування. Зокрема, Тірод модифікував розчин Рінгера і на додаток до курячої сироватки та ембріонального екстракту став використовувати коагулят фібрину. Для спостереження за клітинами тварин Канті, що діляться, в 1928 р. розробив метод кінофотомікрографії. У цей період був розроблений додатковий і дуже істотний підхід у техніці роботи з клітинами. Мається на увазі застосування трипсину для вивільнення клітин із тканинної матриці, в якій вони знаходяться. Однак ця методика не знаходила визнання доти, доки в 1937 р. Сіммс і Стидлман використовували її для пасування клітин між культурами плазми. Ця методика дає можливість успішно застосовувати у культурах індивідуальні клітини, а не тканини.

Вперше клони клітин у культурі з одиночної клітини були отримані Ерлом із співробітниками у 1948 році. Голок (1955) систематично досліджував харчові потреби клітин за умов. До тих пір поки в 1961 р. Хейфлік і Мурхед не виділили лінію диплоїдних клітин людини (ПДВ) WI-38, вважалося, що клітинна лінія, що одного разу встановилася, має необмежений час життя. Щодо лінії WI-38 було показано, що період її існування у культурі обмежується приблизно 50 подвоювання популяції. Перед відмиранням популяції клітин цієї лінії характерний феномен старіння. Однак при відмиранні ці клітини залишалися диплоїдними та не мали ознак злоякісних змін. Клітини, виділені з ракових пухлин або трансформовані в ході культивування, характеризуються безсмертністю і корелюють з гетероплоїдністю. Перші суспензійні культури клітин тварин, як правило, ґрунтувалися на клітинах злоякісних тканин. Це – клітини HeLa, виділені з ракової пухлини шийки матки людини. Лінія карциноми шийки матки, що перевивається, була виділена ще в 1952 році Джеєм зі співробітниками, вона використовується і в даний час в багатьох лабораторіях світу.

Наступний етап в історії культивування диплоїдних клітин людини пов'язаний із встановленням факту, що вони є генетично стабільними та вільними від усіх відомих латентних та онкогенних вірусів. Тому лінії диплоїдних клітин людини можна використовувати для отримання продуктів, призначених для людей. Ця догма залишається чинною і в даний час, хоча нові відкриттявиразно показали присутність у клітинах, виділених із нормальних тканин, потенційних онкогенів, ідентичних тем, знайдених у таких відомих онкогенних вірусах, як вірус саркоми Рауса та вірус саркоми Молоні. Раус ще 1910 року індукував пухлину, використавши профільтрований екстракт курячої пухлини. Ця пухлина була індукована РНК-вірусом (вірус саркоми Рауса). Пізніше було встановлено, що ряд вірусів здатний індукувати пухлини, такі віруси були названі онкогенними.

2. Введення у культуру тварин клітин

Системи культивування клітин

Існує дві основні системи культивування клітин.

1. Непроточні культури– тип культур, у якому клітини вводять у фіксований обсяг середовища. У міру зростання клітин відбувається використання поживних речовин та накопичення метаболітів, тому середовище має періодично змінюватися, що призводить до зміни клітинного метаболізму, званого ще й фізіологічним диференціюванням Згодом, внаслідок виснаження середовища відбувається припинення проліферації клітин.

Збільшити тривалість життя непроточних культур можна кількома способами:

· Уривчастий (частина культури замінюється рівним обсягом свіжого середовища);

· Постійний (обсяг культури збільшується з постійною низькою швидкістю, а невеликі порції клітин періодично видаляються);

· Перфузійний (здійснюється постійне надходження свіжого середовища в культуру та одночасне видалення рівного обсягу використаного (безклітинного) середовища).
Перфузія може бути відкритою, коли з системи видаляється все середовище, і закритою, коли середовище, що видаляється, проходить через додаткову посудину, де відновлюється її рН і здійснюється аерування, і повертається в культуральну посудину.

Усі системи непроточних культур характеризуються накопиченням відходів у тій чи іншій формі та мінливістю зовнішніх умов.

2. Проточні культуризабезпечують справжні гомеостатичні умови без зміни концентрації поживних речовин та метаболітів, а також кількості клітин. Гомеостаз обумовлений постійним входженням середовища у культуру та одночасним видаленням рівного обсягу середовища з клітинами. Такі системи придатні для суспензійних культур та моношарових культур на мікроносіях.

Існує 2 великих напрями в культивуванні тварин клітин: моношарові культури та суспензійні культури.

Суспензійні культурикраще з точки зору збільшення виходу клітин.

Моношарові культуритакож мають ряд переваг:
1. Легко провести повну заміну середовища та промити клітини перед додаванням свіжого живильного середовища. Це важливо в тих випадках, коли зростання клітин йде в одних умовах, а напрацювання продукту в інших умовах, наприклад при переносі клітин із середовища із сироваткою в безсироваткове середовище. Також можна повністю видаляти небажані компоненти.
2. Дозволяють забезпечити високу щільністьклітин.
3. Багато клітин експресія необхідного продукту йде ефективніше, якщо клітини прикріплені до субстрату.
4. Моношарові культури можуть бути використані для будь-якого типу клітин, що забезпечує найбільшу гнучкість досліджень.
5. У деяких випадках, наприклад, для поширення вірусів, потрібні тісні міжклітинні контакти.

Недоліками моношарових культур є:

· Вимоги великого простору;

· Зростання вартості та трудомісткості при збільшенні масштабу;

· недостатньо ефективний контрольобумовлений труднощами відбору проби;

· Складності у визначенні та контролюванні рН, концентрації кисню.

Слід зазначити, що застосування мікроносіїв усуває ці недоліки. Існує багато різних різновидів цього способу культивування. Розглянемо три основні напрями:

1. Культивування у плоских флаконах (матрацах).

2. Культивування в бутлях, що обертаються, коли в кожен момент часу 1520% поверхні пляшки покрито живильним середовищем, а клітини знаходяться поперемінно то в середовищі, то в повітрі.

3. Культивування в колонках на мікроносіях, в якості яких виступають щільно упаковані скляні намисто діаметром 35 мм, що не зміщуються, стос пластин і ін., а живильне середовище омиває їх, протікаючи зверху вниз.

3. Клонування тварин

Історія клонування

Американські дослідники С. Стік і Дж. Робл, використовуючи методику МакГрата і Солтера, в 1988 р. отримали 6 живих кроликів, пересадивши ядра 8 клітинних ембріонів однієї породи позбавлені ядра яйцеклітини кроликів іншої породи. Фенотип народжених повністю відповідав фенотипу донора. У цих експериментах лише 6 із 164 реконструйованих яйцеклітин (3,7%) розвинулися у нормальних тварин. Це, звичайно, дуже низький вихід, що практично не дозволяє розраховувати на отримання таким методом клону генетично ідентичних тварин. Цінність цієї роботи тим не менш у тому. що вона показала можливість клонування ембріонів кролів.

Перші успішні експерименти з клонування сільськогосподарських тварин були проведені С. Уілладсіном (S.Willadsen) у 1986 р. Він зливав без'ядерні яйцеклітини з бластомірами, виділеними з 8 та 16-клітинного ембріона вівці.

Дж. Робл та його співробітники в1987 провели роботи з пересадки ядер великої рогатої худоби. Вони пересаджували в зиготи каріопласти - чоловічий і жіночий пронуклеуси разом з навколишньою цитоплазмою, а також ядра 2, 4 або 8-клітинних ембріонів корови. Спочатку зиготи центрифугували, щоб звільнити пронуклеуси від навколишніх гранул жовтка, після чого ядра були добре видно під мікроскопом, що значно полегшувало їх видалення. За допомогою маніпулятора та загостреної скляної мікропіпетки вилучали один з бластомерів разом з ядром із ранніх зародків і переносили його в енуклейовану зиготу.

Реконструйовані зародки були поміщені в агаровий циліндр і пересаджені в перев'язаний яйцевод вівці. Через п'ять днів культивування їх вимивали, звільняли від агару та досліджували. Реконструйовані зародки у цій роботі розвивалися лише у випадках, як у зиготи пересаджували пронуклеуси: 17% таких зародків досягли стадії морули чи бластоцисти. Два зародки були пересаджені другому реципієнту - в матку корови, і їх розвиток завершився народженням живих телят. Якщо як донори використовували ядра 2-, 4- або 8-клітинних зародків, то реконструйовані яйцеклітини не розвивалися навіть до стадії морули.

Пізніше були і більше успішні роботи. С. Віладсін (1989), зокрема. повідомив, що йому вдалося отримати чотирьох генетично ідентичних бичків холстейнської породи внаслідок пересадки в реципієнтні яйцеклітини ядер бластомерів одного 32-клітинного зародка. Автор стверджував, що більшість ядер зберігає тотипотентність на 32-клітинній стадії, а значна частина навіть на 64-клітинній стадії, забезпечуючи нормальний розвиток реконструйованих яйцеклітин до стадії ранньої бластоцисти в яйцеводі вівці. Після пересадки в матку корів - остаточних реципієнтів, як вважає автор, вони можуть і надалі нормально розвиватися.

К. Бондіолі та співавтори (1990), використовуючи як донори ядер 16-64-клітинні зародки корів, трансплантували 463 реконструйованих зародка в матку синхронізованих реципієнтів, і було отримано 92 живих теляти. Сім із них були генетично ідентичні, являючи собою клон, отриманий внаслідок пересадки ядер клітин одного донорського ембріона.

Таким чином, клітинні ядра зародків великої рогатої худоби досить довго зберігають тотипотентність та можуть забезпечити повний розвиток реконструйованих яйцеклітин. Інакше висловлюючись, методичні проблеми клонування зародків великої рогатої худоби фактично вирішені.

Експериментів із клонування свиней небагато. Успішні дослідження провели Р. Пратер зі співробітниками в 1989 р. Убогість даних, мабуть, пов'язана з певними труднощами роботи з цим об'єктом.

у 1993-1995 роках, група дослідників під керівництвом Я. Уїлмута (Ian Wilmut) з Рослінського інституту отримала клон овець - 5 ідентичних тварин, донорами ядер яких була культура ембріональних клітин. Клітинну культуру отримували так: виділяли мікрохірургічно ембріональний диск з 9-денного овечого ембріона (бластоцисти) і культивували клітини in vitro протягом багатьох пасажів (принаймні до 25). Спочатку клітинна культура нагадувала культуру стовбурових недиференційованих ембріональних клітин, але незабаром, після 2-3 пасажів, клітини ставали ущільненими і морфологічно подібними з епітеліальними. Ця лінія клітин із 9-денного зародка вівці була позначена як TNT4.

Щоб донорське ядро і реципієнтна цитоплазма знаходилися на подібних стадіях клітинного циклу, зупиняли поділ клітин TNT4, що культивуються, на певній стадії (G O) і ядра цих клітин пересаджували в енуклейовані яйцеклітини (відповідно на стадії метафази II). Реконструйовані ембріони укладали в агар і трансплантували перев'язані яйцеводи овець. Через 6 днів ембріони вимивали з яйцеводи першого реципієнта та досліджували під мікроскопом. Відбирали ті, що досягли стадії морули чи бластоцисти і пересаджували їх у матку вівці – остаточного реципієнта, де розвиток продовжувався до народження. Народилося 5 ягнят (самок) з них 2 загинули невдовзі після народження, 3-й у віці 10 днів, а 2, що залишилися, нормально розвивалися і досягли 8-9-місячного віку. Фенотипово всі ягнята були подібні до породи овець, від якої отримували вихідну лінію клітин TNT4. Це підтвердив генетичний аналіз.

Ця робота, особливо в частині культури ембріональних клітин, – значне досягнення у клонуванні ссавців, хоча вона й не викликала такого гучного інтересу, як стаття того ж Вілмута із співавторами, опублікована на початку 1997 року, де повідомлялося, що внаслідок використання донорського ядра клітини молочної залози вівці було отримано клональну тварину - вівця на прізвисько Доллі. Остання роботаметодично багато в чому повторює попереднє дослідження 1996 року, але в ній вчені використовували ембріональні та фібробластоподібні клітини плода та клітини молочної залози дорослої вівці. Клітини молочної залози отримували від шестирічної вівці породи фінн дорcет, що знаходиться на останньому триместрі вагітності. Усі три типи клітинних культур мали однакове числохромосом - 54, як завжди у овець. Ембріональні клітини використовували як донори ядер на 7-9-му пасажах культивування, фібробластоподібні клітини плода – на 4-6-му пасажах та клітини молочної залози – на 3-6-му пасажах. Розподіл клітин усіх трьох типів зупиняли на стадії G 0 і ядра клітин пересаджували в енуклейовані ооцити (яйцеклітини) на стадії метафази II. Було використано метод електрозлиття. Більшість реконструйованих ембріонів спочатку культивували в перев'язаному яйцеводі вівці, але деякі й in vitro у хімічно визначеному середовищі. Коефіцієнт виходу морул або бластоцист при культивуванні in vitro в одній серії дослідів був навіть удвічі вищим, ніж при культивуванні в яйцеводі.

Вихід морул або бластоцист у серії дослідів з культурою клітин молочної залози був приблизно втричі меншим, ніж у двох інших серіях, коли як донори ядер використовували культуру фібробластів плода або ембріональних клітин. Число живих ягнят у порівнянні з числом пересаджених в матку остаточного реципієнта морул або бластоцист було також удвічі нижчим. У серії дослідів із клітинами молочної залози з 277 реконструйованих яйцеклітин було отримано лише одне живе ягня, що говорить про дуже низьку результативність такого роду експериментів (0,36%). Аналіз генетичних маркерів всіх семи народжених у трьох серіях експериментів живих дитинчат показав, що клітини молочної залози були донорами ядер для одного, фібробласти плода – для двох та ембріональні клітини – чотирьох ягнят. Вівця на прізвисько Доллі розвинулася з реконструйованої яйцеклітини, донором ядра якої була культивована клітина молочної залози вівці породи фін дорсет і фенотипно не відрізняється від овець цієї породи, але сильно відрізняється від вівці-реципієнта. Аналіз генетичних маркерів підтвердив цей результат.

Успіх авторів цієї роботи перш за все пов'язаний з використанням тривалих клітинних культур, оскільки після багатьох пасажів у культурі клітин могли бути відібрані малодиференційовані стовбурові клітини, які, ймовірно, були використані як донори ядер. Велике значеннятакож мав той факт, що автори, враховуючи результати своїх попередніх робіт, синхронізували стадії клітинного циклу яйцеклітин реципієнтів та клітин донорів

Аналогічні експерименти проводили пізніше Tanja Dominko та співробітники лабораторії Вісконсинського університету, які забезпечили клонування ембріонів із клітин шкіри вух дорослої рогатої худоби. Ембріони, генетично ідентичні корові, яка пожертвувала клітини вуха, були впроваджені в матки корів – рецепієнтів. Спостерігалася поступова загибель ембріонів, тож життєздатних телят не отримали. Причини поки що не встановлено.

У серпні 1997 року з'явилося повідомлення про те, що Алан Троунсон (Австралія) розробив технологію, яка дозволяє сформувати ембріон із 16, 32 або 64 клітин і потім кожна з них може використовуватися для формування 16, 32 або 64 ідентичних ембріонів. Колектив дослідників на чолі з Аланом Троунсоном створив 470 генетично ідентичних ембріонів рогатої худоби від єдиної бластоцисти. Така технологія забезпечує безмежне джерело генетичного матеріалу для клонування.

Незважаючи на відсутність негайних практичних результатів зробленого відкриття, теоретичну значимістьйого важко переоцінити. Вперше було доведено, що гени запрограмовані оборотно. Подальші дослідженняможуть дозволити зрозуміти, як регулюється робота генів, диференціація клітин, чому клітини одних випадках зростають і розмножуються керовано, а інших (при раку) – неконтрольовано.

Вже зараз корпорація Genzyme Transgenics планує дослідження з метою створення трансгенної великої рогатої худоби, яка містить у молоці людський альбумін. Було куплено патент на отримання ембріонів, що містять ген клітин сполучної тканини (фібробластів), що включає ген, відповідальний за синтез людського білка. Декілька корів в даний час вагітні трансгенними телятами. Подібна технологія дозволяє збільшити ефективність створення трансгенних молочних тварин, тому що при звичайному впорскуванні генів у запліднену яйцеклітину народжується лише 5 – 10% трансформованих тварин, з них – кілька самців, які не дають молока. Використання нової технологіїклонування дозволяє отримувати тварини тільки жіночої статі, що дають трансгенний протеїн.

4. Технологія трансплантації ембріонів

Відтворення тварин - це основний фактор, що лімітує ефективність виробництва тваринницьких продуктів на промисловій основі. Причини, що перешкоджають досягненню оптимальних результатів у відтворенні худоби різні. Нові методи розширюють можливості регулювання відтворення. Вони пов'язані з маніпулюванням на рівні клітин або ембріонів з використанням фізіологічно активних з'єднаньтому названі біотехнологічними. До цих методів відносять: стимуляцію і синхронізацію полювання, суперовуляцію, штучне запліднення, трансплантацію ембріонів, зберігання гамет і ембріонів, цілеспрямоване отримання двійнят, регулювання статі, ранню діагностику вагітності, управління процесом пологів, створення химер та ін.

Стимуляція та синхронізація полювання здійснюється за допомогою прогестерону – жіночого статевого гормону стероїдної природи, що регулює перебіг естрального циклу, простагландинів, а також їх комбінації. Цей прийом дозволяє викликати появу полювання у груп племінних тварин в той самий період часу.

У США для синхронізації полювання у телиць у молочному та м'ясному скотарстві випускається новий препарат під назвою “Сінхро-мейт-В”. Він представляє сукупність двох гормонів, один із яких імплантується під шкіру, а інший ін'єктується внутрішньом'язово. Імплант поміщається під шкіру вуха телиці і відразу після цього слідує ін'єкція іншого гормону. Під дією цих двох гормонів естральний цикл телиці переривається та тимчасово зупиняється. Через деякий час імплант видаляють із вуха тварини, починається новий естральний цикл. Так як імплант видаляється одночасно у всіх телиць, то і цикл починається в один і той же час.

Застосування гормональних препаратів знімає необхідність щоденного контролю над станом статевої активності тварин. Перевага синхронізованого полювання полягає в реальної можливостіформування однорідних груп тварин у період запліднення, одночасності народження приплоду, точному обліку кормів у групах.

Суперовуляція

Потенційні можливості відтворення самок ссавців величезні. У їхніх яєчниках містяться десятки та сотні тисяч овоцитів. Однак у процесі онтогенезу лише невелика частина їх реалізується як нащадків. Інші овоцити піддаються атрезії ( зворотному розвитку) та відтворенні не беруть участь.

Суперовуляція – стан, викликаний гормонами, як у яєчниках тварин розвивається і овулює у кілька разів більше яйцеклітин. Залежно від виду число овулюючих яйцеклітин може бути збільшено у 3 – 8 і навіть у 50 разів. За допомогою цього прийому стає можливим отримання більшої кількостіембріонів від найкращих за продуктивністю корів.

Штучне запліднення

Штучне запліднення тварин є найстарішим і добре відпрацьованим біотехнологічним методом розведення сільськогосподарських тварин. Застосування цього методу дозволяє обмежити поширення статевих інфекцій, які нерідко спричиняють безпліддя тварин. Воно також дозволяє ефективно використовувати генетичний потенціал найкращих виробників. Економічний ефект від штучного запліднення обумовлений зниженням витрат на утримання великого поголів'я виробників, можливістю швидкого розмноження генотипу з господарсько- корисними ознаками, Поліпшенням генетичного потенціалу ремонтного стада.

Трансплантація ембріонів

Трансплантація ембріонів в даний час є однією з найбільш актуальних проблему галузі тваринництва. За допомогою пересадки ембріонів можна різко збільшити вихід нащадків від високопродуктивних корів. Трансплантація ембріонів, або ембріотехнологія, полягає в отриманні одного або кількох ембріонів з матки племінних тварин (донорів) та пересадці в матку корів (рецепієнтів), де ембріони розвиваються до отелення. Цей метод у поєднанні із суперовуляцією у донорів дозволяє отримати велике потомство від високопродуктивних тварин. Цим способом ембріони можна впровадити в ту чи іншу породу в інші регіони, використовуючи як рецепієнти корів м'ясних порід. Застосування цього методу також полегшує обмін генофондом сільськогосподарських тварин між країнами та континентами. Пересадка ембріонів може бути використана для отримання потомства від цінних, але безплідних корів, що втратили здатність до розмноження внаслідок нещасного випадку, хвороби або віку.

Коли було встановлено, що кролик має імунітет щодо ящура, була висунута ідея використання методу трансплантації для оздоровлення потомства заражених ящуром тварин. Статеві шляхи кролика, куди трансплантуються ембріони, здатні руйнувати вірус ящуру в ембріонах. Трансплантація може бути використана і для тимчасового зберігання ембріонів. У яйцеводах кролиць вдається здійснювати трансконтинентальне перевезення ембріонів овець.

Вилучення ембріонів до 70-х років проводили в основному хірургічним шляхом, згодом він був замінений менш травматичним і трудомістким нехірургічним, заснованим на введенні в матку особливого зонда природним каналом. Зонд має три канали. Один з каналів призначений для надування балончика, який закупорює ріг матки, перешкоджаючи витіканню рідини. По іншому каналу вводиться фізіологічний розчин з температурою 25-30 про З, який вимиває ембріони і повертається разом із ними через третій канал зонда в пробірку, поміщену водяну баню з температурою 35 про З. З цієї рідини вилучаються ембріони. У середньому за суперовуляції від донора можна отримати від 5 до 7 ембріонів.

Трансплантацію здійснюють за допомогою спеціального зонда або пістолета для запліднення. Ембріони поміщаються у роги матки. Тілесність у самок – рецепієнтів перевіряється за рівнем прогестерону у плазмі крові на 21-й день.

Регулювання статі. У практиці розведення тварин дуже важливо навчитися керувати освітою у потомстві чоловічих та жіночих особин. Метод поділу ембріонів підлогою заснований на визначенні білків, специфічних для самців. Цим метод широко застосовується у тваринницькій практиці багатьох країн. У Канаді вже з 1975 року народжуються телята, розділені за статтю на стадії ембріонів. У перспективі для цілеспрямованого отримання особин чоловічої чи жіночої статі може бути застосований метод мікрохірургічної заміни Х та У хромосом. Такі маніпуляції вже проводились на рослинних клітинахта яйцеклітинах земноводних.