Молекулярна біологія термінів. Історія молекулярної біології
1. Історія вивчення нуклеїнових кислот. Методи молекулярної біології………………3
2. Будова нуклеїнових кислот. Нуклеопротеїди…………………………………………..6
Робота №1. Гідроліз нуклеопротеїдів……………………………………………………..8
Робота №2. Виділення дезоксирибонуклеопротеїдів (ДНП) з тканин………………...10
3. Синтез нуклеотидів. Розподіл нуклеотидів в организме………………………….11
4. Структура та функції ДНК та РНК. Контрольні питання………………………………13
5. Кількісне визначення нуклеїнових кислот………………………………………14
Робота №3. Кількісне визначення нуклеїнових кислот у крові…………….......-
Робота №4. Спектрофотометричне визначення сумарного
Робота №5. Кількісне визначення ДНК колориметричним методом…………16
Робота №6. Кількісне визначення РНК колориметричним методом………….17
Контрольні питання……………………………………………………………………….18
6. Структура геному. Експресія генів. Контрольні питання……………………………19
Література………………………………………………………………………………………20
Історія вивчення нуклеїнових кислот. Методи молекулярної біології.
1. Молекулярна біологія як наука. Виникнення.
2. Завдання молекулярної біології.
3. Основні відкриття молекулярної біології. Основний постулат.
4. Взаємозв'язок молекулярної біології коїться з іншими науками.
5. Виникнення нових наук – геноміки та протеоміки. Створення банків генів.
6. Методи молекулярної біології: - Мікроскопія;
Рентгеноструктурний аналіз;
використання радіоактивних ізотопів;
Ультрацентрифугування;
Хроматографія;
Електрофорез;
Ізоелектрофокусування;
Метод культури клітин;
Безклітинні системи;
Моноклональні антитіла та ін.
____________________________
«Молекулярна біологія вивчає зв'язок структури біологічних макромолекул та основних клітинних компонентів з їх функцією, а також основні принципи та механізми саморегуляції клітин, які опосередковують узгодженість і єдність всіх процесів, що протікають у клітині, що складають сутність життя» - Дж. Вотсон, 1968 р.
Завданнямолекулярної біології:
розшифрування структури геномів;
створення банків генів;
геномна дактилоскопія;
вивчення молекулярних основеволюції, диференціювання, біорізноманіття, розвитку та старіння, канцерогенезу, імунітету та ін;
створення методів діагностики та лікування генетичних хвороб, вірусних захворювань;
створення нових біотехнологій виробництва харчових продуктівта різноманітних біологічно активних сполук (гормонів, антигормонів, релізинг-факторів, енергоносіїв та ін.)
Етапи:
1) Ф. Мішер (F. Miesher) вперше виділив ДНК (1869); О.М. Білозерський
виділив ДНК із рослин.
2) 50-ті роки XX століття – отримані дані про елементарну будову білків та нуклеїнових кислот.
3) 60-ті - 70-ті рр. XX століття – розкрито природу та основні шляхи передачі та реалізації генетичної інформації. Сформульовано основний постулат.
4) 70-ті - 80-ті рр. XX століття – вивчення механізмів сплайсингу, відкриття РНК-ферментів та аутосплайсингу, вивчення механізмів генетичної рекомбінації, починаються роботи з розшифрування структури геномів вищих організмів, виникає білкова інженерія; організація банків генів
5) 90-ті роки. XX ст. – початок XXI ст. – розвиток біоінформатики; визначення нуклеотидних послідовностей (секвенування) ДНК різних організмів: 1995р. - Секвенований перший бактеріальний геном, 1997р. - Геном дріжджів, 1998р. - Геном нематоди, 2000р. - Геном дрозофіли, 2001р. - Майже повністю геном людини.
У середині 60-х років. XX століття остаточно сформовано основний постулат молекулярної генетики, що формулює магістральний шлях реалізації генетичної інформації в клітині: ДНК → РНК → білок
МОЛЕКУЛЯРНА БІОЛОГІЯ МОЛЕКУЛЯРНА БІОЛОГІЯ
вивчає осн. властивості та прояви життя на молекулярному рівні. Найважливішими напрямкамив М. б. є дослідження структурно-функціональної організації генетичного апарату клітин та механізму реалізації спадкової інформації (молекулярна генетика), дослідження мовляв. механізмів взаємодії вірусів з клітинами (молекулярна вірусологія); вивчення закономірностей імунних реакцій організму (молекулярна імунологія); дослідження появи різноякісності клітин у ході індивідуального розвиткуорганізмів та спеціалізації клітин (М. б. розвитку) і т. д. М. б. виділилася з біохімії та сформувалася як самостійна наукау 50-х роках. Народження М. б. часто відносять до 1953 року, коли була опублікована робота Дж. Вотсона і Ф. Крику про просторову структуру молекули ДНК (т.з. подвійний спіралі), причому біол. функція цієї молекули була пов'язана з її хіміч. будовою (ще в 1944 О. Ейвері з співр. встановив, що ДНК є носієм спадщин, інформації). У становленні М. б. відіграли велику роль ідеї та методи класичної генетики, мікробіології, вірусології, використання досягнень точних наук– фізики, хімії, математики, кристалографії, особливо рентгено-структурний аналіз). основ. об'єктами дослідження в М. б. є віруси, в т. ч. бактеріофаги, клітини та субклітинні структури (ядра, мітохондрії, рибосоми, хромосоми, клітинні мембрани), а також макромолекули (білки, нуклеїнові к-ти). Наиб, великі досягнення М. б.- розшифровка структури деяких білків і встановлення зв'язку між їх структурою і функцією (М. Перуц, Дж. Кендрю, Ф. Сенгер, К. Анфінсен та ін), визначення структури і механізму біол. функції нуклеїнових к-т і рибосом (Дж. Вотсон, ф. Крик, Р. Холлі та ін), розшифровка генетич. коду (М. Ніренберг, С. Очоа), відкриття зворотної транскрипції (X. Темін, Д. Балтімор), механізму осн. етапів біосинтезу білкової молекули (Ф. Крик, Ф. Жакоб, Ж. Mono) та нуклеїнових к-т (А. Корнберг, С. Очоа), встановлення структури вірусів та механізмів їх реплікації, розробка методів генетичної інженерії(П. Берг, В. Арбер, Г. О. Сміт, Д. Натан), синтез гена (X. Корану) та ін Рад. вченим належить формулювання принципу матричного синтезу біополімерів (Н. К. Кольцов), формування основ суч. біоенергетики та мехапохімії (В. А. Енгельгардт), доказ існування ДНК у вищих рослин (Н. А. Білозерський), створення вірусогенетич. теорії виникнення раку (Л. А. Зільбер), встановлення послідовності нуклеотидів у транспортної РНК(А. А. Баєв), відкриття та вивчення інформосом (А. С. Спірін) та ін. М. б. має важливе практичне значення у розвитку с. х-ва (спрямоване та контрольоване зміна спадкового апарату тварин і рослин для отримання високопродуктивних порід та сортів), мікробіологічної промисловості (бактеріальний синтез біологічно активних поліпептидів та білків, амінокислот та ін) та як теоретич. основа разл. розділів медицини (вірусологія, імунологія та ін). Перед М. б. стоять завдання вирішення проблем мовляв. основ злоякісного зростання, попередження спадкових захворювань, з'ясування молекулярних основ каталізу, дії гормонів, токсичність. та лікарських речовин, пізнання механізмів пам'яті, природи нервових процесів. Велике значеннянабуває розвитку генної інженерії, що дозволяє цілеспрямовано оперувати генетич. апаратом тваринних організмів. М. б. разом з біохімією, біофізикою, біоорганічною хімією часто поєднують в одне загальний напрям- Фізико-хімічну біологію.
.(Джерело: «Біологічний енциклопедичний словник.» Гл. ред. М. С. Гіляров; Редкол.: А. А. Бабаєв, Г. Г. Вінберг, Г. А. Заварзін та ін. - 2-ге вид. .- М.: Рад. Енциклопедія, 1986.)
молекулярна біологіяРозділ біології, що вивчає структури та процеси, властиві живим організмам, на рівні молекул. Молекулярна біологія прагне пояснити найважливіші явища життєдіяльності (спадковість, мінливість, зростання, розвиток, рух, обмін речовин та енергії, чутливість, імунітет та ін.) будовою, властивостями та взаємодією організмів, що входять до складу хімічних речовин. У будь-якому організмі у кожний момент його існування проходить величезна кількістьбіо хімічних реакцій, в яких беруть участь молекули великі та малі, прості та складні, органічні та неорганічні. Всі ці реакції суворо упорядковані і, залежно від умов та потреб організму, піддаються налаштуванню та регулюванню. Вирішальна роль організації цих процесів належить двом класам великих молекул – білкамі нуклеїновим кислотам. Ці біополімери і є головним об'єктом дослідження в молекулярній біології.
З самого початку молекулярна біологія розвивалася як наукова галузь, споріднена передусім біохімії та біофізики, а також генетики, мікробіології, вірусології. У 30-40-ті роки. 20 ст. для встановлення просторової структуринайважливіших білків стали застосовувати рентгеноструктурний аналіз, який зіграв згодом вирішальну роль й у встановленні будови ДНК. Впровадження у роки у біологію методів та ідей фізики і хімії заклало основи у розвиток «молекулярного» напрями. Багато в чому його майбутні успіхи визначив інтерес фізиків та хіміків до проблеми спадковості. У 1944 р. вийшла книга одного із творців квантової механікиЕ. Шредінгера «Що таке життя? З погляду фізика», що містила короткий викладоснов генетики Багатьма представниками точних наук цю роботу сприйняли як заклик зосередити зусилля на вирішенні загадки «речовини спадковості».
Через 9 років Дж. Вотсон та Ф. Крик вирішили це завдання. На час виходу їх статті (квітень 1953 р.), у якій пропонувалася модель молекули ДНК (т.зв. подвійна спіраль), прийнято відносити народження молекулярної біології. Модель Вотсона-Кріка яскраво виражала головну спрямованістьнової науки: біологічні функціїмакромолекули можна пояснити її структурою (див. Дезоксирибонуклеїнові кислоти). При цьому молекулярний рівень (дволанцюгові ДНК) логічно пов'язувався з субклітинним (реплікація). хромосом), клітинним ( мітоз, мейоз) та організмовим (спадкування ознак).
Близький підхід зустрічався й у ранніх роботах. Ще 1927 р. Н.К. Кільціввисловив гіпотезу про «спадкових молекулах», здатних відтворюватися шляхом матричного синтезу, а В.А. Енгельгардту в 1939 р. вдалося пов'язати будову м'язових білків зі своїми роллю в м'язовому скороченні. Проте лише після «подвійної спіралі» почався бурхливий розвиток молекулярної біології, що стала лідером природознавства. Окрім численних конкретних досягнень (розшифровка генетичного коду
, розкриття механізмів біосинтезу білка, просторової структури ферментів та інших білків, будови та ролі в клітинних процесах біологічних мембран і т.д.), молекулярна біологія виявила деякі загальні принципи, на основі яких здійснюються найрізноманітніші біологічні процеси. Так, комплементарність взаємодіючих молекул (їх взаємодоповнюваність, взаємна відповідність як «ключа та замку»), що призводить до утворення нековалентних хімічних зв'язківміж ними, лежить в основі процесів, що вимагають біологічної специфічності (виборчості, «впізнавання»), починаючи від синтезу ДНК і білків і закінчуючи утворенням комплексів між ферментом та субстратом, антитілом та антигеном, самозбиранням вірусних частинок та цитоскелета. Так само принцип матричного синтезу використовується клітинами не одноразово, а на різних етапахреалізації генетичної інформації.
У квітні 2003 р. вченими всього світу відзначався піввіковий ювілей «подвійної спіралі» та молекулярної біології. У нашій країні фундамент у розвиток цього напрями закладено працями академіків В.А. Енгельгардта (1894-1984), О.М. Білозерського (1905-1972), А.А. Баєва (1903/04-1994).
.(Джерело: «Біологія. Сучасна ілюстрована енциклопедія.» Гол. ред. А. П. Горкін; М.: Росмен, 2006.)
Дивитись що таке "МОЛЕКУЛЯРНА БІОЛОГІЯ" в інших словниках:
Досліджує основні властивості та прояви життя на молекулярному рівні. З'ясовує, яким чином і якою мірою зростання та розвиток організмів, зберігання та передача спадкової інформації, перетворення енергії в живих клітинах та ін. Великий Енциклопедичний словник
Сучасна енциклопедія
МОЛЕКУЛЯРНА БІОЛОГІЯ, біологічне вивченнябудови та функціонування МОЛЕКУЛ, з яких складаються живі організми. До основних сфер вивчення відносяться фізичні та Хімічні властивостібілків і нуклеїнових кислот, таких як ДНК. Див. також… … Науково-технічний енциклопедичний словник
Розділ біол., який досліджує основні властивості та прояви життя на молекулярному рівні. З'ясовує, яким чином і якою мірою зростання та розвиток організмів, зберігання та передача спадкової інформації, перетворення енергії в живих клітинах і… Словник мікробіології
молекулярна біологія- - Тематики біотехнології EN molecular biology ... Довідник технічного перекладача
Молекулярна біологія- МОЛЕКУЛЯРНА БІОЛОГІЯ, досліджує основні властивості та прояви життя на молекулярному рівні. З'ясовує, яким чином і якою мірою зростання та розвиток організмів, зберігання та передача спадкової інформації, перетворення енергії в живих клітинах і… Ілюстрований енциклопедичний словник
Цей термін має й інші значення, див. Молекулярна біологія (журнал). Молекулярна біологія комплекс біологічних наук, що вивчають механізми зберігання, передачі та реалізації генетичної інформації, будову та функції… … Вікіпедія
Наука, що ставить своїм завданням пізнання природи явищ життєдіяльності шляхом вивчення біологічних об'єктів і систем на рівні, що наближається до молекулярного, а в ряді випадків і досягає цієї межі. Кінцевою метоюпри цьому… … Велика Радянська Енциклопедія
Вивчає явища життя на рівні макромолекул (гл. обр. білків та нуклеїнових до т) у безклітинних структурах (рибосоми та ін), у вірусах, а також у клітинах. Мета М. б. встановлення ролі та механізму функціонування цих макромолекул на основі… … Хімічна енциклопедія
Досліджує основні властивості та прояви життя на молекулярному рівні. З'ясовує, яким чином і якою мірою зростання та розвиток організмів, зберігання та передача спадкової інформації, перетворення енергії в живих клітинах та інші явища. Енциклопедичний словник
МОЛЕКУЛЯРНА БІОЛОГІЯ,детальне вивчення живих клітин та їх складових частин(Органел), що простежує роль окремих ідентифікованих сполук у функціонуванні цих структур. До сфери молекулярної біології відноситься дослідження всіх пов'язаних із життям процесів, таких, як харчування та виділення, дихання, секреція, зростання, репродукція, старіння та смерть. Найважливіше досягненнямолекулярної біології – розшифрування генетичного коду та з'ясування механізму використання клітиною інформації, необхідної, наприклад, для синтезу ферментів. Молекулярно-біологічні дослідження сприяють і більш повному розумінню інших процесів життєдіяльності – фотосинтезу, клітинного диханнята м'язової активності.
У молекулярній біології воліють працювати з відносно простими системами, такими як одноклітинні організми(бактерії, деякі водорості), у яких кількість компонентів порівняно невелика, отже, і розрізнити їх легше. Але й при цьому потрібні дуже витончені методи для того, щоб точно локалізувати окремі речовини та відрізнити їх від інших.
На основі фізико-хімічних підходів та інструментарію розроблені складні, чутливі прилади та методи, пристосовані для роботи з органічними сполукамиживих систем. Метод радіоавтографії заснований на включенні до певних речовин радіоактивних атомів, Т.зв. «радіоактивної мітки», яка дозволяє простежити – за випромінюванням, що випускається – хімічні перетворення цих речовин. Під час вивчення низькомолекулярних речовин застосовують методи, дозволяють об'єднати малі молекули речовини у т.зв. макромолекули досить великі для того, щоб їх можна було спостерігати при великому збільшенні трансмісійного електронного мікроскопа. За дифрацією рентгенівських променіввизначають загальну форму макромолекул, як це було зроблено, наприклад, з дезоксирибонуклеїновою кислотою (ДНК). Для поділу суміші речовин, що різняться за розмірами та хімічного складувикористовують відмінності у швидкості їх пересування в електричному полі (метод електрофорезу) або різну швидкість дифузії в розчиннику, що протікає через нерухому фазу, наприклад папір (метод хроматографії).
За допомогою відповідних ферментів можна визначити нуклеотидну послідовність генів, а за нею – амінокислотну послідовність білків, що синтезуються. Якщо у тварин різних видівблизькі нуклеотидні послідовності генів, що кодують загальні для них білки, наприклад гемоглобін, можна зробити висновок, що в минулому ці тварини мали спільного предка. Якщо ж розбіжності у тому генах великі, то ясно, що розбіжність видів від загального предка сталося набагато раніше. Такі молекулярно-біологічні дослідження відкрили новий підхід до вивчення еволюції організмів.
Важливий внесок у медицину має зробити ідентифікація вірусів за їх складом. З її допомогою можна, наприклад, встановити, що вірус, який викликає ту чи іншу хворобу у людини, гніздиться природним чиномв якійсь дикій тварині, від якої і передається людині хвороба. Якщо у тварин, які є в природі резервуаром даного вірусу, симптоми хвороби не виявляються, то, мабуть, тут діє якийсь механізм імунітету, і тоді виникає нове завдання- Вивчити цей механізм, щоб спробувати включити його в імунну системулюдини.
Для кого?Старшокласники, студенти.
Що дає?Знання засад молекулярної біології.
Викладачі.Завідувач лабораторій молекулярної генетики мікроорганізмів Інституту біології гена РАН, професор Університету Ратгерса (США), професор Сколківського інституту науки та технологій (SkolTech).
Коли?Потрібно уточнювати.
Вартість. 9 000 грн.
Умови участі.Потрібно залишити заявку на участь на сайті.
Біологічні кружки. Московський державний університетім. М.В. Ломоносова.
Для кого? 9-11 класи.
Що дає?Знання з біології, навички виконання проектних робіт, навички роботи в лабораторії.
Викладачі.Співробітники біологічного факультету МДУ.
Коли?
Вартість.Потрібно уточнювати.
Умови участі.Потрібно уточнювати.
Біологічне відділення Московської гімназії №1543 на Південному Заході.
Для кого? 7-10 класи.
Що дає?Поглиблені знання біології.
Викладачі.Співробітники МДУ, випускники гімназії.
Коли?Є можливість відстежувати дати початку набору.
Обов'язкові вимогиПотрібно пройти вступні випробування.
Вартість.Безкоштовно (існує добровільний внесок).
Умови участі.Вступ до гімназії на повноцінне навчання.
Школа «Хім Біо Плюс». Російський національний дослідницький медичний університетімені М.І. Пирогова.
Для кого? 10-11 класи.
Що дає?Знання з біології, хімії.
Коли?Набір щорічно, у вересні.
Обов'язкові вимоги. Набір результатів тестування.
Вартість. 10 000 - 75 000 грн. (є пробне заняття).
Академія. "ПостНаука".
Для кого?Школярі, студенти.
Що дає?
- знання в галузі фізики елементарних частинок, хімії, медицини, математики, нейрофізіології, генетики, соціології, комп'ютерних наук;
- знання про те, як наукові розробкизастосовуються у реальному житті.
Викладачі.Висококваліфіковані спеціалісти, вчені.
Коли?Є можливість відстежувати дати набору Вконтактеі Facebook.
Вартість. 9 000 грн.
Умови участі. Необхідно відстежувати потрібний курс. Зареєструватись на курс, оплатити навчання.
Петрозаводськ
STEM-центр Петрозаводського державного університету.
Для кого? 1-11 класи.
Що дає?Навички проектної, науково-дослідної діяльності у галузі програмування, біології, хімії, фізики.
Коли?Є можливість відстежувати дати початку набору.
Вартість.Потрібно уточнювати.
Умови участі.Учні петрозаводських шкіл.
Відкритий університетський ліцей Петрозаводського державного університету.
Для кого? 10 клас.
Що дає?
- технічний напрямок (фізика, математика, інформатика, російська мова);
- медико-біологічне (хімія, біологія, російська).
Коли?Є можливість відстежувати дати початку набору.
Вартість.Потрібно уточнювати.
Умови участі.Громадянство РФ, заява, оплата за навчання.
Майстер-класи
«Будова та функції клітини» – урок у музеї.
Для кого? 14-16 років.
Що дає?
- практичні навички з біології;
- навик роботи з мікроскопом;
- навик проведення експерименту.
Коли?Потрібно уточнювати.
Вартість.Потрібно уточнювати.
Тривалість. 90 хвилин.
Особливі умови відвідин.Останній вівторок місяця – санітарний день.
Як записатись?Залишити заявку на сайті.
"Світ під мікроскопом".
Для кого? 6-16 років.
Що дає?Спостереження мікроорганізмів, будова клітини під мікроскопом.
Коли?Потрібно уточнювати.
Вартість. 200 р.
Тривалість. 1:00.
Особливі умови відвідин.Збірні заняття (для відвідувачів від 6 років) відбуваються у вихідні дні та дні шкільних канікул за розкладом.
Як записатись?Залишити заявку на сайті.
Урок хімії «Найдивовижніша речовина на Землі».
Для кого? 14-16 років.
Що дає?
- знання про властивості води;
- навичка проведення лабораторних експериментів.
Коли?Потрібно уточнювати.
Вартість. 16 000 грн. за здвоєну групу по 15 осіб у кожній.
Тривалість. 90 хвилин.
Табори
Московська область
Табір з хімії «Слон та жираф».
Для кого? 9-11 класи.
Коли?Щороку.
Що дає?
- знання з хімії;
- навички роботи з реактивами.
Примітка: навчальні програмизмінюються кожну зміну, тому необхідно уточнювати їх зміст організаторів.
Викладачі.Висококваліфіковані практикуючі медики різних спеціалізацій, професійні біологи, науковці.
Вартість. 32 000 грн.
Умови участі.Потрібно подати заявку на сайті.
Освітній центр "Сіріус". Напрямок «Наука». Зміни "Хімія", "Біологія".
Для кого? 10-17 років.
Що дає?Поглиблене знання профільних предметів, розширення кругозору та особистісний розвиток.
Викладачі.Вчені, педагоги провідних вузів, фізико-математичних та хіміко-біологічних шкіл, тренери національних та регіональних збірних з математики, фізики, хімії та біології.
Коли?Щороку. Можна відстежувати дати набору.
Обов'язкові вимоги Глибокі знанняпрофільних предметів, рівень всеросійських, міжнародних олімпіад
Вартість.Безкоштовно.
Умови участі.Подати заявку на сайт. Можливий конкурсний відбір. Подробиці необхідно уточнювати в організаторів чи відстежувати на сайті.
ВНЗ
Московський державний університет ім. М.В. Ломоносова.
Біологічний факультет.
Рік створення: 1930.
Що дає?
Кваліфікація:
Російський національний дослідницький медичний університет імені М.І. Пирогова.
Кафедра біохімії та молекулярної біології.
Рік створення: 1963.
Що дає?Готує кваліфікованих спеціалістів.
Кваліфікація:спеціаліст, термін навчання – 6 років.
Новосибірськ
Новосибірський державний університет.
Факультет природничих наук. Біологічне відділення. Кафедра молекулярної біології.
Рік створення: 1959.
Що дає?Готує кваліфікованих спеціалістів.
Кваліфікація:бакалавр, термін навчання – 4 роки, магістр – 2 роки.
Онлайн-курси
Російською мовою
"Реальна математика". Електронна школа "Знаніка".
Для кого? 5-9 класи.
Що дає?Поглиблене знання математики.
Коли?В будь-який час.
Викладачі.Кандидати фізико-математичних, педагогічних наук, доценти, професори та викладачі провідних вузів країни.
Умови участі.Потрібна реєстрація.
Віртуальна хімічна лабораторія Марійський державний технічний університет.
Для кого? 8-11 класи.
Що дає?Навичка роботи в хімічній лабораторії, навичка виконання дослідів у режимі реального часу.
Вартість. 3 500 - 9 000 грн.
Умови участі.Оформити замовлення.
Mark Zentrum. Міжнародний освітній онлайн-центр.
Для кого?З 11 років.
Що дає?Програми навчання з біології, хімії, математики, іноземних мов.
Коли?Індивідуальні заняття узгоджуються із викладачем. Групові заняттяпроходять відповідно до розкладу.
Викладачі.Лінгвісти, які практикують викладачі профільних предметів.
Вартість.Пробний урок – безкоштовно. Індивідуальні заняття: один урок - 450-1200 р., Залежно від кількості занять (мінімум п'ять) і від тривалості уроку. Групові заняття: один урок – 280–640 грн.
Вартість занять з іноземної мови. Пробний урок з носієм мови- Платне: 10 євро. Вартість одного заняття: 15–35 євро залежно від тривалості уроку.
Тривалість.Залежить від форми занять. Індивідуальне заняття – 45–90 хвилин, заняття у групі – 90 хвилин, вебінар – 120 хвилин. Перше пробне заняття – 30–40 хвилин.
Умови участі.Заповнити заявку-анкету на пробний урок.
Особливі умови.Необхідні матеріали та підручники надсилаються викладачем у електронному вигляді(є можливість придбати навчальні матеріалиу друкованому вигляді).
Англійською мовою
лекція. Surprises and Discovery in Catalysis.
Для кого?Школярі, студенти.
Що дає?Знання про останні досягненняв галузі каталізу.
Викладачі. Erick M. Carreira, професор органічної хіміїв університеті Цюріха.
Коли?В будь-який час.
Вартість.Безкоштовно.
Віртулаб з хімії англійською мовою. Є можливість настроїти російську мову.
Для кого?Школярі.
Що дає?Навичка роботи в лабораторії з сотнями реагентів у режимі реального часу.
Коли?В будь-який час.
Вартість.Безкоштовно.
Детективно-хімічний віртулаб. Розслідування злочину за допомогою знання хімії.
Для кого?Школярі, студенти.
Що дає?Навичка застосування знань з хімії в ігровій формі.
Коли?В будь-який час.
Тривалість квесту. 40-50 хвилин.
Вартість.Безкоштовно.
Умови участі.Завантажити програму на комп'ютер.
Я коротко нагадаю так звану центральну догму молекулярної біології, у первісному вигляді сформульовану Френсісом Криком . У загальному випадкувона говорить, що генетична інформація при реалізації передається від нуклеїнових кислот до білка, але не навпаки. А точніше, можлива передача ДНК → ДНК ( реплікація), ДНК → РНК ( транскрипція) та РНК → білок ( трансляція). Також існують значно рідше реалізовані шляху, властиві деяким вірусам: РНК → ДНК ( зворотна транскрипція) та РНК → РНК ( реплікація РНК). Також нагадаю, що білки складаються з амінокислотних залишків, послідовність яких закодована в генетичному коді організму: три нуклеотиди (їх називають кодон, або триплет) кодують одну амінокислоту, причому одну й ту саму амінокислоту може кодувати кілька кодонів.
У другій половині XX століття набули розвитку технології рекомбінантної ДНК(тобто методи маніпуляції ДНК, що дозволяють у різний спосібзмінювати послідовність та склад нуклеотидів у молекулі). Саме на їх основі відбувається розвиток усіх молекулярно-біологічних методів і досі, хоча вони стали значно складнішими, як ідейно, так і технологічно. Саме молекулярна біологія викликала бурхливе зростання кількості біологічної інформації за останні півстоліття.
Я розповім про методи маніпуляції та вивчення ДНК і РНК, зовсім трохи торкнуся білків, оскільки в основному методи, пов'язані з ними, ближче до біохімії, ніж до молекулярної біології (хоча межа між ними останнім часом стала дуже розпливчастою).
Розрізання та зшивання
Ферменти – білки, що прискорюють проходження хімічних реакцій. Вони дуже ефективні: прискорення може становити кілька порядків! Наприклад, фермент каталаза, що розщеплює перекис водню, прискорює реакцію приблизно на 12 порядків, тобто в трильйон разів! У той же час неорганічний каталізатор - дрібнодисперсна платина - прискорює цю реакцію тільки на шість порядків, або в мільйон разів. Однак за це доводиться сплачувати дуже суворі умови роботи більшості з них.
Рестрикційні ендонуклеази
Малюнок 2. Сайти рестрикції. Зверху Sma I, під час роботи якої утворюються «тупі» кінці. Знизу- цільова послідовність рестриктази Eco RI , під час роботи якої утворюються «липкі» кінці.
Одним з перших і найважливіших кроків молекулярної біології стала можливість розрізати молекули ДНК, причому в строго певних місцях. Цей метод був винайдений при вивченні в 1950-1970-х роках такого феномену: деякі види бактерій при додаванні в середовище чужорідної ДНК руйнували її, в той час, як їхня власна ДНК залишалася неушкодженою. Виявилося, що вони для цього використовують ферменти, які пізніше називають рестрикційними нуклеазамиабо рестриктазами. Існує безліч видів рестриктаз: до 2007 року їх було відомо понад 3000 . Важливою властивістюкожного подібного ферменту є його здатність розрізати строго певну - цільову- Послідовність нуклеотидів ДНК (рис. 2). Рестриктази не впливають на власну ДНК клітини, оскільки нуклеотиди в цільових послідовностях модифіковані так, що рестриктаза не може з ними працювати. (Щоправда, іноді, навпаки, вони можуть розрізати тількимодифіковані послідовності - для боротьби з тими, хто модифікує ДНК, захищаючись від вищеописаних рестриктаз.) Через те, що цільові послідовності бувають різної довжини, частота народження їх у молекулах ДНК варіює: чим довше необхідний фрагмент, тим менша ймовірність його появи. Відповідно, фрагменти ДНК, що утворюються при обробці різними рестриктазами, матимуть різну довжину.
Нові ендонуклеази продовжують відкривати і сьогодні. Багато з них досі не клоновані, тобто, не відомі гени, які їх кодують, і як «фермент» використовують якусь очищену фракцію білків, що має потрібну каталітичну активність. Новосибірська компанія СібЕнзим довгий часуспішно змагалася з компанією New England Biolabs - визнаним у всьому світі лідером з постачання рестритаз (тобто пропонувала таке ж чи більше різних рестриктаз, деякі з яких дуже екзотичні). - ред.
За виділення першої рестриктази, вивчення її властивостей та перше застосування для картування хромосом Вернер Арбер ( Werner Arber), Ден Натанс ( Dan Nathans) та Гамільтон Сміт ( Hamilton Smith) у 1978 році отримали Нобелівську премію з фізіології та медицини .
ДНК-лігази
Для створення нових молекул ДНК, зрозуміло, крім розрізання, необхідна ще можливість зшивання двох ланцюгів. Це роблять за допомогою ферментів, званих ДНК-лігазами, які зшивають сахаро-фосфатний кістяк двох ланцюгів ДНК Оскільки за хімічної будовиДНК не відрізняється у різних організмів, можна зшивати ДНК із будь-яких джерел, і клітина не зможе відрізнити отриману молекулу від своєї власної ДНК.
Поділ молекул ДНК: електрофорез у гелі
Часто доводиться мати справу із сумішшю молекул ДНК різної довжини. Наприклад, при обробці хімічно виділеної з організму ДНК рестриктазами вийде суміш фрагментів ДНК, причому їх довжини будуть відрізнятися.
Оскільки будь-яка молекула ДНК у водному розчині негативно заряджена, з'являється можливість розділити суміш фрагментів ДНК різних розмірів за їх довжиною за допомогою електрофорезу, . ДНК поміщають у гель (зазвичай, агарозний для відносно довгих і сильно відрізняються молекул або поліакриламідний для електрофорезу високою роздільною здатністю), який поміщають у постійне електричне поле. Через це молекули ДНК рухатимуться до позитивного електрода ( аноду), причому їх швидкості залежатимуть від довжини молекули: що вона довша, то сильніше їй заважає рухатися гель і, тим нижча швидкість. Після електрофорезу суміші фрагментів різних довжину гелі утворюють смуги, що відповідають фрагментам однієї й тієї ж довжини. За допомогою маркерів (сумішей фрагментів ДНК відомих довжин) можна встановити довжину молекул у зразку (рис. 3).
Візуалізувати результати форезу можна двома способами. Перший, що найчастіше використовується останнім часом - додавання в гель речовин, що флуоресціюють у присутності ДНК (традиційно використовувався досить токсичний бромистий етидій; останнім часом у побут входять більш безпечні речовини). Бромистий етидій світиться помаранчевим світлом при опроміненні ультрафіолетом, причому при зв'язуванні з ДНК інтенсивність світіння зростає на кілька порядків (рис. 4). Інший метод полягає у використанні радіоактивних ізотопів, які необхідно попередньо включити до складу аналізованої ДНК. В цьому випадку на гель зверху кладуть фотопластинку, яка засвічується над смугами ДНК за рахунок радіоактивного випромінювання(Цей метод візуалізації називають авторадіографією).
Малюнок 4. Електрофорез у агарозному геліз використанням бромистого етидія для візуалізації результатів в ультрафіолеті ( ліворуч). Друга ліворуч - маркер з відомими довжинами фрагментів. Праворуч- Установка для проведення електрофорезу у гелі.
Крім «звичайного» електрофорезу у пластині з гелю, у деяких випадках використовують капілярний електрофорез, який проводять у дуже тонкій трубочці, наповненій гелем (зазвичай поліакриламідним). Роздільна здатність такого електрофорезу значно вища: з його допомогою можна розділяти молекули ДНК, що відрізняються за довжиною всього на один нуклеотид. Про один з важливих програм такого методу читайте нижче в описі методу секвенування ДНК по Сенгеру.
Виявлення певної послідовності ДНК у суміші. Саузерн Блоттінг
За допомогою електрофорезу можна дізнатися розмір молекул ДНК у розчині, проте він нічого не скаже про послідовність нуклеотидів у них. За допомогою гібридизації ДНКможна зрозуміти, яка зі смуг містить фрагмент з суворо визначеноюпослідовністю. Гібридизація ДНК заснована на утворенні водневих зв'язків між двома ланцюгами ДНК, що призводить до їх з'єднання.
Спочатку необхідно синтезувати ДНК-зондкомплементарний тій послідовності, яку ми шукаємо. Він зазвичай є одноланцюговою молекулою ДНК довжиною 10-1000 нуклеотидів. Через комплементарність зонд зв'яжеться з необхідною послідовністю, а за рахунок флуоресцентної мітки або радіоізотопів, вбудованих у зонд, результати можна побачити.
Для цього використовують процедуру, яка називається Саузерн-Блоттінгабо перенесення по Саузерну, названу на ім'я вченого, її винайшов ( Edwin Southern). Спочатку суміш фрагментів ДНК поділяють за допомогою електрофорезу. На гель зверху кладуть лист нітроцелюлози або нейлону, і розділені фрагменти ДНК переносяться на нього за рахунок блоту: гель лежить на губці у ванночці з розчином лугу, який просочується через гель і нітроцелюлозу за рахунок капілярного ефекту від паперових рушників, складених зверху. Під час просочування луг викликає денатурацію ДНК і на поверхню пластини нітроцелюлози переносяться і закріплюються там вже одноланцюгові фрагменти. Лист нітроцелюлози акуратно знімають з гелю та обробляють радіоактивно міченою ДНК-пробою, специфічною до необхідної послідовності ДНК. Лист нітроцелюлози ретельно відмивають, щоб на ньому залишилися ті молекули проби, які гібридизувалися з ДНК на нітроцелюлозі. Після авторадіографії ДНК, з якою гібридизувався зонд, буде видно як смуги на фотопластинці (рис. 5).
Адаптація цієї методики для визначення специфічних послідовностей РНК називається, на противагу Саузерн-блот, норзерн-блот (northern blotting: southernанглійською означає «південний», а northern- "Північний"). У цьому випадку проводять електрофорез у гелі з молекулами мРНК, а як зонд вибирають одноланцюгову молекулу ДНК або РНК.
Клонування ДНК
Ми вже знаємо, як можна розрізати геном на частини (а їх зшивати з довільними молекулами ДНК), розділяти отримані фрагменти по довжині і за допомогою гібридизації вибрати необхідний. Тепер настав час дізнатися, як, скомбінувавши ці методи, ми можемо клонувати ділянку геному (наприклад, певний ген). У геномі будь-який ген займає вкрай маленьку довжину (проти всієї ДНК клітини). Клонування ДНКбуквально означає створення великої кількостікопій певного її фрагмента. Саме за рахунок цієї ампліфікаціїми отримуємо можливість виділити ділянку ДНК і отримати її в достатній для вивчення кількості.
Яким чином розділити фрагменти ДНК за довжиною та ідентифікувати потрібний – було розказано вище. Тепер треба зрозуміти, як можна копіювати необхідний нам фрагмент. Існує два основних методи: використання організмів, що швидко діляться (зазвичай бактерій Escherichia coli - кишкової палички- або дріжджів Saccharomyces serevisiae) або зробити аналогічний процес, але in vitroза допомогою полімеразної ланцюгової реакції.
Реплікація у бактеріях
Оскільки при кожному клітинному розподілі бактерії (як і будь-які інші клітини, не рахуючи попередників статевих клітин) подвоюють свою ДНК, це можна використовувати для множення кількості необхідної намДНК. Для того, щоб впровадити наш фрагмент ДНК у бактерію, необхідно «вшити» його в спеціальний вектор, як який зазвичай використовують бактеріальну плазміду(невелику - щодо бактеріальної хромосоми - кільцеву молекулу ДНК, що реплікується окремо від хромосоми). У бактерій «дикого типу» часто зустрічаються подібні структури: вони часто переносяться «горизонтально» між різними штамами чи навіть видами бактерій. Найчастіше в них містяться гени стійкості до антибіотиків (саме через цю властивість їх і відкрили) або бактеріофагам, а також гени, що дозволяють клітині використовувати більш різноманітний субстрат. (Іноді ж вони «егоїстичні» і не несуть жодних функцій.) Саме такі плазміди зазвичай використовують у молекулярно-генетичних дослідженнях. У плазмідах обов'язково міститься точка початку реплікації (послідовність, з якої починається реплікація молекули), цільова послідовність рестриктази та ген, що дозволяє відібрати ті клітини, які мають цю плазміду (зазвичай, це гени стійкості до якогось антибіотика). У деяких випадках (наприклад, при вивченні великих фрагментів ДНК) використовують не плазміду, а штучну бактеріальну хромосому.
У плазміду за допомогою рестриктаз та лігаз вбудовують необхідний фрагмент ДНК, після чого додають її в культуру бактерій при спеціальних умовах, що забезпечують трансформацію- процес активного захоплення бактерією ДНК з зовнішнього середовища(Рис. 6). Після цього проводять відбір бактерій, трансформація яких пройшла успішно, додаючи відповідний гену в плазміді антибіотик: живими залишаються тільки клітини, що несуть ген стійкості (а, отже, і плазміду). Далі, після зростання культури клітин, з неї виділяють плазміди, а з них за допомогою рестриктазу виділяють «наш» фрагмент ДНК (або використовую плазміду цілком). Якщо ж ген вставили в плазміду для того, щоб отримати його білковий продукт, необхідно забезпечити культурі умови для зростання, а потім просто виділити потрібний білок.
На цьому місці відразу має виникати питання: як же все це можна було використовувати до того, коли були розшифровані геноми, та й читання послідовності ДНК було ще дорогим і малопоширеним? Припустимо, за допомогою рестрикції та клонування отриманих фрагментів ми отримаємо бібліотеку ДНКтобто набір бактерій, що несуть різні плазміди, що містять сумарно весь геном (або помітну його частину). Але як ми зможемо зрозуміти, у якому з фрагментів міститься необхідний ген? Для цього використали метод гібридизації. Спочатку потрібно було виділити білок необхідного гена. Після чого відсеквенувати його фрагмент, звернути генетичний код і отримати послідовність нуклеотидів (звісно, через виродженість генетичного коду доводилося пробувати багато різних варіантів). Відповідно до неї хімічно синтезували коротку молекулу ДНК, яку й використовували як зонд для гібридизації.
Але в деяких випадках цей метод давав збої – наприклад, так сталося з фактором згортання крові VIII. Цей білок бере участь у згортанні крові, і порушення в його функціональності є причиною одного з найпоширеніших генетичних захворювань - гемофілії А. Раніше для лікування доводилося виділяти цей білок з великої кількості організмів, тому що не вдавалося клонувати його для виробництва бактеріями. Пов'язано це було з тим, що його довжина становить близько 180 000 пар нуклеотидів, і він містить багато інтронів (некодуючих фрагментів між кодуючими) - не дивно, що в жодну плазміду цей ген не потрапив повністю.
Про механізми згортання крові див. Як працює згортання крові? ». – Ред.
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)
Метод заснований на багаторазовому виборчому копіюванні певної ділянкиДНК за допомогою ферментів у штучних умовах. При цьому відбувається копіювання тільки тієї ділянки ДНК, яка задовольняє заданим умовам, і тільки в тому випадку, якщо вона присутня в досліджуваному зразку. На відміну від реплікації ДНК у клітинах живих організмів, за допомогою ПЛР ампліфікують порівняно короткі ділянки ДНК (зазвичай не більше 3000 пар нуклеотидів, проте є методи, що дозволяють «піднімати» до 20 тисяч пар нуклеотидів - так званий Long Range PCR).
Фактично ПЛР є штучною багаторазовою реплікацією фрагмента ДНК (рис. 7). ДНК-полімерази так влаштовані, що не можуть синтезувати нову ДНК, просто маючи в наявності матрицю та мономери. Для цього необхідна ще й затравка ( праймер), З якого вони починають синтез. Праймер – це короткий одноланцюговий фрагмент нуклеїнової кислоти, комплементарний ДНК-матриці. При реплікації у клітині такі праймери синтезуються спеціальним ферментом праймазоюта є молекулами РНК, які пізніше замінюються на ДНК. Однак у ПЛР використовують штучно синтезовані молекули ДНК, оскільки в цьому випадку не потрібна стадія видалення РНК та синтезу на їх місці ДНК. У ПЛР праймери обмежують ділянку, що ампліфікується, з обох сторін.
Рисунок 7. Реплікація ДНК- найважливіший для живих організмів процес, основа множини молекулярно-біологічних методів. Оскільки кожен ланцюг ДНК містить послідовність нуклеотидів, комплементарну іншого ланцюга (їх інформаційний зміст однаково), при подвоєнні ДНК ланцюга розходяться, а потім кожен ланцюг служить матрицею, на якій вибудовується комплементарна їй нова ланцюг ДНК. В результаті утворюються два дуплекси ДНК, кожен з яких є точною (без урахування помилок синтезу) копією початкової молекули.
Отже, настав час пояснити, як же ПЛР працює. Спочатку в реакційній суміші знаходяться: ДНК-матриця, праймери, ДНК-полімераза, вільні нуклеозиди (майбутні «літери» у новосинтезованій ДНК), а також деякі інші речовини, що покращують роботу полімерази (їх додають у спеціальні буфери, що використовуються в реакції).
Щоб синтезувати ДНК, комплементарну матриці, необхідно, щоб один із праймерів утворив із нею водневі зв'язки (як кажуть, «відпалився» на ній). Але ж матриця вже утворює їх із другим ланцюгом! Отже, спочатку необхідно розплавити ДНК, тобто зруйнувати водневі зв'язки. Роблять це за допомогою простого нагрівання (до ≈95 °С) – стадія, звана денатурацією. Але тепер і праймери через високу температуру не можуть відпалитися на матриці! Тоді температуру знижують (50-65 ° С), праймери відпалюються, після чого температуру трохи піднімають (до оптимуму роботи полімерази, як правило, близько 72 ° С). І тоді полімераза починає синтезувати комплементарні матриці ланцюга ДНК – це називають елонгацією(Рис. 8). Після такого циклу кількість копій необхідних фрагментів подвоїлася. Однак, ніщо не заважає повторити це ще раз. І не один, а кілька десятків разів! І з кожним повтором кількість копій нашого фрагмента ДНК подвоюватиметься, адже новосинтезовані молекули теж служитимуть матрицями (рис. 9)! (Насправді ефективність ПЛР рідко настільки висока, що кількість копій саме подвоюється, але в ідеалі це так, та й реальні числачасто бувають близькі до цього.)
Малюнок 9. З кожним циклом ПЛР кількість цільової ДНК подвоюється.
Побачити результати ПЛР дуже просто: достатньо провести електрофорез реакційної суміші після ПЛР, і буде видно яскраву смугу з отриманими копіями.
Раніше полімеразу, що інактивується при нагріванні з кожним циклом, доводилося весь час додавати, але незабаром було запропоновано використовувати термостабільну полімеразу з термофільних бактерій, яка витримує такий нагрівання, що спростило проведення ПЛР (найчастіше використовують Taq-полімеразу з бактерії. Thermus aquaticus ).
Щоб уникнути сильного випаровування води з реакційної суміші, до неї додають масло, що покриває її зверху, і/або використовують кришку, що нагрівається. термоциклери- Приладу, в якому проводять ПЛР. Він швидко змінює температуру пробірок і їх не доводиться постійно перекладати з одного термостата в інший. Для запобігання неспецифічному синтезу ще до нагрівання і власне початку циклів, часто використовую ПЛР з «гарячим стартом»: вся ДНК і полімераза розділяються між собою парафіновим прошарком, який плавиться при високій температурі і дає їм взаємодіяти вже в правильних умовах. Іноді використовують модифіковані полімерази, які не працюють при низькій температурі.
Можна ще багато говорити про різні тонкощі ПЛР, але найважливіше сказати про альтернативні класичному форез методи визначення результатів. Наприклад, досить очевидним варіантом є додавання в реакційну пробірку перед початком реакції речовин, що флуоресціюють у присутності ДНК. Тоді, порівнявши початкову флуоресценцію з кінцевою, можна побачити, чи синтезувалася значна кількість ДНК чи ні. Але цей спосіб не специфічний: ми ніяк не зможемо визначити, чи синтезувався необхіднийфрагмент або це якісь праймери злиплися і добудувалися до непередбачуваних послідовностей.
Найбільш цікавим варіантомє ПЛР «в реальному часі» («real-time PCR»). Існує кілька реалізацій цього методу, але ідея скрізь одна й та сама: можна прямо в ході реакції спостерігати за накопиченням продуктів ПЛР (за флуоресценцією). Відповідно, для проведення ПЛР «в реальному часі» потрібен спеціальний прилад, здатний збуджувати та зчитувати флуоресценцію у кожній пробірці. Найпростіше рішення - додати у пробірку ті самі речовини, які флуоресцируют у присутності ДНК, проте мінуси такого методу вже були описані вище.
Строго це називається "ПЛР з реєстрацією флуоресценції в режимі реального часу" або "кількісна ПЛР". – Ред.
Рисунок 11. Приклад кривих накопичення флуоресценції у ПЛР «в реальному часі»:залежність інтенсивності флуоресценції (у кількох пробірках - на кожну свою криву) від номера циклу.
Найпопулярнішою реалізацією такого підходу є метод вищеплення флуорофору за рахунок руйнування зонда (TaqMan Assay; рис. 10). У цьому випадку в реакційній суміші повинен бути присутнім ще один компонент - спеціальний одноланцюжковий ДНК-зонд: молекула ДНК, комплементарна послідовності фрагмента, що ампліфікується, розташованої міжпраймерів. При цьому до одного його кінця повинен бути хімічно прироблений флуорофор(флуоресцентна молекула), а до іншого - гасник (молекула, що поглинає енергію флуорофору і «гасить» флуоресценцію). Коли такий зонд знаходиться в розчині або комплементарно пов'язаний з цільовою послідовністю, флуорофор і гасник знаходяться недалеко один від одного, і флуоресценції не спостерігається. Однак за рахунок 3'-екзонуклеазної активності, якою володіє Taq-полімераза (тобто вона розщеплює ДНК, на яку «натикається» в ході синтезу, і на її місці синтезує новий), зонд при синтезі другого ланцюга руйнується, флуорофор і гасник за рахунок дифузії віддаляються одна від одної, і з'являється флуоресценція.
Оскільки кількість копій під час ПЛР зростає експоненційно, так само зростає і флуоресценція. Однак це триває недовго, оскільки в якийсь момент ефективність реакції починає падати через поступову інактивацію полімерази, нестачу якихось компонентів тощо (рис. 11). Аналізуючи графіки зростання флуоресценції, можна багато зрозуміти про протікання ПЛР, але найважливіше, можна дізнатися, скільки ДНК-матриць було спочатку: це так звана кількісна ПЛР(quantitative PCR, qPCR).
Усі варіанти застосування ПЛР у науці неможливо перерахувати. Виділення фрагмента ДНК, секвенування, мутагенез... ПЛР - один із найбільш затребуваних для ненаукових цілей метод (відео 1). Він широко застосовується в медицині для ранньої діагностики спадкових та інфекційних захворювань, визначення батьківства, у розслідуваннях для встановлення особистості та для багато іншого.
Природні клітинні процеси in vitro
Усі основні молекулярно-біологічні процеси можуть бути легко проведені in vitro(тобто у пробірці). Приклад наведено вище: ПЛР – це аналог реплікації ДНК. Для цього досить просто змішати необхідні реагенти у відповідних умовах: для транскрипції потрібні ДНК-матриця, РНК-полімераза та рибонуклеотиди, для трансляції – мРНК, субодиниці рибосом та амінокислоти, для зворотної транскрипції – РНК-матриця, зворотна транскриптаза(Вона ж ревертаза) та дезоксирибонуклеотиди. Ці методи широко застосовуються в різних областяхбіології, коли потрібно, наприклад, отримати чисту РНК певного гена. У цьому випадку потрібно спочатку провести зворотну транскрипцію його (гена) мРНК за допомогою ПЛР ампліфікувати її, а потім за допомогою in vitro-транскрипції отримати багато мРНК. Перша стадія необхідна через те, що перед утворенням зрілої мРНК у клітині проходить сплайсингі процесингРНК (у еукаріотів; у бактерій у цьому сенсі все простіше) - підготовка до роботи матрицею для синтезу білка. Іноді цього вдається уникнути, якщо вся послідовність гена, що кодує, розташована в одному екзоні.
Секвенування ДНК
Можна сказати, найважливіші методиманіпуляції із ДНК вже описані. Наступний етап - визначення власне нуклеотидної послідовності ланцюга в молекулі - секвенування. Визначення нуклеотидної послідовності ДНК вкрай важливе для безлічі фундаментальних і прикладних завдань. Особливе місцевоно займає в науці: для аналізу результатів секвенування геномів було фактично створено нова наука - біоінформатика. Секвенування зараз користуються молекулярні біологи, генетики, біохіміки, мікробіологи, ботаніки і зоологи, і, звичайно ж, еволюціоністи: практично вся сучасна систематика заснована на його результатах. Секвенування широко застосовується в медицині як метод пошуку спадкових захворювань та вивчення інфекцій. (Див., наприклад, « Уточнення „родоводу“ членистоногих» та « Ск вірний анекдот: негр, китаєць і Крейг Вентер. ». – Ред.)
Насправді хронологічно методи винаходилися зовсім інакше. Наприклад, секвенування за Сенгером було розроблено 1977 року, а ПЛР, як говорилося вище, лише 1983-го.
Існує безліч різних методиксеквенування, але всі методи можна розділити на дві категорії: «класичні» та нового покоління. Зараз використовується фактично лише один «класичний» метод – секвенування за Сенгером, або метод термінаторів. Порівняно з новими методами, він має важлива перевага: довжина прочитання, тобто кількість нуклеотидів у послідовності, яку можна отримати за один раз, у нього вище – до 1000 нуклеотидів. У той самий час у «хорошого» у плані «нового» методу секвенирования - 454-, чи пиросеквенирования - цей параметр вбирається у 500 нуклеотидів . Саме довжина прочитання обмежує можливості нових методів: виявляється вкрай складно зібрати цілий геном із фрагментів розміром у кілька десятків нуклеотидів. Як мінімум, для цього потрібні суперкомп'ютери, а деякі місця в геномі дозволити виявляється просто неможливо, якщо вони містять послідовності, що високоповторюються. У такому разі може допомогти порівняння отриманих фрагментів з вже наявним цілим геномом, але таким чином неможливо прочитати геном організму вперше ( de novo). (Див. також: " Код життя: прочитати не означає зрозуміти ». – Ред.)
Англійський біохімік та корифей молекулярної біології, двічі лауреат Нобелівської премії з хімії: за визначення амінокислотної послідовності інсуліну (1955 р.) та за розробку методу секвенування ДНК (1980 р.). – Ред.
Є метод нового покоління, що дозволяє читати кілька тисяч понеділка, але з великими помилками(Pacific Biosciences). 454/Roche сьогодні можуть читати і більше 500 пн; те саме вже може і молоде «напівпровідникове секвенування». – Ред.
Обидва згадані вище методи секвенування вже досить докладно описані на «біомолекулі»: дуже раджу ознайомитися. Я ж для прикладу розповім про інший поширений швидкий та дешевий метод (з розрахунку на один прочитаний нуклеотид) – метод, реалізований у секвенаторах Illumina (відео 2). Основний його недолік - читання фрагментів дуже короткої довжини, не більше 100 нуклеотидів, і складність прочитання геном «з нуля», що випливає звідси.
У цьому вся методі можна назвати три стадії: підготовку бібліотеки фрагментів (1), створення кластерів (2) і власне секвенування (3).
Відео 2. В інтернеті є кілька хороших відео, на яких описано процес секвенування Illumina, наприклад, на офіційному сайті компанії (вкладка Technology). Щоправда, вони усі англійською мовою.
Було вже багато сказано про методи роботи з нуклеїновими кислотамита їх вивчення. Настав час дізнатися, яким чином можна з'ясувати, як клітина працює - зокрема, спробувати визначити функцію гена і білка, який він кодує.
In vitro-мутагенез
Для вивчення функції білка дуже важливо навчитися вносити до нього мутації. Наприклад, маючи організм із непрацюючим ферментом, можна з біохімічних відмінностей зрозуміти, що робить нормальний білок. Існують різні способи створити повністю непрацюючий ген (як довільний з усього геному, так і конкретний - тоді це називається нокаутомцього гена). Один із таких способів – вставка якогось фрагмента ДНК у геном: якщо ця вставка припаде на ген, то він (точніше, швидше за все, білок, який він кодує) перестане нормально функціонувати.
Однак існують способи дуже точної зміни послідовності гена та, відповідно, білка. Про один із таких методів - сайт-специфічний мутагенез- я й розповім. Суть його полягає у зміні конкретного (зазвичай одного) нуклеотиду у послідовності. Для його використання спочатку необхідно клонувати цей ген у плазміді. Після цього потрібно провести ПЛР з одним праймером. Причому цей праймер повинен включати послідовність, яку ми хочемо змінити - вже в потрібному нам вигляді. Наприклад, на рис. 14 замість літери А, яка повинна була б стояти навпроти Т у батьківському ланцюзі, в праймері стоїть Ц. Після синтезу другого ланцюга ДНК плазміди, що містить праймер, в неї буде внесена мутація - А заміниться на Ц. Такі плазміди вводяться в клітини, в яких при розподілі два ланцюги опиняться у різних дочірніх клітинах. Таким чином, у половині клітин-нащадків буде початковий варіант плазміди, а в половині – мутантний. Тоді, відповідно, половина клітин вироблятиме нормальний білок, що кодується цим геном, а половина - мутантний. У випадку, зображеному на рис. 14, в ньому замість однієї амінокислоти (аспарагіна) стоятиме інша (аланін). За аналогією можна вносити випадкові мутації за допомогою спеціальної ДНК-полімерази, що вносить підвищену кількість помилок.
Малюнок 14. Схема проведення сайт-специфічного мутагенезу.C. elegans, - Тобто, про відключення гена у всіх (майже) клітинах цього хробака.
Такий вражаючий ефектдосягається за допомогою введення в клітину дволанцюгових молекул РНК (дцРНК), один з ланцюгів у кожному з яких комплементарна ділянці мРНК гена, що «виключається». Це відкриває разючі можливості вивчення функцій генів. Раніше для відключення генів доводилося створювати «нокаутних» тварин (що вчені все одно змушені робити, наприклад, з мишами – див. « Нобелівську премію з фізіології та медицини вручили за технологію нокаутування мишей ». – Ред.), у яких вивчається ген в принципівідсутня у геномі. Проте створення нокаутів досить складно, а включити ген у таких організмів вже неможливо. За допомогою РНК-інтерференції відключити ген дуже легко - так само, як і включити, переставши водити в організм відповідні дцРНК.
Існує три основні способи введення дцРНК в організм. Найочевидніший - упорскування в тварину їхнього розчину. Користуються також «вимочування» нематод у розчині РНК. Однак виявилося, що можна робити все набагато простіше: згодовувати ці молекули нематодам! Причому особливо зручно те, що це чудово працює, якщо нематод годувати бактеріями ( E. coli), що синтезують ці дцРНК (рис. 15) .
Рисунок 15. Системна РНК-інтерференція.Черв'як C. elegansекспресує зелений флуоресцентний (світиться) білок у клітинах глотки (ph) та м'язах стінки тіла (bm). ліворуч- Початковий зовнішній вигляд. Праворуч- при РНК-інтерференції за допомогою "підживлення" бактеріями ген інактивується.
У принципі те, що молекули РНК з кишківника поширюються практично по всіх тканинах, досить дивно. Відомо, що за влучення молекул РНК у клітини кишечника відповідає білковий канал. sid-1, . Однак яким чином РНК поширюються по організму хробака, достовірно не відомо, - швидше за все, за участю білка RSD-8Цікаво, що всі відомі білки, що беруть участь у системній РНК-інтерференції у C. elegans, є і в людини, але таку ефективну системуштучного придушення активності генів на системному рівніу людини спостерігати не вдається. Якби була можливість використовувати системну РНК-інтерференцію у людини, це могло стати методом боротьби з величезним набором захворювань, від застуди до раку.
До речі, використання РНК-інтерференції саме на культурі клітин людини дозволило виявити, що багато генів людини сприяютьрозвитку вірусу грипу: « Молекулярне дворушництво: гени людини працюють на вірус грипу ». - ред.
Вивчення експресії генів: ДНК-мікрочіпи
При вивченні функції гена дуже важливо дізнатися, коли і в яких тканинах організму він працює (експресується), а також разом із іншими генами. Якщо потрібно дізнатися це про невелику кількість генів і тканин, то це можна зробити дуже просто: виділити РНК з тканини, провести зворотну транскрипцію (тобто, синтезувати кДНК - комплементарну ДНК) і потім, провести кількісну ПЛР. Залежно від того, чи пройшла ПЛР, ми дізнаємося, чи є мРНК досліджуваного гена тканини.
Однак якщо необхідно зробити те ж саме для багатьох тканин і багатьох генів, то ця методика стає дуже довгою і витратною. У такому разі використовують ДНК-мікрочіпи. Це невеликі пластинки, на які нанесені та прикріплені молекули ДНК, комплементарні РНК генів, що досліджуються, причому заздалегідь відомо, де на них (пластинках) яка молекула розташована. Одним із способів створення чіпа є синтез молекул ДНК прямо на ньому за допомогою робота.
Щоб вивчати експресію генів за допомогою чіпів, необхідно також синтезувати їх кДНК та позначити її флуоресцентним барвником (не поділяючи кДНК різних генів). Таку суміш наносять на мікрочіп, домагаючись, щоб кДНК гібридизували з молекулами ДНК на чіпі. Після цього дивляться де спостерігається флуоресценція і порівнюють це з розташуванням молекул ДНК на чіпі. Якщо місце флуоресценції збігається зі становищем молекули ДНК, то в даній тканині цей ген експресовано. Крім того, помітивши кДНК з різних тканин різними барвниками, можна вивчати експресію відразу кількох (зазвичай все-таки не більше 2) тканин на одному чіпі: за кольором флуоресценції можна визначити, в якій із тканин він експресований (якщо відразу в кількох – вийде змішаний) колір) (рис. 16).
Однак останнім часом все частіше замість чіпів використовують масове секвенування всієї кДНК із тканини (створення так званих транскриптомів), що дуже спростилося через розвиток методів секвенування. Це виявляється дешевшим і ефективнішим, оскільки знання повних послідовностей усіх мРНК дає більше інформації, ніж просто сам факт їхньої наявності чи відсутності.
Ми розглянули основні методи молекулярної біології. Сподіваюся, що вам стало трохи зрозуміліше, як робляться молекулярно-біологічні дослідження, за що дають Нобелівські премії, і як вони можуть допомогти в деяких прикладних задачах. Але, найбільше, я сподіваюся, що ви теж побачили красу ідей, що лежать у їх основі, і, можливо, вам захотілося дізнатися про якісь із цих методик докладніше.
Література
- Нобелівські лауреати: Дж. Вотсон, Ф. Крик, М. Вілкінс; Вікіпедія: 454-секвенування (високопродуктивне піросеквенування ДНК). Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 71 , 95-100.
